袁 蓓 夏園園 呂亞男 張明超 趙 越 陳朝紅 曾彩虹

局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)屬于足細胞病,臨床主要表現為腎病綜合征，許多患者初始對激素治療敏感，復發(fā)后激素再治療常不敏感，或者初始就對激素治療不敏感，最終進展為終末期腎病(ESRD)[1-3]。FSGS的損傷不僅在足細胞，常伴不同程度腎小管間質的急性損傷[4]。東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院國家腎臟疾病臨床醫(yī)學研究中心前期研究顯示FSGS患者急性腎損傷(AKI)的發(fā)生率達44.4%[2]，而組織學不同程度的急性腎小管間質損傷達88%[1]。因此FSGS急性腎小管間質損傷是不容忽視的問題，而且影響患者對激素治療的敏感性[5]。雖然FSGS腎小管間質損傷機制已有大量相關研究，但其發(fā)生機制尚不清楚。血小板反應蛋白1(TSP-1)是一種細胞外基質聚糖蛋白，與不同配體或受體結合，在細胞的黏附、遷移、增殖、損傷修復、炎癥、血管形成過程中發(fā)揮重要作用[6]。在腎臟缺血再灌注損傷(IRI)所造成的AKI動物模型中發(fā)現腎小管TSP-1表達迅速增加[7]。因此本研究旨在探討FSGS伴急性腎小管間質損傷時，腎組織TSP-1及其受體信號調節(jié)蛋白α(SIRPα)的表達情況，并分析TSP-1表達與臨床病理的相關性。

對象和方法

研究對象納入2015年3月至2017年3月在國家腎臟疾病臨床醫(yī)學研究中心住院經腎活檢確診的FSGS，同時伴急性腎小管間質損傷的患者。入選標準：(1)尿蛋白定量>3.5 g/24h，血白蛋白<30 g/L；(2)特發(fā)性FSGS伴有急性腎小管間質損傷。排除標準如下:(1)合并藥物或感染相關小管間質性腎炎；(2)繼發(fā)性FSGS,如高血壓腎損害、肥胖相關腎損害、有機溶劑腎損害等；(3)中毒、創(chuàng)傷、感染、手術相關急性腎臟損傷；(4)其他:ESRD、常染色體顯性遺傳性多囊腎、腎移植、腫瘤、肝硬化、活動性感染等。并收集15例腎癌切除術患者的癌旁正常腎組織作為正常對照。

臨床資料收集患者病程、性別、年齡等一般資料，腎活檢時實驗室檢查指標，包括24h尿蛋白定量、血清白蛋白(Alb)、球蛋白(Glb)、血清肌酐(SCr)，尿視黃醇結合蛋白(RBP)和尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)等。

腎臟病理所有病例均在B超引導下行經皮腎穿刺活檢術，常規(guī)行光鏡、免疫熒光及電鏡染色。急性腎小管間質損傷的病理定義：腎組織皮質區(qū)非萎縮區(qū)域的腎小管急性損傷(近端小管上皮細胞細胞刷狀緣脫落、甚至壞死)，間質明顯的炎細胞浸潤，伴或不伴小管炎和(或)間質水腫。急性腎小管間質損傷程度根據腎小管間質病變累及范圍分級：<25%為輕度；25%～50%為中度；>50%為重度。

免疫組化檢測取腎組織石蠟切片，脫蠟入水，利用高壓鍋進行抗原修復，分別加入一抗TSP-1抗體(Santa Cruz)、SIRPα抗體(Abcam)，室溫孵育2h，PBS洗5 min，加入二抗室溫孵育30 min，PBS洗5 min，DAB顯色，蘇木素復染2 min，中性樹膠封片。利用徠卡Aperio數字病理系統(tǒng)(ScanScope AT Turbo)進行全切片掃描，手工圈出蛋白染色陽性區(qū)域和腎小管間質總區(qū)域，通過Aperio相關配套軟件計算出相應面積，并計算蛋白分子表達陽性率=(蛋白分子陽性表達面積/腎小管間質總面積)×100%。

統(tǒng)計學方法采用《SPSS19.0》軟件進行統(tǒng)計分析。以單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗對數據進行正態(tài)檢驗。所有計量資料，以均數±標準差或中位數(四分位間距)表示，組間比較應用方差分析或Kruskal-Wallis H檢驗；計數資料的組間比較采用卡方檢驗。正態(tài)分布數據采用Pearson相關系數，非正態(tài)分布數據采用Spearman相關系數評價變量間的相關性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

