係夢琪 任秀君

缺血性腦中風(fēng)是目前全世界第二大致死性疾病，死亡人數(shù)約占所有疾病的10%，是導(dǎo)致殘疾的主要神經(jīng)性疾病，因其發(fā)病復(fù)雜、治愈率低、預(yù)后差、易復(fù)發(fā)而備受關(guān)注[1- 2]。目前國內(nèi)外關(guān)于缺血性中風(fēng)治療方法和預(yù)防的研究較少，西醫(yī)臨床治療中風(fēng)的常用方法是溶栓，但溶栓藥物極易引起顱內(nèi)出血，且時(shí)間窗較短，療效有限[3]。因而研究更有效、安全的治療方法至關(guān)重要。針灸治療中風(fēng)歷史悠久，具有簡便、價(jià)廉、不良反應(yīng)小的特點(diǎn)，在臨床中廣泛用于中風(fēng)及其后遺癥的治療[4]，但其作用機(jī)制，尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)通過比較缺血前電針“豐隆”(ST40)，腦缺血后電針ST40、“百會”(GV20)與僅在腦缺血后電針ST40、GV20兩種針灸處方對腦缺血大鼠的影響，試圖說明電針預(yù)處理可通過增加缺血側(cè)側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone，SVZ)巢蛋白(Nestin)陽性細(xì)胞增殖促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)損傷和修復(fù)，療效優(yōu)于僅在腦缺血后進(jìn)行治療，從而為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠24只，7周齡，體重(200±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，保持自然生物節(jié)律(12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗)，溫度(24±1)℃，濕度(50±10)%，自由攝食，水瓶給水。所有程序均由北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)術(shù)委員會實(shí)驗(yàn)動物倫理分委員會審核批準(zhǔn)(編號：BUCM-3-2018022802-1002)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

FeCl3(10025-77-1，天津市福晨化學(xué)試劑廠)；Nestin抗體(ab11306，Abcam公司)；二抗HRP抗小鼠IgG(BM104，武漢博士德生物工程有限公司)；DAB顯色液(AR1022，武漢博士德生物工程有限公司)；無菌針灸針(0.30 mm×25 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)；韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(LH202H，北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司)；電子顯微鏡(BX40F4，Olympus公司)；數(shù)碼相機(jī)(E-330，Olympus公司)。

1.3 制作模型

大鼠用10%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，右側(cè)臥位固定在鼠板上，在外耳道和左眶上緣中間切開皮膚，做一個(gè)大約2 cm的縱向切口，分離肌肉后，去除部分顳骨，暴露出大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)，用浸有10 μL 50%FeCl3(用0.1 mol/L HCL配置)溶液的濾紙敷在該段動脈上20分鐘，取下濾紙后生理鹽水沖洗，縫合傷口，少許青霉素粉消炎抗菌，制作大腦中動脈血栓(middle cerebral artery thrombus,MCAT)模型[5]。

1.4 動物分組

大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、模型組、電針1組、電針2組(每組6只)。(1)假手術(shù)組：飼養(yǎng)7天后，于第8天暴露MCA，用生理鹽水濾紙貼敷20分鐘。(2)模型組：飼養(yǎng)7天后，于第8天暴露MCA，用50%FeCl3濾紙貼敷20分鐘，造成腦缺血模型。(3)電針1組：電針雙側(cè)ST40，每天1次，連續(xù)7天，于第8天造成腦缺血模型，術(shù)后電針ST40、GV20，每天1次，連續(xù)7天；(4)電針2組：飼養(yǎng)7天，于第8天造成腦缺血模型，術(shù)后電針ST40、GV20，每天1次，連續(xù)7天。每組動物均為術(shù)后1、7天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行腦組織取材，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只大鼠。電針1組、電針2組治療期間用布袋固定大鼠進(jìn)行電針治療，其余各組同期布袋固定。實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

1.5 針刺方法

根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]中的實(shí)驗(yàn)動物穴位圖定位。ST40在膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨正中，腓骨小頭下7 mm。GV20在頂骨正中。GV20 前2 mm穴點(diǎn)被選取用于連接電針。ST40直刺7 mm，GV20和前方2 mm處各向后斜刺2 mm；雙側(cè)ST40，GV20及其前方2 mm處分別接電針儀，疏密波，頻率2/100 Hz交替，刺激強(qiáng)度以1-2-3 mA為宜，大鼠肢體出現(xiàn)輕微顫動，治療持續(xù)時(shí)間30分鐘。

1.6 行為學(xué)檢測

在手術(shù)后1天運(yùn)用改良的Bederson評分法[7]對所有動物神經(jīng)功能缺損評分(neurological deficit score，NDS)進(jìn)行檢測。0分(正常)：無神經(jīng)功能缺陷；1分(輕度)：提尾時(shí)右側(cè)前爪不能伸展；2分(中度)：向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分(重度)：向右側(cè)傾倒；4分(極重度)：意識喪失，不能自主活動。術(shù)后清醒時(shí)評分大于或等于1分者入選。

