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        微囊藻毒素降解酶MlrA的生物學(xué)特征及催化機(jī)理研究進(jìn)展

        2020-05-15 03:12:16潘禹王華生詹鴻峰孫緩緩
        化工學(xué)報(bào) 2020年3期
        關(guān)鍵詞:殘基底物蛋白酶

        潘禹,王華生,詹鴻峰,孫緩緩

        (江西理工大學(xué)建筑與測繪工程學(xué)院,江西贛州341000)

        引 言

        受生產(chǎn)活動(dòng)與氣候變化影響,有害藍(lán)藻水華在全球富營養(yǎng)化水體中頻繁暴發(fā)。藻類過度生長并持續(xù)向周圍環(huán)境釋放藍(lán)藻毒素對水生態(tài)系統(tǒng)與公眾健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。微囊藻毒素(microcystins,MCs)是自然環(huán)境中檢出頻率最高的藍(lán)藻毒素,具有遺傳毒性與肝毒性[1-2]。通過抑制絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白磷酸酶(protein phosphatases, PPs)PP1 和PP2A 活性,MCs 可引發(fā)一系列細(xì)胞代謝事件,如蛋白質(zhì)過度磷酸化和細(xì)胞骨架失穩(wěn),從而導(dǎo)致肝臟壞死、出血和功能障礙[2-3]。長期接觸或飲用受MCs 污染的水將損害DNA 修復(fù)系統(tǒng)[3],并影響調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和促腫瘤蛋白的表達(dá)活性[1-3]。此外,MCs可在生物體內(nèi)產(chǎn)生活性氧以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激,從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化增加、線粒體損傷、抗氧化系統(tǒng)破壞和基因組改變[1,4-5]。

        環(huán)狀結(jié)構(gòu)使MCs 的化學(xué)性質(zhì)高度穩(wěn)定,對常見的蛋白酶與氧化劑具有抗性[6-7],傳統(tǒng)水處理工藝難以有效去除。然而,大量研究證實(shí)MCs 可被某些特殊細(xì)菌降解[6-11]。微囊藻毒素降解酶(microcystinase或MlrA)是從MCs 降解菌株中鑒定的內(nèi)肽酶,參與至少兩種藍(lán)藻毒素MC-LR和MC-RR的生物降解途徑。本文將綜述MlrA 的進(jìn)化關(guān)系、物化特征、分子結(jié)構(gòu)與催化機(jī)理以及相應(yīng)的研究進(jìn)展,以期為解決MCs污染和飲用水安全問題提供參考。

        1 MlrA的進(jìn)化關(guān)系

        1.1 MlrA的鑒定

        1994 年,Jones 等[12]首次從澳大利亞水體中分離表征出一株鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp. ACM-3962),該菌能夠利用MC-LR 作為生長的唯一氮源和碳源,且其無細(xì)胞提取物(cell-free extract,CE)可直接催化降解MC-LR[13]。Bourne 等[13]對降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定后,提出該菌降解MC-LR至少涉及三種胞內(nèi)水解酶:(1)MlrA 負(fù)責(zé)水解Arg-Adda 肽鍵產(chǎn)生線性產(chǎn)物(NH2-Adda-Glu-Mdha-Ala-Leu-Masp-Arg-OH);(2)線性MC-LR在Ala-Leu肽鍵處被MlrB水解,形成四肽中間體(NH2-Adda-Glu-Mdha-Ala-OH);(3) MlrC 水解Adda-Glu 肽鍵以生成最終產(chǎn)物Adda。

        隨后,鑒定了與酶促途徑相關(guān)的mlr 基因簇(mlr A~D),且mlrA 基因與MlrA 的表達(dá)直接相關(guān)[14]。因此,已將mlrA 作為基因分子標(biāo)記,設(shè)計(jì)特定引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增檢測mlrA 基因,用于鑒別分離物中MCs的降解機(jī)制[6,15]。

