周曉榮 孟霜 馮振宇 史敏 趙建平

馬錢子又名番木鱉是馬錢子科植物馬錢(Strychnosnux-vomica.L)的干燥成熟種子，苦，溫；有大毒，歸肝、脾經(jīng)，能夠通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫，用于跌打損傷、骨折腫痛、風(fēng)濕頑痹、麻木癱瘓、癰疽瘡毒、咽喉腫痛[1]。研究發(fā)現(xiàn)，馬錢子中的主要成分為生物堿類，其數(shù)量至少有20余種，其中士的寧和馬錢子堿是其主要成分，具有確切的抗腫瘤作用[2]。除馬錢子堿和士的寧外，還包括偽士的寧、伊卡金、異馬錢子堿、偽馬錢子堿、奴弗新和異士的寧等生物堿成分[3]。本課題通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)提取分離出10種生物堿成分，并對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞進(jìn)行活性篩選，結(jié)果顯示偽士的寧對(duì)HT-29細(xì)胞增殖有顯著影響。本實(shí)驗(yàn)以偽士的寧為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)MTT法進(jìn)一步考察其對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞是否具有時(shí)間依賴和劑量依賴關(guān)系，并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞周期的影響，為后期研究其抗結(jié)腸癌機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

偽士的寧(為本課題組前期提取分離純化后，經(jīng)質(zhì)譜、氫譜和碳譜等波譜技術(shù)鑒定，純度≥98%)；MC5A培養(yǎng)基(Gibco公司，批號(hào)為16600-082)；噻唑藍(lán)(美國(guó) Sigma公司)；胎牛血清(Gibco公司，批號(hào)為10099-141)；胰蛋白酶(Gibo公司，批號(hào)為15050065)；青霉素-鏈霉素雙抗(Procell公司，批號(hào)為PB180120)；磷酸鹽緩沖液(Procell公司，批號(hào)為PB180327)；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物，批號(hào)為KGA512)。

1.2 細(xì)胞株

人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)：CL-0118)

1.3 儀器

SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)(蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司)；MCO-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱(臺(tái)灣SANYO公司)；IX51型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；5702R型低速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；MULTISKAN MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；CytoFLEX型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BECKMAN COULTER公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將HT-29細(xì)胞從液氮中取出，快速放入37℃水浴鍋中，輕搖凍存管使凍存液溶解，溶解后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有5 mL培養(yǎng)基的離心管中，離心收集細(xì)胞，室溫1000 r/min離心5分鐘后棄上清；用含10%胎牛血清的MC5A完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，接種到培養(yǎng)皿中，輕輕吹打混勻，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.5 MTT試驗(yàn)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HT-29細(xì)胞，用含10%胎牛血清的MC5A完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到3×104個(gè)/mL，接入96孔板后37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)過(guò)夜。將實(shí)驗(yàn)分為只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和31.25 μmol/L、62.50 μmol/L、125 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L共6個(gè)濃度的偽士的寧溶液給藥組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下每組分別培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)。完成培養(yǎng)后，每孔加入10 μL噻唑藍(lán)，37℃培養(yǎng)4小時(shí)，加入150 μL DMSO輕微震蕩10分鐘，將酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)定為490 nm，測(cè)定各孔吸光值，并分別計(jì)算24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)的IC50值。將以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，按以下公式整理分析數(shù)據(jù)。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=1-(給藥組吸光度值-空白對(duì)照組吸光度值)/(陰性對(duì)照組吸光度值-空白對(duì)照組吸光度值)×100%

1.6 細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)

按1.5項(xiàng)方法，用不同濃度的偽士的寧(0 μmol/L、125 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L)分別處理HT-29細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.7 細(xì)胞周期檢測(cè)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HT-29細(xì)胞，以每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。將實(shí)驗(yàn)分為0 μmol/L、250 μmol/L偽士的寧處理組，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，收集細(xì)胞。用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞，1000 r/min 離心5分鐘，去上清，用PBS緩沖液重懸潤(rùn)洗2次后再次離心去上清。取100 μL PBS重懸細(xì)胞，緩慢加入700 μL預(yù)冷的80%乙醇，使乙醇終濃度為70%，4℃固定4小時(shí)以上。1000 r/min離心5分鐘，預(yù)冷PBS緩沖液潤(rùn)洗2次，加入100 μL RNase(50 μg/mL)，37℃孵育30分鐘后加入400 μL PI染色液(50 μg/mL)，4℃避光染色30分鐘，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 偽士的寧對(duì)HT-29細(xì)胞的增殖影響

以不同濃度的偽士的寧分別處理HT-29細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，結(jié)果顯示偽士的寧對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。

當(dāng)濃度為250 μmol/L，并培養(yǎng)72小時(shí)后，其抑制率大于50%，培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)抑制率均小于50%。當(dāng)濃度為500 μmol/L時(shí)，培養(yǎng)48小時(shí)、72小時(shí)下抑制率均大于50%。當(dāng)濃度成為1000 μmol/L培養(yǎng)72小時(shí)抑制率達(dá)到97.47%，抑制作用最強(qiáng)。作用24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后IC50值分別為0.442 μmol/mL、0.240 μmol/mL、0.175 μmol/mL。見(jiàn)表1。

根據(jù)結(jié)果可以看出，偽士的寧對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用存在著顯著的時(shí)間依賴關(guān)系以及劑量依賴關(guān)系，見(jiàn)圖1。

