吳 歡，唐卯星，陶欣怡，占 翔，仇靜文，高 波，李慶林,3

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，合肥 230038；2四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院，成都 610065；3新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230038；4安徽華潤(rùn)金蟾藥業(yè)股份有限公司，淮北 235000

華蟾素為中華大蟾蜍(BufogargarizansCantor)或黑眶蟾蜍(BufomelanostictusSchneider)干燥表皮(蟾皮)的水煎煮提取物，主要成分有蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類(lèi)、吲哚生物堿類(lèi)及多肽類(lèi)等[1-4]。華蟾素注射液是華蟾素的滅菌水溶性制劑，抗瘤譜廣，臨床主治中晚期肝癌、肺癌、胰腺癌等病癥[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明華蟾素抑瘤效應(yīng)可能與其調(diào)控Caspase-10介導(dǎo)的死亡受體通路、P38MAPK信號(hào)通路等作用有關(guān)[6]。但其發(fā)揮抑瘤效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)尚未明確，為探究其藥效物質(zhì)，對(duì)華蟾素注射液化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)作系統(tǒng)研究是必要的。

超高效液相色譜-電噴霧離子源-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-ESI-QTOF/MS)集合了液相色譜的高分離效能和高分辨質(zhì)譜的強(qiáng)大表征能力[7]，已廣泛應(yīng)用于中藥的體內(nèi)外物質(zhì)基礎(chǔ)研究。在定性分析過(guò)程中，以往科研工作者常手動(dòng)提取色譜峰，并根據(jù)準(zhǔn)分子離子，特征碎片離子、保留時(shí)間等信息對(duì)化合物進(jìn)行逐一辨識(shí)，解析過(guò)程復(fù)雜且耗時(shí)[8]。UNIFI是一個(gè)高效的智能化數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，可將MSE模式采集的組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)與自建數(shù)據(jù)庫(kù)中成分進(jìn)行智能匹配，快速識(shí)別中藥復(fù)雜組分[9-11]。本研究擬通過(guò)UPLC-ESI-QTOF/MSE結(jié)合UNIFI對(duì)華蟾素注射液中化學(xué)組分進(jìn)行分析，為該制劑的毒-效成分及質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Acquity I Class-Xevo G2-XS型UPLC-ESI-QTOF/MS(美國(guó)Waters公司)；ADW-1002-B 型超純水機(jī)(美國(guó)Aquapro公司)；華蟾素注射液(10.0 mL/支，批號(hào)：180410-2，安徽華潤(rùn)金蟾藥業(yè)股份有限公司)；甲酸(色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；乙腈、甲醇(色譜純，德國(guó)Merck公司)；乙酸乙酯(分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司)；MassLynx 4.1工作站(美國(guó)Waters公司)；UNIFI天然產(chǎn)物信息平臺(tái)(美國(guó)Waters公司)。

2 方法

2.1 華蟾素注射液樣品溶液、空白溶液及混合對(duì)照溶液的制備

取華蟾素注射液20 mL，減壓蒸干，4 mL甲醇復(fù)溶，離心(12 000 rpm，10 min)后取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜。另取滅菌水溶液20 mL，制備方法同華蟾素樣品溶液。稱(chēng)取脯氨酸、蟾蜍噻嚀、日蟾毒它靈、沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾毒精等9種對(duì)照品適量，加甲醇溶解，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后置于進(jìn)樣小瓶。

2.2 液相色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流速：0.2 mL/min，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：2 μL，流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序：0 min，3% B；3 min，3% B；5 min，5% B；7 min，10% B；11～13 min，30% B；15 min，38% B；18 min，50% B；20 min，60% B；24～27 min，90% B；28～31 min，3% B。

2.3 質(zhì)譜條件

工作站：MassLynx 4.1軟件；電噴霧離子源以正離子模式(ESI+)采集數(shù)據(jù)，應(yīng)用亮氨酸-腦啡肽實(shí)時(shí)校正。質(zhì)量掃描范圍50～1 200m/z；毛細(xì)管電壓3.0 kV；錐孔電壓40 kV；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣體(N2)溫度350 ℃；脫溶劑氣體流速：600 L/h。設(shè)置低碰撞能量為6 eV，高碰撞能量為20～50 eV。