        1.2 MlrA的同源性

        MlrA 的直系同源物散落分布于全球各地的水生態(tài)系統(tǒng)中。目前,已分離出多株攜帶mlrA 基因(mlrA+)的細(xì)菌,主要包括屬于α 變形菌門的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas spp.)[11-12,16-18]、鞘氨醇胞菌屬(Sphingosinicella spp.)[16,19]、新 鞘 氨 醇 菌 屬(Novosphingobium spp.)[20]、根 瘤 菌 屬(Rhizobium spp.)[15]、鞘氨醇盒菌屬(Sphingopyxis spp.)[18,21-22],以及β 變形菌博德特氏菌屬(Bordetella spp.)[23]與γ 變形菌寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas spp.)[24]。

        Genbank 數(shù)據(jù)庫中公開儲存了數(shù)十種不同細(xì)菌來源的非冗余MlrA 酶氨基酸序列。相似性搜索(BLASTp)和多重序列比對表明,MlrA 在mlrA+菌株中高度保守,序列相似性達(dá)到92%~100%。但由于缺乏α 變形菌以外的序列數(shù)據(jù),對其進(jìn)化關(guān)系的理解十分有限。MlrA 編碼基因雖在各類菌株中呈現(xiàn)出較高同一性,但觀察到mlrA+菌株全基因組中GC(鳥嘌呤與胞嘧啶)含量[58.4%~59.2%(mol)]略低于相關(guān)屬內(nèi)細(xì)菌[58.9%~68%(mol)][15]。這表明mlrA基因并不是某種細(xì)菌特有,而是通過水平基因轉(zhuǎn)移得來,并伴隨α 變形菌進(jìn)行垂直進(jìn)化,使DNA 密度發(fā)生變化[15]。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與上述結(jié)論一致,在MlrA 序列與16S rDNA 序列進(jìn)化樹中,分類相近物種占據(jù)相似發(fā)育位置,彼此緊密聚集[15,22]。然而,β與γ 變形菌的MlrA 序列并未像16S rDNA 一樣在進(jìn)化樹中形成明顯分支,反而對鞘氨醇盒菌屬內(nèi)細(xì)菌顯示出明顯親和力。該發(fā)現(xiàn)表明mlrA 基因可能在進(jìn)化中再次發(fā)生了側(cè)向基因轉(zhuǎn)移,使α 變形菌以外的菌株獲得了遺傳信息[15,22]。

        此外,MlrA 與Ras 和α 因子轉(zhuǎn)換酶(Rce1)適度同源。CAAX(C 為半胱氨酸,A 為脂肪族氨基酸,X為任意氨基酸)是一種來源豐富的真核蛋白,在細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中具有重要作用,參與細(xì)胞的增殖、分化以及癌變等過程[25]。Rce1 為膜內(nèi)切蛋白酶,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),負(fù)責(zé)切割CAAX 蛋白羧基端-AAX 三肽用以協(xié)調(diào)該蛋白在細(xì)胞膜上的正確定位[26]。更廣泛的序列相似性搜索推斷,MlrA是CPBP(CAAX proteases and bacteriocin-processing enzymes,CAAX 蛋白酶和細(xì)菌素加工酶)家族成員,該家族對應(yīng)于蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(Pfam)中的Abi(abortive infection,流感感染)家族(也稱為CAAX 氨基末端蛋白酶家族)[27]。

        2 MlrA活性調(diào)控與底物特異性

        2.1 表達(dá)與調(diào)控

        通常,在對數(shù)生長后期收集mlrA+細(xì)菌培養(yǎng)物,經(jīng)超聲破菌后將上清液(即CE)用于隨后的酶促分析。由于無法避免雜質(zhì)蛋白干擾,MlrA 的異源表達(dá)成為關(guān)注重點(diǎn)。通過將mlrA 克隆至sCos-1,pBSK II SK,pGEM5Xf(1)或pGEX-4T-1載體,MlrA可實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌宿主中的異源表達(dá)[14,28-30]。Dziga 等[29]首次嘗試將表達(dá)MlrA 的大腸桿菌細(xì)胞固定在藻酸鹽凝膠珠中,在湖水連續(xù)流中使MC-LR的去除率達(dá)到80%以上。雖然MlrA 在大腸桿菌內(nèi)無法保持長期穩(wěn)定(活性<4 d)[29-30],但其表達(dá)量高,降解能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生菌株[14,29]。近期,Dexter 等[30]成功在藍(lán)藻Synechocystis sp.PCC 6803中異源表達(dá)MlrA 酶,并觀察到MlrA 在藍(lán)藻宿主中穩(wěn)定性明顯提升,在9 d 的長期培養(yǎng)中仍具有活性。該研究可為MCs 原位降解提供理論基礎(chǔ)。

