鄧凱偉，張亦云

（信陽農(nóng)林學(xué)院，河南信陽 464000）

肥胖是體脂過量蓄積所致的臨床綜合征，在細(xì)胞水平的解釋是脂肪細(xì)胞數(shù)目的增加和體積的增大（陳粉粉等，2012）。肥胖嚴(yán)重威脅著動(dòng)物的健康，其發(fā)病率在我國畜牧業(yè)有逐年漲高的趨勢(shì)（Yuling 等，2014）。 王辰等（2015）研究表明，肥胖可通過影響卵巢孕激素受體mPRα發(fā)育變化，引起小鼠假發(fā)情、產(chǎn)仔數(shù)減少和流產(chǎn)等繁殖障礙。但目前國內(nèi)外對(duì)肥胖可能導(dǎo)致動(dòng)物的生殖器官子宮、卵巢、輸卵管以及孕酮膜受體mPRα、mPRβ、mPRγ表達(dá)這方面的研究相對(duì)較少，試驗(yàn)通過構(gòu)建小鼠的營養(yǎng)性肥胖模型，測(cè)定小鼠生殖器官卵巢、子宮、輸卵管重量的變化，采用RT-PCR技術(shù)對(duì)小鼠子宮、卵巢和輸卵管中孕酮膜受體mPRα、mPRβ、mPRγ的基因表達(dá)量進(jìn)行分析，從而探究營養(yǎng)性肥胖對(duì)小鼠生殖器官及孕酮膜受體基因表達(dá)的影響，為研究肥胖通過調(diào)控小鼠生殖器官體重對(duì)生殖性能的影響機(jī)制進(jìn)行初步的探索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料 高脂飼料和普通飼料均購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。高脂飼料和普通飼料的飼料配方見表1。

表1 小鼠飼料配方g/100g

1.2 試驗(yàn)主要試劑 RNA提取液 （批號(hào)為G3013）， 購自 Servicebio； 異丙醇 （批號(hào)為80109218）、無水乙醇（貨號(hào)為 10009218），均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；礦物油、TritonX-100（T8200），均購自美國 SIGMA公司；胎牛血清（批號(hào)為18070301），購自浙江天杭生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)主要儀器 電子天平 （型號(hào)為AN 1321），購自上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；潔凈工作臺(tái)（型號(hào)為SW-CJ-1D），購自廣州瑞智凈化設(shè)備有限公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 （型號(hào)為HH·CPT01A），購自上海一恒科技有限公司；臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī) （型號(hào)為D3024R），購自DragonLab；離心管、TIP 頭，均購自 Axygen Biosciences。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物分組與飼養(yǎng) 選擇4～5周齡、體重13～15 g昆明白雄性小鼠20只，雌性小鼠40只（購自信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院），飼養(yǎng)在室溫22～25℃，濕度50%～70%的房間，自由飲水。將雌鼠先用普通飼料飼養(yǎng)1周適應(yīng)后，隨機(jī)選出20只，繼續(xù)喂養(yǎng)普通飼料，設(shè)為對(duì)照組。剩余20只開始飼喂高脂飼料，設(shè)為高脂組。每周定期對(duì)小鼠進(jìn)行一次空腹體重測(cè)量。

1.5 子宮、卵巢、輸卵管的收集 飼養(yǎng)8周，小鼠營養(yǎng)性肥胖模型建立后，將雌鼠和雄鼠一對(duì)一合籠自由配種，受精三天后，以頸椎脫臼法處死雌鼠，分別取出子宮、輸卵管和卵巢，裝入離心管中，放在-80℃的干冰中保存。

1.6 定量PCR分析卵巢、子宮、輸卵管中mPRα、mPRβ和mPRγ的基因表達(dá)量

1.6.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上登錄的小鼠mPRα、mPRβ、mPRγ基因序列， 應(yīng)用 Oligo7.0和Primer6軟件設(shè)計(jì)引物，引物由武漢塞維爾生物科技有限公司合成。引物相關(guān)信息見表2。

表2 PCR引物序列設(shè)計(jì)

1.6.2 總RNA抽提 采用TRIZOL Reagent試劑盒提取總RNA。

1.6.3 反轉(zhuǎn)錄 取2μg總RNA放置于PCR管中，加入1μL Oligo（dT），加去離子水直至12μL。 放于PCR儀上65℃保溫5 min，快速置于冰上冷卻。然后依次加入4μL 5×Reaction Buffer，2μL 10 mM dNTP Mix，1 μL RiboLock RNAase抑制劑和1μL RevertAi M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，用移液槍充分混勻。放于PCR儀上42℃保溫60 min，最后在70℃水浴中保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

1.6.4 定量PCR 取0.2 mL PCR管，配制如表3，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物每個(gè)配制3管。PCR擴(kuò)增過程如表4。

表3 反應(yīng)體系所需反應(yīng)物及體積 μL

表4 PCR擴(kuò)增過程

1.6.5 結(jié)果處理 ΔΔCT法：

A=CT（目的基因，待測(cè)樣本)-CT（內(nèi)標(biāo)基因，待測(cè)樣本）；

B=CT（目的基因，對(duì)照樣本)-CT（內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本）；