患者一般情況56例FSGS伴急性腎小管間質損傷患者的臨床資料見表1，其中以男性居多(占71.4%)。根據急性腎小管間質損傷程度分組，輕度組22例(39.29%)，中度組18例(32.14%)，重度組16例(28.57%)。重度組與輕中度組患者相比，病程更長,尿NAG、SCr明顯升高(P<0.05)。三組間蛋白尿并無差別。

腎組織TSP-1及SIRPα的表達正常腎組織中TSP-1免疫組化染色陰性(圖1A)，FSGS伴急性腎小管間質損傷患者TSP-1陽性表達主要集中于近端腎小管上皮細胞(圖1B)。切片掃描后，經過計算得出TSP-1表達陽性率見表2，急性腎小管間質損傷輕度組為14.41%±6.18%，中度組為10.03%±6.61%，重度組為13.78%±8.48%，不同組間TSP-1表達陽性率無明顯差異。正常腎臟組織中，SIRPα在腎小管間質及腎小球均有表達(圖1C)，其表達陽性率與FSGS伴不同程度急性腎小管間質損傷患者比較無明顯差異(表2)。

表1 局灶節(jié)段性腎小球硬化伴不同程度急性腎小管間質損傷患者的臨床資料比較

NAG:N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；RBP:視黃醇結合蛋白；AKI：急性腎損傷；△：輕度組vs中度組，P<0.05；#：中度組vs重度組，P<0.05；*：輕度組vs重度組，P<0.05

圖1 免疫組化染色TSP-1與SIRPα在正常(A、C，×200)及FSGS伴急性腎小管間質損傷(B、D，×200)腎組織中的表達TSP-1：血小板反應蛋白1；SIRPα:信號調節(jié)蛋白α;FSGS:局灶節(jié)段性腎小球硬化

TSP-1表達與臨床指標的相關性TSP-1表達陽性率與臨床指標進行雙變量相關性分析結果見表3。TSP-1表達陽性率與病程、尿RBP、尿蛋白定量、SCr呈負相關(P<0.05)。TSP-1表達陽性率與年齡、尿NAG、Alb、血脂無相關性。

將FSGS伴急性腎小管間質損傷的患者根據TSP-1表達陽性率分為兩組，<10%分為TSP-1低表達組20例(35.71%)；≥10%為TSP-1高表達組36例(64.29%)。兩組患者臨床及實驗室指標的比較見表4。TSP-1低表達組的病程、尿蛋白定量、SCr和尿RBP均明顯高于高表達組。其他指標兩組間無顯著差異。

表2 TSP-1與SIRPα腎小管表達陽性率比較

TSP-1：血小板反應蛋白1；SIRPα:信號調節(jié)蛋白α；#：與正常對照組比較，P<0.01

表3 TSP-1陽性率與臨床指標的相關性分析

TSP-1：血小板反應蛋白1；NAG：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；RBP：視黃醇結合蛋白

表4 TSP-1表達低組與高組臨床指標比較

TSP-1：血小板反應蛋白1；NAG：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；RBP：視黃醇結合蛋白

討 論

FSGS作為腎病綜合征的常見病因之一，占原發(fā)性腎小球疾病的比例近年呈上升趨勢，本中心發(fā)現，2003年至2014年對比1979年至2002年從6.00%上升到7.34%[8]。FSGS的病理類型具有多樣性，其臨床表現及對治療的反應不一，成為導致ESRD的常見原發(fā)性腎小球疾病之一[9]。FSGS作為足細胞損傷的疾病， 臨床上常伴AKI[2]，病理上常伴不同程度急性腎小管間質損傷[1]。本研究選擇病理上均伴急性腎小管間質損傷的FSGS病例，以輕度損傷組最多見(39.29%)，其次為中度組(32.14%)，重度組最少(28.57%)。與輕、中度損傷患者相比，重度損傷患者AKI病程較長,尿NAG、SCr較高，病情更嚴重。而輕度和中度組臨床表現無明顯差別，提示病理損傷嚴重程度有時和臨床腎功能損傷并不平行，也提示腎活檢的重要性，有利于判斷腎小管間質病理損傷的程度，從而指導治療。研究初始，考慮設置FSGS不伴急性腎小管間質損傷一組作為對照，由于本研究選擇的是尿蛋白>3.5 g/d FSGS的病例，實際觀察中發(fā)現這些患者在病理上均伴有不同程度腎小管間質急性損傷，很難確定FSGS不伴急性腎小管間質損傷，且病例數少，因此最終未設置這一組。在嘌呤霉素誘導的微小病變和FSGS模型中，也常伴小管間質的急性損傷，因此未設置病理不伴腎小管間質急性損傷的對照組。