        MlrA 活性的調(diào)控強(qiáng)烈依賴于底物濃度。通常情況下,分離表征的mlrA+細(xì)菌在MCs作為營養(yǎng)來源時(shí)存在降解滯后期(10 h~2 d)[12,23]。目前研究普遍認(rèn)為MCs 為胞外信號分子,可誘導(dǎo)MlrA 進(jìn)行表達(dá)[31-32]。通 過 實(shí) 時(shí) 逆 轉(zhuǎn) 錄PCR 研 究,Jiang 等[20]發(fā) 現(xiàn)當(dāng)MCs 降解菌Novosphingobium sp. THN1 暴露于微量濃度的MC-LR 時(shí),mlrA 基因的表達(dá)顯著上調(diào),且暴露濃度越高mlrA的轉(zhuǎn)錄越快速。Hoefel等[33]與Ho等[34]設(shè)計(jì)了一種實(shí)時(shí)定量PCR 測定法,用于檢測砂濾器生物膜內(nèi)的mlrA 基因與廢水處理過程中mlrA+細(xì)菌的豐度。兩項(xiàng)研究均表明,MC-LR 是mlrA+細(xì)菌增殖的主要底物,當(dāng)環(huán)境中存在MC-LR 時(shí),mlrA基因拷貝數(shù)將快速增長。

        此外,Li 等[35]發(fā)現(xiàn)mlrA 基因的表達(dá)受到營養(yǎng)元素限制。與無營養(yǎng)條件相比,添加氮或磷可刺激mlrA基因表達(dá)量,使生物降解速率發(fā)生改變。

        2.2 底物特異性

        MlrA 的底物特異性存在爭議。Dziga 等[28]通過底物篩選,發(fā)現(xiàn)MlrA 對28 種熒光合成底物和32 種顯色合成底物均無活性,這表明MlrA 特異性極強(qiáng),其作用范圍僅限于藍(lán)藻毒素。MCs的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示。 Imanishi 等[17]比較了鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.B-9對8種MCs類似物和藍(lán)藻五肽毒素節(jié)球藻素(nodularin, NOD)的降解能力。結(jié)果表明,B-9 菌可降解含有Arg-Adda 肽鍵的MCs 類似物和NOD,且1 和2 位置氨基酸的取代、缺失或7 位置Mdha殘基的修飾對MlrA活性無影響。相反,對6(Z)-MC-LR 和6(Z)-MC-RR(由6(Z)-Adda 取代Adda組成的幾何異構(gòu)體,含Arg-6(Z) Adda 肽鍵)或MCLF(含Phe-Adda 肽鍵)不具備降解活性。因此,推斷MlrA 對底物具有結(jié)構(gòu)相對專一性,識別肽序MeAsp-Arg-Adda 并選擇性水解Arg-Adda 肽鍵[17]。該結(jié)論在后續(xù)研究中得到驗(yàn)證。Yang 等[23]發(fā)現(xiàn)當(dāng)Stenotrophomonas sp. LTH1 菌 株 暴 露 在MC-LR 與MC-RR 共存環(huán)境時(shí),其對底物的降解速率分別由0.31 mg·(L·h)-1和0.17 mg·(L·h)-1下降至0.27 mg·(L·h)-1和0.12 mg·(L·h)-1。這表明MC-LR 和MCRR 降解途徑類似,多種底物在MlrA 催化時(shí)形成酶競爭。此外,MlrA 對含有MeAsp-Arg-Adda 肽序結(jié)構(gòu)的MC-RR 和MC-YR 同樣具有降解活性,且降解途徑通常與MC-LR相似[16,19]。

        圖1 MCs的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 General chemical structure of MCs

        然而,部分文獻(xiàn)報(bào)道與之矛盾:Sphingomonas sp. ACM-3962[12]和Sphingomonas sp. MD-1[16]無法降解NOD,但ACM-3962菌株表達(dá)的MlrA 可分別通過攻 擊Adda-Phe 和Adda-Trp 鍵 使MC-LF 和MC-LW線性化[28]。上述差異表明NOD 可能不是MlrA 的識別底物,在某些MCs 降解菌(如B-9)中存在未知的功能基因與酶促解途徑。該假設(shè)隨研究深入愈發(fā)引起關(guān)注,已確定部分mlrA+細(xì)菌對MeAsp-Arg-Adda 肽序之外的MCs 仍具有催化作用,如Sphingopyxis sp. TT25 可降解MC-LA[36],Sphingopyxis sp.MB-E可降解MC-LF、MC-LY和MC-LW[37]。

        2.3 抑制特性

        MlrA 的酶活性不受一般肽酶抑制劑影響,如苯甲脒(蛋白水解酶抑制劑)、苯甲基磺酰氟(絲氨酸蛋白酶抑制劑)、亮抑酶肽(絲氨酸/半胱氨酸肽酶抑制劑)、E-64(半胱氨酸肽酶抑制劑)、胃酶抑素(天冬氨酸蛋白酶抑制劑)和大豆胰蛋白酶抑制劑(胰蛋白酶與絲氨酸蛋白酶抑制劑)[14]。然而,在EDTA及1,10-鄰菲咯啉的孵育下,MlrA 酶活性急劇下降,表明該酶可能是金屬肽酶[14,28]。純化MlrA 酶的抑制研究表明,1,10-鄰菲咯啉較EDTA 抑制性更強(qiáng),IC50值(半抑制濃度)分別為(1.48±0.31) mmol·L-1和(37.6±3.1)mmol·L-1[28]。

        MlrA 為中性蛋白酶,在pH 為6.4~9.4 時(shí)活性較高,最佳反應(yīng)pH 為7.6。純化MlrA 對堿性條件具有一定耐受性,當(dāng)pH 升高至10.0 時(shí),相對活性略低于50%[28]。Okano 等[18]研究結(jié)果也表明Sphingopyxis sp.C-1 中MlrA 的活性在pH 為6.52~8.45 時(shí)最佳,在堿性條件下亦具催化活性。這可能與mlrA+細(xì)菌受到自然環(huán)境馴化有關(guān)。由于藍(lán)藻生長期間光合作用不斷增強(qiáng),水體pH 在藍(lán)藻暴發(fā)時(shí)易于發(fā)生變化并逐漸變?yōu)閴A性[32],這促使mlrA+細(xì)菌在進(jìn)化過程中對堿性環(huán)境保持耐受性。MlrA 在酸性條件下難以保持穩(wěn)定,當(dāng)pH=5.0 時(shí),觀察到其相對活性僅為25%[28]。此外,MlrA 的催化速率還取決于溫度,最佳反應(yīng)溫度為25~35℃[15,19,23-24]。

        3 MlrA的拓?fù)渑c結(jié)構(gòu)

        3.1 定位與拓?fù)?/h3>

        MlrA 在細(xì)胞中的位置還未明確。前期研究假設(shè)MlrA 為胞內(nèi)酶[12],但后續(xù)分析中未檢測到負(fù)責(zé)將MCs 導(dǎo)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。其次,SignalP 分析預(yù)測該酶N 端含有約26 個(gè)殘基組成的信號肽序列[13-15],提出MlrA 通過引導(dǎo)作用被遞送至細(xì)胞周質(zhì)空間。然而,Dziga等[28]發(fā)現(xiàn)去除信號肽序列的MlrA人工構(gòu)建體的完整細(xì)胞也可以降解少量MC-LR,其降解能力約為CE 的1/440。作為對比,野生菌株細(xì)胞體酶活力僅約為CE 的1/30。上述數(shù)據(jù)分析可知,MlrA在鞘氨醇單胞菌與大腸桿菌宿主內(nèi)因翻譯加工機(jī)制不同,性質(zhì)可能發(fā)生改變。

