侯亞楠，王思堯，魏朝俊，楊 凱，萬 平*

(1.北京農(nóng)學院植物科學技術學院/農(nóng)業(yè)應用新技術北京市重點實驗室； 2. 北京農(nóng)學院生物與資源環(huán)境學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室；北京 102206)

小豆(Adzuki bean，Vignaangularis)，俗稱紅小豆、赤豆、赤小豆，起源于中國，栽培歷史悠久[1]。全球有30多個國家種植小豆，中國的栽培面積和總產(chǎn)量居世界首位[2-3]。小豆營養(yǎng)豐富，含有三萜、多酚、類黃酮等生物活性物質。三萜類化合物對植物生長發(fā)育和抗逆有重要作用，植物中已發(fā)現(xiàn)20 000多種三萜類化合物[4-5]；三萜還具有抗血小板、抗腫瘤、抗病毒、降低膽固醇、消炎及作為免疫佐劑等生理活性，在醫(yī)藥衛(wèi)生和保健方面有著較大的應用潛力，近年來成為國內(nèi)外生物和醫(yī)藥研究領域關注的熱點之一[6-7]。

小豆中的三萜皂苷是祛濕、消腫、抗炎的主要活性成分[8]。已報道小豆中有10種小豆皂苷[9-11]；其中的4種皂苷因含有2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮基團(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one，DDMP)，易受熱分解難以提取分離[10]，所以相關研究極少。已分離的6種小豆皂苷均屬于齊墩果烷型的三萜化合物，分別是小豆皂苷I(Azukisaponin I)、小豆皂苷II(Azukisaponin II)、小豆皂苷III(Azukisaponin III)、小豆皂苷IV(Azukisaponin IV)、小豆皂苷V(Azukisaponin V)和小豆皂苷VI(Azukisaponin VI)[9]；它們的總提取物對胰脂肪酶活性有抑制作用，并且抑制α-葡萄糖酶活性的能力高于大豆、綠豆、豇豆、利馬豆、豌豆、蠶豆和小扁豆[12]。

小豆皂苷提取方法有索氏提取法和浸泡法[8,12-13]，但均溶劑消耗大、工藝復雜、成本高、無法滿足多材料樣本的提取。有報道超聲波輔助浸泡法具有效率高、時間短、成本低廉、操作方便等優(yōu)點[14]，該方法已應用于小扁豆、大豆、羽扇豆和葫蘆巴的總皂苷提取[15]，但在小豆中未見相關應用。本試驗首次把超聲波輔助浸泡法應用于小豆皂苷提取，并對索氏提取法和超聲波輔助浸泡法的提取效率進行比較。

由于小豆皂苷I、小豆皂苷II、小豆皂苷III、小豆皂苷IV、小豆皂苷V和小豆皂苷VI這6種小豆皂苷沒有標準品出售，無法分別檢測，閆婕等以齊墩果酸為標準品，采用紫外分光光度法測定小豆總皂苷含量[8]，但由于這6種小豆皂苷的結構相似，紫外吸收波段相近，紫外分光光度法無法對其逐一定量分析。已有用液質聯(lián)用檢測小豆皂苷[13]，但仍未見用超高效液質聯(lián)用儀測定小豆皂苷的報道。本試驗參考液質聯(lián)用測定方法，開拓超高效液質聯(lián)用檢測小豆皂苷，優(yōu)化洗脫梯度和條件，提高檢測效率。小豆皂苷的提取、標準品制備和超高效液質聯(lián)用檢測方法的優(yōu)化，將為小豆種質資源中小豆皂苷成分含量測定、小豆皂苷高含量種質資源的篩選及育種應用、小豆皂苷代謝途徑優(yōu)異基因發(fā)掘利用、小豆皂苷藥理研究提供高效實用的檢測技術方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

小豆品種‘京農(nóng)6號’，由北京農(nóng)學院選育。

1.2 方 法

1.2.1 磨粉 用高速萬能粉碎機(YW-100，天津市泰斯特儀器有限公司)將‘京農(nóng)6號’籽粒磨粉(1 200 r/min)，過篩(150 μm)，40 ℃烘干至恒重，備用。

1.2.2 樣品溶液的制備 稱取 0.40 g豆粉置于10 mL試管中，加入 8 mL 90% 甲醇，40 ℃、40 KHz超聲提取90 min(PS-60AD，深圳市科潔超聲科技有限公司)，提取液0.45 μm膜過濾后供檢測分析。稱取1.00 g豆粉放入濾紙包內(nèi)，將濾紙包置于提取管中，向250 mL圓底燒瓶中加入100 mL甲醇回流提取3 次(每次1 h )，旋轉蒸發(fā)儀(RE-2000E，上海霓玥儀器有限公司)旋轉蒸發(fā)至干，用甲醇溶解并定容至20 mL，0.45 μm膜過濾供檢測分析。