已有研究表明腎病綜合征的腎小管間質損傷可能是由蛋白尿直接和間接毒性、細胞因子與生長因子造成的細胞外基質(ECM)合成分解平衡紊亂等多種原因所介導[10-11]。FSGS患者出現急性腎小管間質損傷可能與以上因素相關，也可能有其他機制參與。急性損傷時腎小管表達的分子在其中也可能起到一定作用。

TSP-1作為一種細胞外基質聚糖蛋白，可與不同配體或受體結合，在細胞增殖、損傷修復、炎癥、血管形成過程中發(fā)揮重要作用[6]。動物研究表明，腎臟缺血再灌注所造成的AKI模型，腎小管TSP-1表達迅速增加[7]。本研究主要觀察FSGS伴急性腎小管間質損傷患者腎組織中TSP-1及其受體SIRPα的表達情況，發(fā)現FSGS伴急性腎小管間質損傷時，近端腎小管上皮細胞中TSP-1表達增加，但在不同程度的急性腎小管間質損傷中TSP-1表達陽性率無顯著差異。提示腎小管間質損傷程度和TSP-1表達陽性率之間似乎不存在明顯相關性，TSP-1的表達量不適用于衡量急性腎小管間質的損傷程度。既往體外共培養(yǎng)研究提示，TSP-1可通過細胞間交互作用影響其他細胞。如成纖維樣基質細胞分泌的TSP-1通過作用于胃癌細胞上的Intervenolin，抑制胃癌細胞的增長[12]；基質中的TSP-1與內皮細胞的CD47相結合會影響NO合成，導致內皮細胞功能障礙[13]。所以，在FSGS伴急性腎小管間質損傷過程中，TSP-1作為一種細胞外基質，由腎小管上皮細胞產生后，可能不僅作用于腎小管上皮細胞，還可能通過與配體的結合，作用于管周毛細血管內皮細胞等其他細胞，并介導內皮細胞功能障礙，隨著時間的偏移，最終可能導致管周毛細血管的減少，影響間質纖維化。但是在人體內標本中探討腎小管分泌的TSP-1對其他細胞的作用存在一定難度，需要進一步體外和動物實驗來研究證實。

我們進一步觀察TSP-1的受體SIRPα在FSGS伴急性腎小管間質損傷中的表達。正常腎臟組織中SIRPα的表達量與FSGS伴不同程度急性腎小管間質損傷相比較，無明顯差異，提示FSGS患者發(fā)生急性腎小管間質損傷時，未能觀察到SIRPα表達量的變化，TSP-1是否可能通過其他受體或者配體介導了這一病理生理過程，需要進一步研究。

本研究發(fā)現TSP-1表達陽性率與病程、尿RBP、尿蛋白定量、SCr成負相關。并且按照TSP-1表達陽性率將患者分為TSP-1表達低組和TSP-1表達高組，發(fā)現TSP-1表達低組病程較長，尿蛋白定量、血肌酐、尿RBP均顯著高于TSP-1表達高組。提示在病程初期，也就是損傷的早期，SCr尚處于低水平時，腎臟組織TSP-1表達升高，隨著病程時間延長，TSP-1表達下降。這與動物實驗中，利用腎臟缺血再灌注損傷模擬AKI時，TSP-1在缺血再灌注3h即有表達升高，但在24h卻表達下降[7]，并且在24h，TSP-1的表達量與SCr成負相關的結果相吻合[14]。推測TSP-1表達量的上升可作為反映早期急性腎小管間質損傷新的組織學指標。

本研究是回顧性研究，未檢測FSGS伴急性腎小管間質損傷患者血液及尿液中TSP-1表達量變化。因為在血液中，TSP-1主要由血小板的α顆粒貯存及分泌，當凝血過程啟動，血小板則被激活，會釋放其α顆粒內貯存的TSP-1。且有研究表明血清作為凝血過程啟動的產物，其TSP-1濃度顯著高于血漿，約為血漿的100倍，反映的是血小板釋放的TSP-1的量，并不能作為有意義的循環(huán)中TSP-1的濃度[15]。故尚不能利用外周血和尿中TSP-1濃度的變化，作為發(fā)生急性腎小管間質損傷的早期指標。

小結：本研究初次探討了在FSGS伴急性腎小管間質損傷患者腎組織中TSP-1的表達變化及意義。FSGS伴急性腎小管間質損傷時腎小管TSP-1表達升高，表達陽性率的高低與腎功能損傷程度相關。