2.2 偽士的寧對(duì)HT-29細(xì)胞形態(tài)影響

倒置顯微鏡觀察顯示，0 μmol/L組HT-29細(xì)胞形態(tài)正常飽滿，排列均勻且細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密呈貼壁生長(zhǎng)，局部細(xì)胞過(guò)度增殖導(dǎo)致細(xì)胞重疊；隨著偽士的寧濃度及作用時(shí)間的增加，細(xì)胞數(shù)量明顯下降，體積變小，變亮，邊緣模糊，局部可見(jiàn)部分已固縮的細(xì)胞及死亡的細(xì)胞碎片。當(dāng)濃度達(dá)到500 μmol/L，作用72小時(shí)，倒置顯微鏡觀察顯示多為固縮及死亡細(xì)胞。見(jiàn)圖2～4。

表1 偽士的寧對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制率及IC50值

圖1 偽士的寧對(duì)HT-29細(xì)胞抑制作用曲線

注：A偽士的寧0 μmol/L；B偽士的寧125 μmol/L；C偽士的寧250 μmol/L；D偽士的寧500 μmol/L

圖2 不同濃度偽士的寧作用24小時(shí)后人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞形態(tài)的顯微鏡觀察

注：A偽士的寧0 μmol/L；B偽士的寧125 μmol/L；C偽士的寧250 μmol/L；D偽士的寧500 μmol/L

圖3 不同濃度偽士的寧作用48小時(shí)后人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞形態(tài)的顯微鏡觀察

注：A偽士的寧0 μmol/L；B偽士的寧125 μmol/L；C偽士的寧250 μmol/L；D偽士的寧500 μmol/L

圖4 不同濃度偽士的寧作用72小時(shí)后人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞形態(tài)的顯微鏡觀察

2.3 偽士的寧對(duì)HT-29細(xì)胞周期影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果如表2及圖5所示，與偽士的寧0 μmol/L組相比，偽士的寧250 μmol/L處理后HT-29細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)量明顯增加，S期細(xì)胞數(shù)量基本不變，G2期細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明一定濃度的偽士的寧可抑制HT-29細(xì)胞由G1期向S期G2期轉(zhuǎn)化，在G1期發(fā)生阻滯達(dá)到對(duì)細(xì)胞的抑制作用，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

表2 偽士的寧對(duì)HT-29細(xì)胞周期的影響(%)

注：與偽士的寧0 μmol/L組比較，aP<0.05。

注：A偽士的寧0 μmol/L，B偽士的寧250 μmol/L。

圖2 偽士的寧對(duì)HT-29細(xì)胞周期的影響

3 討論

偽士的寧為馬錢子藥材中的生物堿成分，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，僅發(fā)現(xiàn)有馬錢子堿對(duì)慢性白血病、乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7人乳腺癌細(xì)胞、SMMC7221人肝癌細(xì)胞等有一定的抑制作用[4-8]，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于偽士的寧在治療癌癥方面的任何文獻(xiàn)報(bào)道。結(jié)腸癌是臨床上較為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，且術(shù)后恢復(fù)較差容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[9]，抗癌藥物不良反應(yīng)較大。中藥治療結(jié)腸癌不僅能緩解西藥治療所伴隨的不良反應(yīng)、減低毒副作用，還能增強(qiáng)患者機(jī)體免疫能力，提高治療效果。前期研究發(fā)現(xiàn)，馬錢子對(duì)于結(jié)腸癌具有明顯的療效作用。因此馬錢子治療結(jié)腸癌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究具有一定的意義。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以看出，偽士的寧在體外對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞有顯著地抑制作用，能有效抑制HT-29細(xì)胞的增殖活性。隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，其對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)，說(shuō)明偽士的寧對(duì)于HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率與干預(yù)時(shí)間呈正相關(guān)。另外，偽士的寧在同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制作用也隨濃度增加而增強(qiáng)。偽士的寧對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴和時(shí)間依賴關(guān)系。通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，未給藥人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞形態(tài)正常飽滿，排列均勻且細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密呈貼壁生長(zhǎng)，局部細(xì)胞過(guò)度增殖導(dǎo)致細(xì)胞重疊；隨著偽士的寧給藥濃度及作用時(shí)間的增加，細(xì)胞數(shù)量明顯下降，體積變小，變亮，邊緣模糊，局部可見(jiàn)部分已固縮的細(xì)胞及死亡的細(xì)胞碎片。由此可見(jiàn)偽士的寧對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞有一定的抑制作用。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明HT-29細(xì)胞在偽士的寧(250 μmol/L)干預(yù)下細(xì)胞數(shù)量在G1期明顯增多，S期基本不變，G2期明顯減少，說(shuō)明HT-29細(xì)胞在G1期發(fā)生阻滯，不再向S期G2期轉(zhuǎn)化，從而誘使細(xì)胞早期凋亡。

大量研究表明，結(jié)腸癌的形成是由多個(gè)基因參與作用的結(jié)果，但偽士的寧是通過(guò)影響相關(guān)信號(hào)通路來(lái)降低細(xì)胞侵襲力，抑制血管生成來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，還是通過(guò)抑制其基因表達(dá)水平來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡還需進(jìn)一步研究[10]，且細(xì)胞凋亡主要是通過(guò)3個(gè)途徑發(fā)生，一為通過(guò)細(xì)胞表面的相關(guān)死亡受體觸發(fā)的外源性途徑；二則是由線粒體介導(dǎo)內(nèi)源性途徑；三是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)應(yīng)激凋亡途徑[11]，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究偽士的寧引起人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的主要途徑奠定一定的理論基礎(chǔ)。