1.7 取材

各組大鼠生存期滿，戊巴比妥鈉腹腔麻醉后仰臥位固定，剖開胸腔暴露心臟，從左心室插入灌流針，剪開右心耳，生理鹽水灌注5分鐘后，4%多聚甲醛繼續(xù)灌注20分鐘直至動物四肢僵硬、肝臟變白，取出大腦用10%中性甲醛固定48小時(shí)以上，石蠟浸潤包埋，制成蠟塊，在前腦側(cè)腦室水平制備冠狀切片，片厚5 μm，常溫保存。

1.8 組織形態(tài)學(xué)觀察

每組大鼠在術(shù)后1天選取兩張石蠟切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色后觀察缺血半暗帶的組織形態(tài)變化。

1.9 Nestin免疫組化檢測

每只大鼠隨機(jī)選取3張切片，進(jìn)行免疫組化染色[8]，以檢測nestin在前腦SVZ的表達(dá)，切片以缺血側(cè)側(cè)腦室背外側(cè)角和側(cè)腦室外側(cè)壁為觀察部位，顯微鏡下放大400倍，照相機(jī)采集圖片，通過ImageJ軟件(http:// ImageJ.nih.gov)獲得面密度[9]。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

注：電針1組造模前電針ST40 7天，第8天模型組和電針1、2組用50%FeCl3濾紙貼敷左側(cè)MCA建立MCAT模型，假手術(shù)組用生理鹽水代替FeCl3。術(shù)后即刻開始電針ST40、GV20，以后每天一次，每次30分鐘，持續(xù)7天。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦缺血術(shù)后行為學(xué)檢測結(jié)果

術(shù)后1天，模型組動物飲食減少，體重減輕，右側(cè)上肢屈曲，部分出現(xiàn)身體向右傾斜的現(xiàn)象，無意識喪失癥狀。與模型組比較，電針1、2組NDS降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與電針2組相比較，電針1組神經(jīng)功能缺損有減輕趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 大鼠腦缺血術(shù)后1天NDS結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

2.2 大鼠腦缺血術(shù)后HE染色結(jié)果

腦缺血術(shù)后1天，假手術(shù)組缺血半暗帶皮層神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，核仁清晰，無胞漿紅染。模型組神經(jīng)元排列散亂，偶見胞漿紅染，細(xì)胞周圍間隙擴(kuò)大，部分血管紅細(xì)胞滲出，細(xì)胞核固縮、深染，核周出現(xiàn)空泡。電針治療后，缺血半暗帶膠質(zhì)水腫減輕，正常神經(jīng)元明顯增多，細(xì)胞空泡變性減少，組織形態(tài)趨于正常。見圖2。

2.3 大鼠腦缺血術(shù)后Nestin免疫組化染色結(jié)果

假手術(shù)組側(cè)腦室背外側(cè)角和側(cè)腦室外側(cè)壁Nestin陽性細(xì)胞數(shù)量較少，染色較淺，分布稀疏，陽性表達(dá)主要集中在側(cè)腦室外側(cè)壁。模型組缺血側(cè)側(cè)腦室背外側(cè)角染色加深，外側(cè)壁陽性細(xì)胞表達(dá)增厚，在室管膜下區(qū)聚集。與模型組比較，電針治療后，Nestin陽性反應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，電針1組更為明顯；Nestin陽性細(xì)胞沿著側(cè)腦室背外側(cè)伸展向外延伸在術(shù)后7天時(shí)更明顯。見圖3、圖4。

2.4 各組大鼠腦缺血術(shù)后Nestin面密度比較

與假手術(shù)比較，術(shù)后1、7天模型組側(cè)腦室背外側(cè)角和側(cè)腦室外側(cè)壁Nestin面密度均增加(P<0.01)。腦缺血術(shù)后1天，與模型組比較，電針1組側(cè)腦室背外側(cè)角(P<0.01)和側(cè)腦室外側(cè)壁Nestin面密度升高(P<0.01)，電針2組側(cè)腦室背外側(cè)角(P<0.05)和外側(cè)壁Nestin面密度也升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腦缺血術(shù)后7天，與模型組比較，電針1、2組側(cè)腦室背外側(cè)角Nestin面密度升高(P<0.01)，側(cè)腦室外側(cè)壁Nestin面密度也有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。電針1、2組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、表3。

圖2 各組大鼠腦缺血術(shù)后1天缺血半暗帶皮層組織形態(tài)觀察(HE染色，×400)

圖3 各組大鼠腦缺血術(shù)后Nestin在缺血側(cè)側(cè)腦室背外側(cè)角的表達(dá)(免疫組化染色，×400)