        從同源性上分析,與Rce1序列相似更傾向于將MlrA 歸類為膜蛋白。此外,通過亞細(xì)胞定位預(yù)測該酶位于細(xì)胞質(zhì)膜[38],且計(jì)算分析顯示該酶具有多個(gè)跨膜區(qū)[39]。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測MlrA 主要由α-螺旋和loop 結(jié)構(gòu)組成,很少或沒有β-折疊[40]。這些信息與跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)類型相吻合。但由于缺乏蛋白質(zhì)標(biāo)簽或氨基酸標(biāo)記驗(yàn)證,MlrA 蛋白酶N 端與C 端的投射位置仍不確定。

        圖2 不同菌株來源MlrA酶的氨基酸序列比對Fig.2 Sequence alignment of MlrA from different strains

        3.2 活性位點(diǎn)

        根據(jù)DNA 翻譯結(jié)果,完整MlrA 序列含有336個(gè)殘基,計(jì)算分子量約為36×103。根據(jù)圖2 序列對比圖,所有MlrA氨基酸序列都含有HxxHxE基序,該基序可能是金屬肽酶中鋅結(jié)合基序(如HExxH)的變體。Bourne 等[14]推斷HxxHxE 基序中組氨酸殘基(H260和H263)和谷氨酸殘基(E265)為二價(jià)金屬陽離子結(jié)合配體。隨后,Dziga 等[28]通過定點(diǎn)突變構(gòu)建點(diǎn)突變體MlrAH260A 和MlrAE265A,兩種突變體均無活性證實(shí)該基序?yàn)镸lrA的活性中心。

        MlrA 還含有兩個(gè)CPBP 家族成員共有的假定功能基序(圖2)[27]。在這些基序中,谷氨酸和組氨酸殘基(E172、E173、H205 和H260)高度保守。已驗(yàn)證MlrAE172A 和MlrAH205A 突變體喪失活性[41],但根據(jù)CPBP 家族蛋白實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,上述其他保守殘基仍可能與底物催化有關(guān)[27,42-43]。

        3.3 分子結(jié)構(gòu)

        由于PDB 數(shù)據(jù)庫中缺少與MlrA 高度相似的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu),關(guān)于MlrA 的結(jié)構(gòu)信息所知甚少。通過NCBI CD-search 分析,MlrA 序列下游存在Abi結(jié)構(gòu)域。MmRce1(PDB ID:4CAD)是唯一與MlrA具有一定同源性(同一性≤20%)的已解析結(jié)構(gòu)蛋白,其序列中同樣含有Abi 結(jié)構(gòu)域,結(jié)構(gòu)如圖3(a)所示[44]。

        最近,Xu 等[41]通過Phyre2 服務(wù)器根據(jù)4CAD 的晶體結(jié)構(gòu)構(gòu)建了MlrA 的三維結(jié)構(gòu)模型,該模型結(jié)構(gòu)類似于圖3(b)(由I-TASSER 模擬)。對于膜蛋白而言,同源物之間跨膜區(qū)段(主要由疏水氨基酸組成)的序列差異是普遍現(xiàn)象。因此,盡管MlrA 與MmRce1 之間序列同源性較低,但其晶體結(jié)構(gòu)相似,催化殘基高度保守。MlrA 由8個(gè)跨膜螺旋(TM1~8)組成,與4CAD對齊的Abi結(jié)構(gòu)域位于TM4~TM7中,其余4個(gè)螺旋將Abi結(jié)構(gòu)域包圍,并一同形成容納底物的錐形反應(yīng)腔。保守殘基E172、H205、H260 和N264 位于跨膜螺旋內(nèi),并且其側(cè)鏈投射至腔體內(nèi)部,直接參與催化反應(yīng)。

        4 MlrA的水解機(jī)制

        前期研究在菌株培養(yǎng)時(shí)添加外源金屬離子,研究了MlrA 的活化機(jī)制,推斷MlrA 為基質(zhì)金屬蛋白酶。吳涓等[45]發(fā)現(xiàn)吉氏庫特菌M9 分別在Cu2+、Zn2+和Mn2+(1 mg·L-1)的促進(jìn)作用下,對MCLR 與MC-RR 的降解活性顯著提高。然而,周潔等[46]卻發(fā)現(xiàn)同樣濃度的Cu2+、Zn2+和Mn2+對食酸戴爾福特茵USTB04 降解MCs 無明顯作用,其中Cu2+還具有一定的抑制作用。Ho 等[47]同樣發(fā)現(xiàn)0.5 mg·L-1的Cu2+抑制菌株Sphingopyxis sp. TT25 降解MCs。這些數(shù)據(jù)表明,某些金屬離子可能是MCs生物降解過程中的輔助因子,與體系內(nèi)降解菌株豐度和生物相互作用有關(guān)[48],而對MlrA 的活性無直接關(guān)聯(lián)。

        圖3 MmRce1(a)與MlrA(b)的分子結(jié)構(gòu)Fig.3 Three dimensional structure of MmRce1(a)and MlrA(b)

        隨研究深入,發(fā)現(xiàn)MlrA 序列中存在一組高度保守的谷氨酸與組氨酸,且其活性受1,10-鄰菲咯啉與EDTA 影響,因此推定該酶為鋅結(jié)合蛋白酶(如3.3節(jié)所述)[14,25,29]。但X 射線晶體學(xué)研究表明,與MlrA結(jié)構(gòu)同源的MmRce1 晶體中不存在結(jié)合Zn2+;1,10-鄰菲咯啉使該酶失活是由于蛋白結(jié)構(gòu)解折疊,并不是螯合了酶中的Zn2+[44]。最近,Xu 等[41]通過分子動(dòng)力學(xué)模擬還發(fā)現(xiàn)HxxHxE 基序中假定金屬結(jié)合殘基Glu與配體Zn2+間隔距離較大,形成的結(jié)合網(wǎng)絡(luò)并不完整。因此,MlrA的活性可能不需要Zn2+激活,其水解機(jī)制與4 種已建立的典型蛋白水解機(jī)制(天冬氨酸,半胱氨酸,絲氨酸/蘇氨酸和金屬基)不同,而與MmRce1相似。

        MlrA 的模擬分子結(jié)構(gòu)顯示了一種新蛋白質(zhì)水解機(jī)制,其活性位點(diǎn)包括谷氨酸、兩種組氨酸和對催化活性必不可少的天冬酰胺。圖4 為MlrA 催化位點(diǎn)信息。在底物催化過程中,兩個(gè)對應(yīng)跨膜螺旋(TM4 與TM5)中 的E172 與H205 殘 基 最 為 關(guān) 鍵。E172 與H205 通過水分子作為配體彼此橋接,并將水分子通過堿催化(base catalysis)去質(zhì)子化激活,對底物易斷裂羰基鍵進(jìn)行親核攻擊(nucleophile attack)。而H260和N264側(cè)鏈位于TM7的連續(xù)螺旋轉(zhuǎn)角上,與催化二連體E172和H205相對應(yīng),提供氫鍵以穩(wěn)定形成的四面體氧陰離子過渡態(tài)(oxyanion transition state)。而后,該中間體塌縮為羧酸鹽,將H205 或E172 質(zhì)子轉(zhuǎn)移所促成的胺丟棄,起到氧陰離子孔(oxyanion hole)的作用。此外,W176和W201殘基與E172的羧酸側(cè)鏈相接觸,以提高其pKa,加快化學(xué)反應(yīng)的速率[41,44]。盡管上述蛋白水解機(jī)制是新穎的,但在其他膜相關(guān)蛋白酶中同樣發(fā)現(xiàn)所涉及的催化元素。例如鋅金屬蛋白酶S2P[49]與Ste24[50-51]、真菌谷氨酸肽酶SGP[52]和菱形蛋白酶GlpG[53-56]都具有類似作用:使用谷氨酸/絲氨酸活化水分子并由Asn 和His 殘基形成氧陰離子孔。晶體結(jié)構(gòu)模型為深入了解MlrA 的結(jié)構(gòu)提供了理論基礎(chǔ),但由于初級結(jié)構(gòu)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的物種特異性差異,對其水解機(jī)制的進(jìn)一步研究應(yīng)保持謹(jǐn)慎。根據(jù)Clustal Omega 分 析[57],MmRce1 與MlrA 的 一 級 結(jié) 構(gòu) 僅 有17%~20% 的同源性,序列覆蓋率為74%~83%;MmRce1 作為真核膜蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER),而MlrA 為原核生物表達(dá),設(shè)想其定位于質(zhì)膜,其N 端與C 端投射位置尚不明確。解決MlrA 的晶體結(jié)構(gòu)將有助于更好地理解蛋白酶水解催化機(jī)制。

        圖4 MlrA的催化位點(diǎn)Fig.4 Crystal structure of MlrA catalytic site

        5 結(jié) 論

        近年來,水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象不斷加劇,藍(lán)藻水華污染形勢日益嚴(yán)峻。根據(jù)聯(lián)合國兒童基金會(huì)(UNICEF)與世界衛(wèi)生組織(WHO)聯(lián)合發(fā)布的2000—2017 飲用水與環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測規(guī)劃報(bào)告,全球約三分之一的人無法通過基本水處理設(shè)施獲得安全飲用水[58]。作為環(huán)境友好型策略,MCs 的微生物降解已研究近30 年,雖然在mlrA+菌株的分離表征與酶促機(jī)理上取得一定研究進(jìn)展,但關(guān)于其作用水解酶,尤其是MlrA 的認(rèn)識尚不充分,仍有許多問題有待探究。

        (1)MlrA的底物識別與作用方式尚不明確

        MCs 的分子特性賦予其豐富的結(jié)構(gòu)靈活性,已從自然環(huán)境中檢測到至少246 種MCs 的變體同源物[59]。然而,目前降解研究主要集中在MC-LR、MC-RR 及MC-YR 三種毒素上,對不同底物催化作用認(rèn)識的局限性導(dǎo)致MlrA 的底物選擇機(jī)制及作用肽鍵尚存爭議。Valeria 等[60]從阿根廷San Roque 水庫分離出一株與MC-LR 降解菌株同源的鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp. CBA4,該菌在36 h 內(nèi)可降解初始濃度為0.2 mg·L-1的MC-RR。但在分析該菌的降解途徑時(shí),未檢測到任何與MC-LR相似的已知中間產(chǎn)物,CBA4 通過去甲基化作用分解MC-RR。Wang 等[61]發(fā)現(xiàn)Sphingopyxis sp. USTB-05 降解MCRR 的酶促途徑與MC-LR 相似,首先通過MlrA 斷裂Adda-Arg 肽鍵使MC-RR 開環(huán),但MlrA 在作用時(shí)還經(jīng)過了兩個(gè)額外脫水縮合步驟,最終生成含有兩個(gè)小肽環(huán)的線性產(chǎn)物。這些發(fā)現(xiàn)在豐富MCs 微生物降解機(jī)制的同時(shí)也為認(rèn)識MlrA 的催化特性帶來一定困難,使MlrA 的催化特性無法拓展至不同種類的MCs。王 俊 峰[62]提 出MlrA 首 先 攻 擊MC-RR 中Adda-Arg 之間的肽鍵是由于該肽鍵鍵能較小,容易斷裂。該假說可能為理解MlrA 的作用特性提供建設(shè)性意見。

        盡管學(xué)者普遍認(rèn)為在MCs 降解過程中存在不同的酶促途徑,但由于檢測方法受限始終無法完全檢測其中的中間產(chǎn)物,因此對MlrA 的作用方式認(rèn)識不清[63]。Hashimoto 等[64]采用高級Marfey 法檢測出B-9 菌降解MC-LR 的完整過程涉及多種中間產(chǎn)物,雖未明確MlrA 在其中發(fā)揮哪些作用,但該發(fā)現(xiàn)可為闡明MlrA的識別機(jī)制提供支持。