K=A-B；

表達(dá)倍數(shù)=2-K。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 21.0軟件對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著分析，以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠肥胖模型建立結(jié)果 由表5可知，小鼠喂養(yǎng)6周后，高脂組小鼠平均體重與對(duì)照組相比顯著提高 （P＜0.05），8周后，極顯著提高 （P＜0.01），說明小鼠營養(yǎng)性肥胖模型建模成功。

表5 小鼠體重記錄表g

2.2 小鼠子宮、卵巢體重測(cè)定 如表6所示，通過連續(xù)8周飼喂高脂飼料后，高脂組小鼠子宮和卵巢體重與對(duì)照組相比顯著提高（P＜0.05）。

表6 小鼠子宮、卵巢體重g

2.3 mPRα、mPRβ、mPRγ在子宮、輸卵管和卵巢的表達(dá)

2.3.1 mPRα在卵巢、子宮、輸卵管的基因表達(dá)量由圖1可知，高脂組小鼠卵巢中mPRα的表達(dá)量與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）；高脂組小鼠子宮和輸卵管中mPRα表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低（P ＜ 0.05）。

2.3.2 mPRβ在卵巢、子宮、輸卵管的基因表達(dá)量由圖2可知，在卵巢、子宮和輸卵管中，對(duì)照組與肥胖高脂組小鼠相比，mPRβ的基因表達(dá)量均差異不顯著（P ＞ 0.05）。

2.3.3 mPRγ在卵巢、子宮、輸卵管的基因表達(dá)量由圖3可知，在卵巢和輸卵管中，對(duì)照組與高脂組相比mPRγ的基因表達(dá)量有顯著差異（P＜0.05）；在子宮中，對(duì)照組和高脂組中mPRγ的基因表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

崔立坤（2011）研究表明，肥胖對(duì)生殖系統(tǒng)有嚴(yán)重威脅。在畜牧生產(chǎn)中，肥胖通過影響生殖器官變化而對(duì)生殖性能產(chǎn)生一定影響。近年來，通過建立小鼠肥胖模型來探究肥胖對(duì)小鼠生殖機(jī)能的影響也逐漸成為研究的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)通過連續(xù)8周飼喂高脂飼料后，與普通對(duì)照小鼠相比體重差異極顯著 （P＜0.01），小鼠營養(yǎng)性肥胖模型建模成功，進(jìn)行營養(yǎng)性肥胖對(duì)小鼠生殖器官及孕酮膜受體基因表達(dá)的影響研究。

孕酮膜受體的表達(dá)、分布及功能在魚類及兩棲類中研究較為深入（楊梅等，2010）。在哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)表達(dá)、分布及功能研究較少。孕酮膜受體mPRα、mPRβ和mPRγ，具有參與孕激素快速調(diào)節(jié)的作用（林翠英等，2018）。mPRα是最早被發(fā)現(xiàn)且研究最為深入的孕酮膜受體。mPRα主要表達(dá)在生殖器官，包括卵巢和睪丸。mPRα在調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程起重要作用，其能快速誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，抑制顆粒細(xì)胞調(diào)亡。Hagiwara等 （2016)研究發(fā)現(xiàn)，卵巢和排卵前濾泡mPRα和mPRγ的轉(zhuǎn)錄始終保持相對(duì)穩(wěn)定水平。正常受孕以后 ，體內(nèi)孕激素分泌持續(xù)增加，通過與子宮內(nèi)膜發(fā)生特異性結(jié)合，發(fā)揮特異性的生理效應(yīng)，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜發(fā)生生殖障礙 （姚若進(jìn)，2011）。本試驗(yàn)中，通過對(duì)小鼠生殖系統(tǒng)mPRα、mPRβ 和 mPRγ 表達(dá)的研究，mPRα、mPRβ 和mPRγ在高脂組和普通組小鼠子宮、卵巢和輸卵管中均有表達(dá)。高脂小鼠的子宮和輸卵管中mPRα基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照組小鼠 （P＜0.05）；高脂組小鼠巢中mPRα表達(dá)和對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。高脂組子宮、卵巢和輸卵管中mPRβ表達(dá)量與普通對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。高脂組卵巢和輸卵管中mPRγ表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），高脂組小鼠子宮中mPRγ表達(dá)量和對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

mPRα、mPRβ和mPRγ這三個(gè)基因表達(dá)量在子宮、卵巢和輸卵管中均是對(duì)照組高于肥胖高脂組。結(jié)合在試驗(yàn)中，小鼠營養(yǎng)性肥胖模型構(gòu)建后，小鼠生殖器官如子宮、卵巢、輸卵管體重和對(duì)照普通組相比增加，并且達(dá)到差異顯著水平 （P＜0.05）。生殖器官體重變化和孕酮膜受體基因表達(dá)結(jié)果顯示，在小鼠生殖系統(tǒng)中，營養(yǎng)性肥胖通過對(duì)小鼠生殖器官重量的改變，從而導(dǎo)致小鼠生殖性能下降以及降低孕酮膜受體在子宮、卵巢和輸卵管中的基因表達(dá)量。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，營養(yǎng)性肥胖通過對(duì)小鼠生殖器官的影響可降低孕酮膜受體基因的表達(dá)，但肥胖對(duì)小鼠卵母細(xì)胞以及胚胎細(xì)胞的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。