圖4 各組大鼠腦缺血術(shù)后Nestin在缺血側(cè)側(cè)腦室外側(cè)壁的表達(dá)(免疫組化染色，×400)

表2 各組大鼠腦缺血術(shù)后缺血側(cè)側(cè)腦室背外側(cè)角Nestin面密度比較

注：n為高倍鏡下視野數(shù)。與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

表3 各組大鼠腦缺血術(shù)后缺血側(cè)側(cè)腦室外側(cè)壁上段Nestin面密度比較

注：n為高倍鏡下視野數(shù)。與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

3 討論

缺血性中風(fēng)是死亡和長期殘疾的主要原因之一，臨床上西醫(yī)治療中風(fēng)常用的方法為溶栓[3]，而唯一獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的用于治療缺血性中風(fēng)的溶栓劑是重組組織纖溶酶原激活劑(recombinant tissue plasminogen activator，rtPA)。由于rtPA的治療范圍限制在癥狀發(fā)作時(shí)間開始3小時(shí)內(nèi)，療效有限，并且常常會導(dǎo)致顱內(nèi)出血[10]，這在很大程度上限制了rtPA的臨床應(yīng)用。鑒于其發(fā)病的廣泛性和對患者的破壞性影響，臨床上迫切需要治療缺血性中風(fēng)更好的方法。

再生策略，尤其是關(guān)于神經(jīng)再生的治療策略，為許多中風(fēng)患者提供了希望。神經(jīng)發(fā)生在成年大腦SVZ和海馬齒狀回的顆粒下層(subgranular zone，SGZ)長期存在[11]。哺乳動物的大腦包含神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells ，NSCs)，它們具有自我更新、增殖和分化成多種神經(jīng)細(xì)胞的能力[12]。當(dāng)大腦缺血時(shí)，SVZ的NSCs增殖、分化，并異位遷移到紋狀體和大腦皮層的缺血半暗帶中，隨后，產(chǎn)生新的神經(jīng)元來替代丟失的神經(jīng)細(xì)胞[13]。然而此類自發(fā)的神經(jīng)源性反應(yīng)是有限的，并不足以抵消由腦缺血引起的腦損傷。因此，采取能夠刺激內(nèi)源性NSCs增殖和分化的措施是非常重要的。通過針刺刺激NSCs的增殖、分化、遷移，可及時(shí)補(bǔ)充壞死凋亡的細(xì)胞，抑制缺血中心區(qū)范圍的擴(kuò)大，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。Nestin常在成年NSCs以及未成熟的神經(jīng)祖細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，并且在細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元等分化細(xì)胞后消失，常被用來標(biāo)記胚胎和成年大腦中的NSCs[14]。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血大鼠SVZ區(qū)的NSCs在造模后立即被激活，Nestin陽性細(xì)胞迅速增多，并在術(shù)后7天達(dá)到峰值[15]，針刺可使缺血側(cè)SVZ區(qū)Nestin表達(dá)水平增高，明顯促進(jìn)腦缺血損傷后內(nèi)源性NSCs的增殖[16- 17]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電針1、2組大鼠NDS較模型組明顯降低，缺血半暗帶膠質(zhì)水腫減輕，神經(jīng)元趨于正常，提示針灸療法可以促進(jìn)腦缺血損傷大鼠的功能恢復(fù)[18]。腦缺血術(shù)后，缺血側(cè)側(cè)腦室背外側(cè)角和外側(cè)壁Nestin陽性表達(dá)從1天開始增高，到術(shù)后7天達(dá)到高峰，腦缺血可能誘導(dǎo)SVZ區(qū)NSCs增殖，與既往文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。缺血前電針ST40，缺血后電針 ST40和GV20，能夠使SVZ區(qū)Nestin的表達(dá)增強(qiáng)，陽性細(xì)胞向側(cè)腦室背外側(cè)伸展延續(xù)；缺血前不進(jìn)行針刺預(yù)處理，僅在缺血后進(jìn)行電針治療同樣可以達(dá)到增強(qiáng)NSCs增殖、遷移的目的，但效果不如前者，提示持續(xù)的電針治療可能使缺血側(cè)SVZ區(qū)NSCs處于連續(xù)增殖狀態(tài)，并沿著側(cè)腦室背外側(cè)伸展遷移，從而達(dá)到修復(fù)損傷的目的。

綜上所述，電針ST40、GV20可以改善神經(jīng)功能，減輕缺血性腦損傷，促進(jìn)SVZ區(qū)NSCs增殖，達(dá)到腦損傷后神經(jīng)修復(fù)的目的；缺血前電針ST40，缺血后電針 ST40、GV20效果優(yōu)于缺血后電針 ST40、GV20。