2.4 UNIFI數(shù)據(jù)處理方法

已知化合物的分析策略：1)華蟾素化學(xué)成分庫(kù)的建立。以華蟾素、蟾皮、蟾酥為關(guān)鍵詞檢索華蟾素化學(xué)成分定性研究文獻(xiàn)，使用ChemDraw繪制已知成分結(jié)構(gòu)式，并導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI庫(kù)；2)初步分析結(jié)果。UPLC-ESI-QTOF/MSE采集的華蟾素注射液樣品溶液及空白樣品溶液原始文件導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI進(jìn)行樣品間比對(duì)，篩查出華蟾素相關(guān)分離組分；基于UNIFI庫(kù)進(jìn)行自動(dòng)匹配，快速識(shí)別分離組分(設(shè)置參數(shù)：2D峰值檢測(cè)最小峰面積設(shè)為200；3D峰值檢測(cè)中，高能量與低能量下獲取的峰強(qiáng)度分別為150和500；質(zhì)量誤差范圍：±10 ppm；選擇加合離子：[M+H]+和[M+Na]+)；3)人工復(fù)核。利用MassLynx工作站，結(jié)合組分的準(zhǔn)分子離子精密質(zhì)量、保留時(shí)間、碎片離子信息及文獻(xiàn)，復(fù)核上述鑒定結(jié)果。

對(duì)于UNIFI未能匹配的具有較高響應(yīng)值的化合物，使用軟件中的Elucidate功能進(jìn)行解析：1)利用UNIFI軟件中Library Search對(duì)系統(tǒng)自帶的中藥數(shù)據(jù)庫(kù)(包含6 000多種天然產(chǎn)物)進(jìn)行檢索；2)利用ChemSpider進(jìn)行在線(xiàn)檢索；3)若檢索無(wú)果，UNIFI軟件中的Elemental-Composition可以根據(jù)同位素模式(i-FIT得分)匹配以及準(zhǔn)分子離子、主要碎片離子精密質(zhì)量推測(cè)分子式，結(jié)合已知化合物的母體結(jié)構(gòu)及特征碎片離子識(shí)別化合物。

3 結(jié)果

3.1 UPLC-ESI-QTOF/MS條件的優(yōu)化

通過(guò)查閱文獻(xiàn)得知，蟾皮、蟾酥中復(fù)雜組分的分離多采用乙腈-有機(jī)酸水系統(tǒng)[12]。因此，洗脫液主要考察了乙腈-水，乙腈-0.5%乙酸溶液，乙腈-0.1%甲酸溶液。結(jié)果顯示，乙腈-0.1%甲酸溶液作為洗脫液時(shí)，華蟾素注射液中各成分的峰形較為尖銳且分離度較好；另比較了正負(fù)兩種離子檢測(cè)模式，ESI+模式下具有更好的離子化效率且峰數(shù)更多。

3.2 華蟾素注射液中化學(xué)成分分析

共識(shí)別華蟾素注射液中76個(gè)化學(xué)成分(空白、混合對(duì)照及樣品溶液的總離子流圖見(jiàn)圖1)，其中蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類(lèi)36個(gè)(峰28、34、36～39、41～61、63～67、69～71、75)，生物堿類(lèi)12個(gè)(包括1種新成分)(峰12、14、15、17～19、21、22、25～27、32)，氨基酸、核苷及小分子肽類(lèi)共13個(gè)(峰1～4、6～11、13、29、35)，小分子有機(jī)酸類(lèi)7個(gè)(峰16、23、30、31、33、40、74)，酰胺類(lèi)4個(gè)(峰5、24、68、72)，甾醇類(lèi)2個(gè)(峰73和76)及其他類(lèi)2個(gè)(峰20和62)。本實(shí)驗(yàn)所鑒定的化合物質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。

圖1 ESI+模式下空白樣品(A)、華蟾素注射液(B)和混合對(duì)照溶液(C)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of blank sample (A),Cinobufacini injection sample (B) and mixed reference solution (C) in ESI+ mode

3.2.1 蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類(lèi)

蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類(lèi)成分共有36個(gè)，以峰46為例簡(jiǎn)述其結(jié)構(gòu)推導(dǎo)過(guò)程。峰46在15.74 min處的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z417.229 3，通過(guò)軟件元素分析推測(cè)其分子式為C24H32O6；根據(jù)其高碰撞能量下碎片離子的精密質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)脫去一分子H2O的碎片離子[M+H-H2O]+(m/z399.219 2)，繼而脫去一分子CO產(chǎn)生[M+H-H2O-CO]+(m/z371.222 5)的碎片離子，再脫去2分子H2O，產(chǎn)生[M+H-3H2O-CO]+(m/z335.200 6)的碎片離子。其裂解行為及保留時(shí)間與沙蟾毒精對(duì)照品一致(圖2)，確認(rèn)峰46為沙蟾毒精。其它蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類(lèi)成分以類(lèi)似步驟進(jìn)行識(shí)別。

3.2.2 生物堿類(lèi)

圖2 ESI+模式下化合物46的質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.2 Mass spectrum and proposed fragmentation pathways of compound 46 in ESI+ mode

圖3 ESI+模式下化合物30的質(zhì)譜圖(A)及裂解途徑(B)Fig.3 Mass spectrum (A) and proposed fragmentation pathways (B) of compound 30 in ESI+ mode

生物堿類(lèi)成分共有12個(gè)(包括1種新成分)，其中吲哚類(lèi)生物堿11個(gè)?，F(xiàn)以峰25為例進(jìn)行質(zhì)譜解析?；衔?5的tR為5.40 min，準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z283.077 0(C12H14N2O4S)；根據(jù)其碎片離子的精密質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)脫去SO3的碎片離子[M+H-SO3]+(m/z203.117 0)，隨后還發(fā)現(xiàn)[M+H-SO3]+連續(xù)脫甲基的碎片離子[M+H-SO3-CH3]+(m/z188.095 4)，[M+H-SO3-2CH3]+(m/z173.071 5)。其裂解行為與文獻(xiàn)[3]報(bào)道的蟾蜍噻嚀裂解行為極為相似，推測(cè)化合物25為蟾蜍噻嚀，這一結(jié)果用蟾蜍噻嚀對(duì)照品作了驗(yàn)證。其它生物堿類(lèi)成分以類(lèi)似步驟進(jìn)行識(shí)別，其中峰27為未曾報(bào)道成分。峰27的tR為6.79 min，一級(jí)質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z201.101 1(C12H12N2O，Cal.201.102 2)；根據(jù)其碎片離子的精密質(zhì)量，在ESI+模式下，先脫去CH4產(chǎn)生碎片離子[M+H-CH4]+(m/z185.074 0)，隨后依次脫去CN、C2H2O、NH，產(chǎn)生[M+H-C2H4N]+(m/z160.075 6)、[M+H-C2H4N-C2H2O]+(m/z118.065 1)、[M+H-C2H4N-C2H2O-NH]+(m/z103.056 1)的碎片離子。根據(jù)其精密質(zhì)量及裂解行為，推測(cè)峰27為峰22(脫氫蟾蜍色胺)進(jìn)一步脫氫的代謝物。

3.2.3 小分子有機(jī)酸類(lèi)

小分子有機(jī)酸類(lèi)化合物共有7個(gè)。以峰30為例對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜裂解分析。峰30的tR為7.90 min，一級(jí)質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z331.196 5(C12H26N4O5，Cal.331.198 1)，根據(jù)其碎片離子的精密質(zhì)量，推測(cè)該成分依次發(fā)生水解，脫NH3、H2O、NCNH、CO等裂解反應(yīng)，均屬辛二酰精氨酸的特征裂解反應(yīng)。其碎片裂解行為(圖3)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的辛二酰精氨酸裂解行為一致，推測(cè)峰30為辛二酰精氨酸。其它小分子有機(jī)酸類(lèi)成分以類(lèi)似步驟進(jìn)行識(shí)別。

表1 華蟾素注射液樣品在ESI+模式下檢測(cè)出的化學(xué)成分

續(xù)表1(Continued Tab.1)

No.化合物 Compound保留時(shí)間 tR(min)分子式Formula測(cè)量值Observedmass(Da)計(jì)算值Calculated mass(Da)誤差Mass error(ppm)加合物Adducts碎片離子MS/MS22脫氫蟾蜍色胺 Dehydro-bufotenine5.05C12H14N2O203.117 7203.118 4-3.4[M+H]+188.095 4、173.071 5、146.059 5、118.065 123庚二酰精氨酸 Pimeloyl-arginine5.13C13H24N4O5317.182 6317.182 50.3[M+H]+317.182 6、264.132 8、258.134 824蟾蜍環(huán)酰胺C Bufogar-garizanine-C5.18C16H26N4O9419.177 0419.177 8-1.9[M+H]+419.177 0、317.178 925蟾蜍噻嚀 Bufothionine*5.40C12H14N2O4S283.077 0283.075 36.0[M+H]+203.117 0、188.095 4、173.071 5、159.090 826蟾蜍丁酸 Bufobutanosic-acid5.77C14H16N2O4277.118 4277.118 30.4[M+H]+277.118 4、177.102 5、159.114 027脫四氫蟾蜍色胺De-hydro-dehydrobufotenine6.79C12H12N2O201.101 1201.102 2-5.5[M+H]+185.074 0、160.075 6、118.065 1、103.056 128脂蟾毒配基-3-硫酸銨Resibufogenin-3-sulfate-ammonium7.29C24H35NO7S482.225 0482.221 27.9[M+H]+482.225 0、187.107 429甘氨酸亮氨酸二肽 Gly-Leu-Gly-Leu7.70C16H30N4O5359.228 9359.229 4-1.4[M+H]+328.187 5、289.176 5、271.165 9、253.155 330辛二酰精氨酸 Suberoyl-arginine7.90C14H26N4O5331.196 5331.198 1-4.8[M+H]+250.156 1、175.118 0、158.093 5、116.070 331壬二酰精氨酸 Azelayl-arginine8.54C15H28N4O5345.213 0345.213 8-2.3[M+H]+345.213 0、303.190 0、282.182 6、267.177 732N-乙酰-5-羥基色胺N-A-cetyl-5-hydroxy-tryptamine8.64C12H14N2O2219.112 2219.113 4-5.5[M+H]+146.062 0、130.068 1、117.055 6、60.075 6,33癸二酰精氨酸 Sebacyl -arginine9.24C16H30N4O5359.229 0359.229 4-1.1[M+H]+359.229 0、328.179 7、272.150 7、253.155 4343β-甲酸基脂蟾毒配基3β-Formyloxylresibufo-genin9.52C25H32O5435.215 5435.214 71.8[M+Na]+435.215 5、413.232 835核黃素 Riboflavin10.17C17H20N4O6377.147 2377.146 12.9[M+H]+377.147 2、243.086 936嚏根草醇 Hellebrigenol13.76C24H34O6419.242 8419.241 82.4[M+H]+401.233 6、383.222 9、365.211 9、347.201 53711α,19-二羥基南美蟾毒精11α,19-Dihydroxy-marinobufagin14.39C24H32O7433.219 7433.222 6-6.7[M+H]+433.219 7、417.226 5、399.215 038ψ-異沙蟾蜍精 ψ-Bu-farenogin14.41C24H32O6417.229 0417.227 73.1[M+H]+399.215 0、335.198 1、301.143 2、279.158 43916-去乙?；?19-氧代華蟾毒它靈16-Desacetyl-19-oxocinobufotalin14.56C24H30O7431.207 9431.207 02.1[M+H]+431.207 9、227.061 1、209.047 540吲哚-3-乙酸 Indole-3-acetic-acid14.70C10H9NO2176.069 9176.071 2-7.4[M+H]+176.069 9、130.065 841日蟾毒它靈 Gamabufo-talin*14.79C24H34O5403.250 4403.248 25.5[M+H]+,385.235 6、367.228 4、349.215 4、271.206 442異沙蟾蜍精 Bufarenogin14.95C24H32O6417.229 0417.227 73.1[M+H]+399.215 0、371.222 0、279.158 4、227.106 843日蟾毒它靈-3-草酸鹽Gamabufotalin-3-oxalate15.08C26H34O8475.230 9475.232 63.5[M+H]+415.212 5、397.202 0、379.191 44411α-羥基南美蟾毒精11α-Hydroxymarinobu-fagin15.21C24H32O6417.229 0417.227 73.1[M+H]+399.215 0、371.222 0、335.198 14519-羥基蟾毒靈 19-Hydroxylbufalin15.64C24H34O5403.250 4403.248 44.9[M+H]+403.250 4、385.236 7、349.217 2、271.206 346沙蟾毒精 Arenobufa-gin*15.74C24H32O6417.229 0417.227 73.1[M+H]+399.215 0、371.221 9、335.200 5

續(xù)表1(Continued Tab.1)

No.化合物 Compound保留時(shí)間 tR(min)分子式Formula測(cè)量值Observedmass(Da)計(jì)算值Calculated mass(Da)誤差Mass error(ppm)加合物Adducts碎片離子MS/MS47嚏根草配基 Hellebrige-nin15.83C24H32O6417.229 0417.227 73.1[M+H]+399.215 0、371.222 0、335.198 148去乙酰蟾毒它靈 Desacetylbufotalin15.98C24H34O5403.250 4403.248 25.5[M+H]+385.235 6、367.228 4、349.214 3、253.191 349去乙酰華蟾毒它靈Desacetylcinobufotalin16.04C24H32O6417.229 0417.227 73.1[M+H]+399.217 3、371.221 9、335.200 550南美蟾毒精 Marinobufa-gin16.13C24H32O5401.230 6401.232 8-5.5[M+H]+383.222 5、367.228 4、349.215 4、271.206 4511β-羥基華蟾毒精1β-Hydroxycinobufagin16.27C26H34O7459.238 0459.238 3-0.6[M+H]+459.238 0、415.208 5、236.128 45212β-羥基脂蟾毒精醇12β-Hydroxyresibufagi-nol16.35C24H32O6417.229 0417.227 73.1[M+H]+399.215 0、335.198 1、279.158 4、159.079 2535β,12β-二羥基華蟾毒精5β,12β-Dihydroxycinob-ufagin16.42C26H34O8475.230 9475.233 2-4.8[M+H]+475.230 9、417.229 054去乙酰華蟾毒精醇Desacetylcinobufaginol16.47C24H32O6417.229 0417.227 73.1[M+H]+399.215 0、371.222 0、335.198 1、243.170 55512β-羥基華蟾毒精 12β-Hydroxycinobufagin16.79C26H34O7459.236 1459.238 3-4.8[M+H]+363.196 7、279.158 456蟾毒它里靈 Bufotalinin17.10C24H30O6415.212 7415.212 11.4[M+H]+415.212 7、397.208 3、379.188 5、351.197 55719-氧代-華蟾毒它靈19-oxo-Cinobufotalin17.23C26H32O8473.216 8473.217 5-1.5[M+H]+473.215 7、377.17 9 0、331.159 3、349.166 758華蟾毒精醇 Cinobufagi-nol17.25C26H34O7459.238 0459.238 3-0.6[M+H]+459.238 0、347.208 0、265.978 459阿根廷蟾毒精 Argentin-ogenin17.38C24H30O6415.212 7415.212 11.4[M+H]+415.212 7、397.208 3、379.188 5、351.197 560脂蟾毒精醇 Resibufagi-nol17.47C24H32O5401.230 6401.232 8-5.5[M+H]+383.222 5、367.228 4、349.215 4、271.206 461遠(yuǎn)華蟾毒精 Telocinobu-fagin*17.90C24H34O5403.250 4403.248 25.5[M+H]+385.235 6、367.228 4、349.215 462阿達(dá)林 Adalinine18.07C13H23NO2226.180 1226.180 7-2.7[M+H]+208.172 7、180.171 463去乙酰華蟾毒精 Desace-tylcinobufagin18.15C24H32O5401.230 6401.232 8-5.5[M+H]+383.222 5、349.215 4、271.206 464蟾毒它靈 Bufotalin*18.18C26H36O6445.257 3445.259 0-3.8[M+H]+385.228 9、367.223 3、349.216 4、241.113 06519-氧代-蟾毒靈 19-oxo-Bufalin18.47C24H32O5401.231 3401.232 8-2.5[M+H]+383.222 5、365.211 9、347.201 3、251.180 166華蟾毒它靈 Cinobufotal-in*18.64C26H34O7459.238 0459.238 3-0.6[M+H]+459.238 0、417.224 8、381.207 3、363.191 8673-乙?；?日蟾毒它靈3-Acetly-gamabufotalin19.11C26H36O6445.257 3445.259 0-3.8[M+H]+367.223 3、349.216 4、241.113 068N,N-二丁基二甲酰胺N,N-Dibutyl-formamide19.62C9H19NO158.155 3158.154 55.1[M+H]+158.155 3、130.254 969華蟾毒精 Cinobufagin*20.60C26H34O6443.239 9443.242 8-6.5[M+H]+401.233 3、365.212 2、347.201 5、319.206 670脂蟾毒精 Resibufagin22.40C24H31O5399.216 4399.216 6-0.5[M+H]+381.206 9、363.196 2、345.185 6、239.180 071去乙酰華蟾毒精-3-單辛二酸酯Desacetylcinobu-fagin-3-hemisubertae24.62C32H44O8579.290 8579.293 4-4.5[M+Na]+579.290 8、318.177 8、301.140 7

續(xù)表1(Continued Tab.1)