1.2.3 色譜與質譜條件 測定儀器為三重四極桿液質聯(lián)用儀(Agilent 1290-G6470)，該系統(tǒng)配備Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱2.1 mm×50 mm，1.8 μm， 流動相為0.1%甲酸/水(A)和乙腈(B)。簡化洗脫條件為10% 乙腈至100% 乙腈 5 min線性梯度洗脫。柱溫25 ℃，流速0.4 mL/min，進樣量1 μL。電噴霧質譜(electrospray ionization-mass spectrometric，ESI-MS)分析，采用電離電壓3 500 V，源溫度350 ℃電噴霧電離；氮氣35 psi，氣體流速 10 L/min，負離子模式下對m/z760到m/z1140進行全掃描(MS2 scan)。在選擇離子監(jiān)測(SIM，Selected Ion Monitoring)檢測方式下，檢測兩種提取方法所得提取物的分子離子。在碎片離子掃描(Product Ion Scan)方式下，檢測提取物的碎片離子。

2 結果與分析

2.1 小豆皂苷分子離子定性分析

根據(jù)6種小豆皂苷的分子量，確認提取物中存在小豆皂苷I、小豆皂苷II、小豆皂苷III、小豆皂苷IV、小豆皂苷V和小豆皂苷VI，在小豆提取物的超高效液相色譜-電噴霧質譜(Ultra Performance Liquid Chromatography-electrospray Ionization Mass Spectrometric，UPLC-ESI-MS)的總離子色譜圖中標記小豆皂苷的6個峰(圖1)。簡化洗脫條件后，5 min內(nèi)完成檢測，節(jié)省流動相并提高檢測效率。

注：1是小豆皂苷IV；2是小豆皂苷VI；3是小豆皂苷V；4是小豆皂苷II；5是小豆皂苷I；6是小豆皂苷III。Note:1 is Azukisaponin IV; 2 is Azukisaponin VI; 3 is Azukisaponin V; 4 is Azukisaponin II; 5 is Azukisaponin I; 6 is Azukisaponin III.圖1 小豆提取物的UPLC-ESI-MS總離子色譜圖Fig.1 UPLC-ESI-MS total ion chromatograms of adzuki bean total extract

2.2 小豆皂苷碎片離子定性分析

通過比較保留時間、UPLC-ESI-MS 鑒定(圖1)和ESI-MS2(圖2)，峰1是小豆皂苷IV；峰2是小豆皂苷VI；峰3是小豆皂苷V；峰4是小豆皂苷II；峰5是小豆皂苷I；峰6是小豆皂苷III(表1)。

表1 小豆中鑒定6種小豆皂苷的UPLC-ESI-MS2數(shù)據(jù)Tab.1 UPLC-ESI-MS2 data of identification of six azukisaponins in adzuki bean

2.3 兩種提取方法的相對含量分析

以選擇離子監(jiān)測方式檢測的小豆皂苷積分面積為評價指標，超聲波輔助浸泡法提取的6種小豆皂苷的得率優(yōu)于索氏提取法，提取時間、提取液體積小于索氏提取法(表2)。采用超聲波輔助浸泡法可提高小豆皂苷得率，縮短提取時間，節(jié)省溶劑。

表2 超聲波輔助浸泡法與索氏提取法的比較(n=6)Tab.2 Comparison of extraction efficiency of sixazukisaponins by soxhlet extraction and ultrasonic-assisted extraction(n=6)

3 討 論

索氏提取法具有得率高、準確等特點，但索氏提取法提取時間長和成本高，難以應用于大量樣本的提取。本試驗比較索氏提取法和超聲波輔助浸泡法的得率，表明超聲波輔助浸泡法提取的6種小豆皂苷的得率優(yōu)于索氏提取法，且省時、成本低、操作方便，適合用于大規(guī)模種質資源樣本的小豆皂苷制備提取。

圖2 6種小豆皂苷質譜圖Fig.2 ESI (-) MS, MS2 spectra of identified six azukisaponins in adzuki bean

近年，高效液相色譜法開始廣泛用于三萜類化合物的定量和定性分析上[20]。Liu等使用Agilent 1100系列高效液相色譜儀檢測9種小豆類黃酮和6種小豆皂苷，使用10 mmol/L乙酸銨和乙腈進行梯度洗脫。初始條件為10%乙腈 10 min，30 min 變?yōu)?5%乙腈，45 min變?yōu)?5%乙腈，55 min變?yōu)?5%乙腈，60 min時45%乙腈, 70 min時55%乙腈。分析時間為90 min，其中小豆皂苷分析時間為25 min[13]。本試驗使用Agilent 1290-G6470三重四極桿液質聯(lián)用儀，簡化洗脫條件為10% 乙腈至100% 乙腈10 min線性梯度洗脫，在5 min內(nèi)完成對6種小豆皂苷的分離及測定，顯著提高檢測效率。

本試驗建立小豆超聲波輔助浸泡提取6種小豆皂苷的方法、確定超高效液質聯(lián)用檢測6種小豆皂苷的方法，為小豆皂苷提取、標樣制備和檢測提供高效技術方法，為進一步篩選小豆皂苷高含量的種質資源和生物強化育種利用以及相關產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎。