李向輝， 康 宇， 尉 斌， 閆盼盼， 劉永錄*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430070）

刺五加多糖（ASPS）是一種天然來源的免疫多糖，安全、無毒，具有免疫刺激活性，能誘導(dǎo)并增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，可作為一種免疫增強(qiáng)劑提高機(jī)體的免疫反應(yīng) （楊侃侃等，2013）。目前，已經(jīng)從剌五加中分離提取出了數(shù)種由果糖、葡萄糖、阿拉伯糖等組成的多糖組分。研究表明，刺五加多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗感染、解毒等功效（段雪磊等，2015；劉樹民等，2014）。與其他植物多糖一樣，刺五加多糖也存在機(jī)體代謝快和給藥量大的問題；另外，還有部分的堿溶性多糖不容易被吸收。因此，提高刺五加多糖的生物利用度、緩釋性及其在體內(nèi)的吸收、免疫效果顯得尤為重要。

納米乳（NE)是一種由表面活性劑、助表面活性劑、油相、水相在適當(dāng)比例下經(jīng)乳化形成的一種粒徑為1~100 nm的乳劑，具有粒徑小、靶向性強(qiáng)、生物利用度高、能提高難溶性藥物的溶解度等優(yōu)點(diǎn)。

刺五加多糖納米乳（ASPS-NE)是本課題組采用納米乳化技術(shù)研制成功的一種納米制劑，有望為獸醫(yī)臨床提供一種安全、有效的免疫增強(qiáng)劑。為進(jìn)一步確定刺五加多糖納米乳的安全性，本研究進(jìn)行了刺五加多糖納米乳對(duì)小白鼠的急性毒性試驗(yàn)和對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn)，以期為刺五加多糖納米乳在獸醫(yī)臨床上的合理安全應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要藥品、試劑及設(shè)備 刺五加多糖，產(chǎn)地遼寧沈陽，由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院制藥工程學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室分離提取；無水乙醇、吐溫-80、司盤-80（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；液體石蠟、甘油（天津市德恩化學(xué)試劑有限公司）；肉豆蔻酸異丙脂（浙江物美生物科技有限公司）；氯化鈉注射液 （山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司）；10%的胎牛血清（美國Sigma公司）；胰酶、RPMI-1640培養(yǎng)液、DMSO（北京索萊寶科技有限公司）；CCK-8（日本東仁公司)；蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室自制。

酶標(biāo)儀（LUX型，美國Thermo Fisher)；倒置生物顯微鏡 （BX43型，日本奧林巴斯)；離心機(jī)（5424R型，德國Eppendorf）；獨(dú)立送風(fēng)隔離籠（IR-20 型，蘇州馮氏）；CO2培養(yǎng)箱（371 型，美國Thermo Scientific)；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD 型，蘇州凈化）。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 Ballc/c小鼠 （體重18~22 g，雌雄各半），鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證：SCXK（豫)2017-0001；小白鼠常規(guī)飼養(yǎng)管理，溫度18~22℃，相對(duì)濕度50%~70%；L929細(xì)胞，中科院上海細(xì)胞庫提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 刺五加多糖納米乳和空白納米乳的制備按照袁珍珍等（2017）、宋冠男等（2013）和李樹鵬等（2011）的方法制備刺五加多糖納米乳和空白納米乳。以吐溫-80、司盤-80為表面活性劑，無水乙醇為助表面活性劑，石蠟油和IPM為油相，使吐溫-80：司盤-80：無水乙醇：甘油：石蠟油：IPM：水溶液=12:4:1:1:4:3:1（質(zhì)量比）。將適量的吐溫-80、司盤-80、無水乙醇、甘油與適量的液體石蠟、IPM充分混合，然后在磁力攪拌器上攪拌，并逐滴滴加ASPS滅菌水溶液 （空白納米乳用蒸餾水代替），直至形成澄清透明的納米乳。制備好的納米乳，放置 12 h，分裝熔封于充氮安瓿瓶內(nèi)，流通蒸汽滅菌半個(gè)小時(shí)即可。制得的納米乳為淡黃色透明澄清液體，平均粒徑為30.6 nm，ASPS含量為25.06 mg/mL。

1.2.2 小白鼠急性毒性試驗(yàn) 預(yù)試驗(yàn)：按簡化寇氏法設(shè)計(jì)試驗(yàn) （曹發(fā)昊等，2014；楊雪峰等，2011）。先計(jì)算出引起小鼠100%死亡和無死亡的劑量。98只小白鼠隨機(jī)分為空白納米乳組和ASPS-NE組，每組各49只，雌雄各半，各分為7個(gè)劑量組，每個(gè)劑量組7只小鼠，分別注射不同濃度的藥液 （每20 g體重給藥量分別為0.125、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.50 mL）， 注射之前禁食不禁水12 h，采用肌肉注射的方法，給藥后連續(xù)觀察7 d，找出刺五加多糖納米乳能使小鼠全部死亡的最小劑量（Dm）和能使小鼠全部存活的最大劑量（Dn）。

正式試驗(yàn)：參照預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)。98只小白鼠隨機(jī)分為空白納米乳組和ASPS-NE組，每組各49只，雌雄各半，各分為7個(gè)劑量組，每個(gè)劑量組7只小鼠，用藥劑量換算成刺五加多糖 分 別 為 625、875、1125、1375、1625、1875、2125 mg/（kg.bw)。根據(jù)李向輝等（2013）的計(jì)算方法算出各組小白鼠的用藥量，以此藥量對(duì)小白鼠進(jìn)行肌肉注射。注射給藥后連續(xù)7 d觀察小鼠的精神狀況、行為活動(dòng)、糞便等情況，記錄各組的死亡數(shù)。最后剖檢各組小鼠，觀察內(nèi)臟器官有無病變。將試驗(yàn)結(jié)果用Bliss軟件進(jìn)行分析，得出空白納米乳和刺五加多糖納米乳的LD50和95%的可信限。根據(jù)文獻(xiàn)（夏鵬飛等，2017）的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行急性毒性分級(jí)，并評(píng)價(jià)刺五加多糖納米乳急性毒性的強(qiáng)弱。

1.2.3 L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn) 將小鼠成纖維細(xì)胞（L929細(xì)胞）傳代后取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞制成1×105個(gè)/mL濃度的細(xì)胞懸液接種96孔培養(yǎng)板，并將細(xì)胞分為正常對(duì)照、陽性對(duì)照、多糖溶液、空白納米乳和ASPS-NE 5個(gè)組，ASPS-NE組、陽性對(duì)照組、空白納米乳組和多糖溶液組每孔加100μL細(xì)胞懸液，正常對(duì)照組只加100μL RPMI-1640培養(yǎng)液，每組三個(gè)重復(fù)，待細(xì)胞貼壁生長后去除原培養(yǎng)液，陽性對(duì)照組加DMSO 100μL，空白納米乳組、刺五加多糖納米乳組、多糖溶液組各加入不同濃度梯度的受試藥物100μL，使各組濃 度 為 250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.9 μg/mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h左右后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)及形態(tài)，然后每孔加10μL CCK-8，孵育2 h左右，用酶標(biāo)儀于450 nm測各孔的OD值，參考劉昌孝等（2006）的方法計(jì)算細(xì)胞毒性分級(jí)（RGR）。

RGR/%=（試驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（正常對(duì)照組OD-空白對(duì)照組OD）；

細(xì)胞毒性分級(jí)（RGR）標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)（RGR≥100)或 1級(jí)（RGR 為 75~99）為合格。 2級(jí)（RGR為50~74）視細(xì)胞形態(tài)情況而定，3到5級(jí)（RGR為0~49）為不合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗(yàn) 小鼠肌肉注射給藥后，高劑量組小鼠1~2 h內(nèi)出現(xiàn)呼吸困難、震顫驚厥、運(yùn)動(dòng)失調(diào)等癥狀，約7 h陸續(xù)有死亡小鼠，其他劑量組小鼠在7 d內(nèi)都有部分小鼠死亡，剖檢后觀察內(nèi)臟未見明顯病理變化，存活小鼠逐漸恢復(fù)正常。