No.化合物 Compound保留時(shí)間 tR(min)分子式Formula測(cè)量值Observedmass(Da)計(jì)算值Calculated mass(Da)誤差Mass error(ppm)加合物Adducts碎片離子MS/MS72亞油酸酰胺 Linoleamide25.15C18H33NO280.264 4280.264 01.4[M+H]+280.264 4、263.236 9、235.242 0 737α-羥基膽甾醇 7α-Hydroxycholesterol26.12C27H46O2403.355 3403.357 6-5.7[M+H]+403.355 3、364.362 674十八烯酸 Oleic-acid26.24C18H34O2283.262 9283.263 7-2.8[M+H]+283.262 9、255.233 5753-Epi-蟾毒靈 3-Epi-Bu-falin26.66C24H34O4387.251 9387.253 5-4.1[M+H]+387.251 9、367.226 8、349.216 276膽固醇 Cholesterol28.47C27H46O409.346 3409.344 64.2[M+Na]+409.346 3、387.361 9、369.351 3

注：*經(jīng)對(duì)照品確證結(jié)構(gòu)。

Note：*Identifications confirmed with standard compound.

4 討論

由于中藥及其制劑的化學(xué)成分十分復(fù)雜，傳統(tǒng)人工逐一解譜過(guò)于耗時(shí)耗力，且對(duì)分析者的質(zhì)譜知識(shí)儲(chǔ)備量要求甚高。UNIFI是一個(gè)簡(jiǎn)單高效的數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，它具有數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)挖掘、庫(kù)檢索和報(bào)表生成等功能，能夠精簡(jiǎn)化合物的分析流程，以便從復(fù)雜的樣本中快速獲取色譜-質(zhì)譜信息并識(shí)別化合物。

在本研究中，UPLC具有分離效能高的特點(diǎn)，結(jié)合QTOF/MS的MSE數(shù)據(jù)采集模式，一針進(jìn)樣能同時(shí)獲取組分的準(zhǔn)分子離子及碎片離子信息(MSE模式下高、低能量碰撞誘導(dǎo)解離過(guò)程之間快速切換進(jìn)行數(shù)據(jù)采集)[13]；然后利用UNIFI(通過(guò)預(yù)設(shè)參數(shù)，依據(jù)庫(kù)中導(dǎo)入成分的結(jié)構(gòu)信息對(duì)分離組分進(jìn)行自動(dòng)匹配并解析可能的裂解途徑)對(duì)復(fù)雜樣品及其陰性對(duì)照進(jìn)行智能化比對(duì)分析，快速辨識(shí)中藥及制劑中的復(fù)雜組分。鑒于華蟾素注射液中含有豐富的蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類(lèi)(強(qiáng)心甾體類(lèi))和吲哚生物堿類(lèi)成分，流動(dòng)相中加入少量有機(jī)酸，有助于改善峰形和ESI+模式下的離子化效果，因此水相包含0.1%的甲酸。

本研究所建立的UPLC-ESI-QTOF/MSE結(jié)合UNIFI的分析方法，共辨識(shí)華蟾素注射液中76個(gè)化學(xué)成分。其中蟾蜍二烯內(nèi)酯類(lèi)36個(gè)(沙蟾毒精、日蟾毒它靈、遠(yuǎn)華蟾毒精等)、生物堿類(lèi)12個(gè)(蟾蜍色胺、5-羥色胺、蟾蜍噻嚀等)、氨基酸、核苷及小分子肽類(lèi)共13個(gè)(次黃嘌呤，脯氨酸，環(huán)甘氨酸-脯氨酸二肽等)、小分子有機(jī)酸類(lèi)7個(gè)(辛二酰精氨酸、十八烯酸等)、酰胺類(lèi)4個(gè)、甾醇類(lèi)2個(gè)和其他類(lèi)2個(gè)。

綜上，UPLC-ESI-QTOF/MSE憑借其高靈敏、高分辨率的特質(zhì)聯(lián)合UNIFI智能化數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)能快速分離、分析復(fù)雜天然產(chǎn)物，簡(jiǎn)化了中藥及其制劑中化學(xué)成分的解析流程；利用該方法，本研究快速分析了華蟾素注射液中主要化學(xué)成分，為該制劑的毒-效成分及質(zhì)量控制研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。另外，華蟾素注射液中的蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類(lèi)成分的同分異構(gòu)體較多，且多為取代基位置異構(gòu)體，UPLC-ESI-QTOF/MSE結(jié)合UNIFI對(duì)取代基位置異構(gòu)體的識(shí)別和區(qū)分尚存不足，需進(jìn)一步通過(guò)對(duì)照品或NMR進(jìn)行確定。