        (2)MlrA的分子結(jié)構(gòu)尚未解析

        在MlrA 的氨基酸序列中,存在長段未注釋功能區(qū),如圖5 所示?;赟phingopyxis sp.ACM-3962 基因文庫篩選,Bourne 等[14]發(fā)現(xiàn)克隆缺失任何片段的mlrA基因?qū)?dǎo)致MlrA 在異源宿主中失活,這表明在MlrA 的結(jié)構(gòu)中可能存在尚未發(fā)現(xiàn)的功能區(qū)域。目前還未有研究報(bào)道通過X-Ray 或NMR 技術(shù)測定MlrA 的分子結(jié)構(gòu)。以低同源性蛋白晶體為模板對MIrA 進(jìn)行分子模擬可以為理解MlrA 的水解機(jī)制提供一定認(rèn)識,但無法精確洞察其發(fā)揮功能的活性中心,確定與底物的結(jié)合方式。MlrA 三維結(jié)構(gòu)的測定顯得尤為重要。

        圖5 MlrA的結(jié)構(gòu)域組成Fig.5 Domain organisation of MlrA

        蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的首要難點(diǎn)在于目的蛋白的純化結(jié)晶。關(guān)于MlrA 的純化研究鮮有報(bào)道?;仡櫱拔?,MlrA 純化的主要困難可能是具有膜相關(guān)性。根據(jù)Dziga 等[28]研究報(bào)道,在天然或變性條件下重組MlrA 不與樹脂結(jié)合,且洗滌劑(1% Triton X-100)回收效率極低,因此無法使用親和層析進(jìn)行純化。純化無效可能是洗滌劑作用。Triton X-100能溶解細(xì)胞膜脂質(zhì),但MlrA 具有強(qiáng)疏水性,在洗脫時(shí)可能會(huì)破壞蛋白結(jié)構(gòu)使酶失活。Manya 等[65]在純化酵母膜蛋白POMT 時(shí)發(fā)現(xiàn),離子洗滌劑或兩性洗滌劑較Triton X-100 相比可有效純化POMT,使酶活保持穩(wěn)定。該發(fā)現(xiàn)可能為MlrA 的純化提供思路。

        總之,MlrA 的結(jié)構(gòu)研究仍處于起步階段,對MlrA 的晶體研究有助于更深層次地理解其生物學(xué)功能和分子進(jìn)化關(guān)系,為分子設(shè)計(jì)與改造提供研究基礎(chǔ)。

        6 展 望

        藍(lán)藻水華已蔓延至全球108 個(gè)國家,其中超過70%的地區(qū)有MCs 檢出記錄[66]。作為自然環(huán)境下MCs 的主要衰減機(jī)制,研究微生物降解作用的重要性不言而喻。截至目前,MlrA 的異源表達(dá)已取得較大進(jìn)展,但如何通過蛋白質(zhì)工程或酶工程將重組酶在自然水體中高效、穩(wěn)定且規(guī)?;瘧?yīng)用仍有待探索。未來研究工作需首要明確MlrA 的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系,聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)的新興技術(shù),著重考慮酶制劑或微生物制劑的工業(yè)生產(chǎn)與運(yùn)作管理,進(jìn)一步擴(kuò)大MlrA 的適用范圍和應(yīng)用潛力。具體研究可從如下幾個(gè)方面展開。

        (1) MlrA 在實(shí)驗(yàn)條件下可能以二聚體形式存在[28],通過遠(yuǎn)程配體結(jié)合仍有機(jī)會(huì)形成金屬依賴性催化中心[41]。因此,積極開展MlrA 的晶體學(xué)研究,通過試驗(yàn)精確解析其分子結(jié)構(gòu),可進(jìn)一步完善MlrA的水解機(jī)制。

        (2) 以MlrA 的酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系為基礎(chǔ),通過基因工程或化學(xué)修飾技術(shù)進(jìn)行分子改造[67],使其在異源宿主中能夠長期保持高密度、高穩(wěn)定的正確表達(dá),以達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)要求。

        (3)游離酶通常在極端環(huán)境(如高溫、高離子濃度、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等)下容易失活[68]。通過研究酶與帶電表面間的相互作用,使用物理化學(xué)法將MlrA 固定至酶載體,可增強(qiáng)其環(huán)境耐受性,提高催化效率。

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