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ASPS-NE組和空白納米乳組的Dm為1.72 g/mL、Dn為0.32 g/mL，按Dm量注射小鼠全部死亡，按Dn劑量注射小鼠均未出現(xiàn)死亡。正式試驗(yàn)結(jié)果：采用簡化寇氏法 （楊慧等，2019）計(jì)算得空白納米乳的LD50為1008.2 mg/（kg·bw） ，95% 可 信 限 為 777.04~1198.2 mg/（kg·bw）；刺五加多糖納米乳的 LD50為1157 mg/（kg·bw），95%的可信限為 949~1347.2 mg/（kg·bw）。具體試驗(yàn)結(jié)果見表 1。

2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 如表2所示，正常對(duì)照組RGR為102、0級(jí)毒、合格；陽性對(duì)照組RGR為22.7、4級(jí)毒、屬于重毒；空白納米乳組在劑量≥15.625μg/mL時(shí)RGR≤99、1級(jí)毒、合格；當(dāng)濃度≤7.8125μg/mL時(shí)，RGR≥99、0級(jí)毒、 合格；ASPS藥液組在濃度≥62.5μg/mL時(shí)RGR≤99、1級(jí)毒、合格；當(dāng)濃度≤31.25μg/mL時(shí)RGR≥100、0級(jí)毒、合格；ASPS-NE組在濃度≥62.5μg/mL時(shí)RGR≤99、1級(jí)毒、合格；當(dāng)濃度≤31.25μg/mL時(shí)RGR≥100、0級(jí)毒、合格；結(jié)果表明與空白納米乳和正常對(duì)照組相比，ASPS-NE組毒性低，在低于31.25μg/mL濃度范圍內(nèi)ASPS-NE對(duì)細(xì)胞為0級(jí)毒。

3 小結(jié)與討論

藥物的安全性評(píng)價(jià)是研發(fā)新藥的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，安全性評(píng)價(jià)的目的在于了解藥物單次或短時(shí)間多次給藥后，動(dòng)物產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度，為臨床安全用藥及檢測提供參考。

本研究在刺五加多糖納米乳急性毒性預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，空白納米乳與刺五加多糖納米乳的Dm與Dn相同，均為1.72 g/mL和0.32 mg/mL，在正式試驗(yàn)中，刺五加多糖納米乳的半數(shù)致死量為1157 mg/（kg·bw)，而空白納米乳為 1008.2 mg/（kg·bw)，根據(jù)急性毒性試驗(yàn)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（彭麗等，2019；鄒紹宇等，2019），結(jié)果表明，空白納米乳和ASPS-NE為低毒藥物。細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明ASPS-NE組在濃度≥62.5μg/mL時(shí)RGR≤99，為1級(jí)毒；當(dāng)濃度≤31.25μg/mL時(shí)RGR≥100，0級(jí)毒，說明當(dāng)濃度≤250μg/mL時(shí)ASPS-NE對(duì)細(xì)胞沒有毒性，并且ASPS-NE比空白納米乳和正常對(duì)照組毒性更低，說明刺五加多糖納米乳降低了毒性。

表1 空白納米乳、ASPS-NE急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

表2 各用藥組L929成纖維細(xì)胞的相對(duì)增值率RGR及毒性級(jí)數(shù)

經(jīng)過對(duì)刺五加多糖納米乳急性毒性、細(xì)胞毒性等方面的研究，表明ASPS-NE毒性低，LD50為1157 mg/（kg·bw），而空白納米乳的 LD50為 1008.2 mg/（kg·bw）。另外，刺五加多糖納米乳細(xì)胞毒性低，在藥物濃度≤31.25μg/mL時(shí)為0級(jí)毒，對(duì)內(nèi)臟器官無病理損害，在獸醫(yī)臨床上使用安全，具有很高的臨床使用價(jià)值。