孔玄慶，張旭業(yè)，喻 快，歐曉明1，，3*，吳曉峰，李建明，金晨鐘，郭 軍

（1.湖南化工研究院國(guó)家農(nóng)藥創(chuàng)制工程研究中心/湖南省農(nóng)用化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410014；2.湖南人文科技學(xué)院/農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南婁底 417000；3.湖南加法檢測(cè)有限公司，長(zhǎng)沙 410014）

水稻是我國(guó)的主要糧食作物。近年來(lái)，由于勞動(dòng)力大量轉(zhuǎn)移至城市，農(nóng)村勞動(dòng)力嚴(yán)重短缺。在勞動(dòng)力不足的情況下，為保障糧食產(chǎn)量、促進(jìn)水稻的可持續(xù)生產(chǎn)，水稻直播技術(shù)正在大面積使用和推廣[1]。與傳統(tǒng)的栽插技術(shù)相比，水稻直播更容易發(fā)生病蟲草害。為保證水稻產(chǎn)量和品質(zhì)，農(nóng)藥的使用成為了不可或缺的環(huán)節(jié)。在不斷用藥的過(guò)程中，病蟲草均產(chǎn)生了相應(yīng)的抗性，且抗性逐漸增強(qiáng)。為達(dá)到同樣的防治效果，需要通過(guò)不斷增加用藥次數(shù)和用藥量的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。這導(dǎo)致環(huán)境污染日益加劇，稻田生態(tài)系統(tǒng)的平衡遭到嚴(yán)重破壞。

全球兩棲類動(dòng)物種群衰退現(xiàn)象十分嚴(yán)重，約1/3的兩棲動(dòng)物種類受到有害物質(zhì)的威脅[2]，有研究證明這些有害物質(zhì)包括農(nóng)藥[3]。蛙類是較常見的兩棲動(dòng)物，其數(shù)量的減少和種群的消失與除草劑和殺蟲劑的使用都有一定的關(guān)系[4]，Bradford等[5]通過(guò)在加利福利亞28個(gè)站點(diǎn)上兩次測(cè)量多種介質(zhì)中的農(nóng)藥濃度，驗(yàn)證了農(nóng)藥濃度與蛙類種群狀況（即某一地點(diǎn)2 km范圍內(nèi)適宜水體的比例） 呈負(fù)相關(guān)的假設(shè)。稻田中農(nóng)藥的大量使用，最直接受到影響的便是蛙類。在我國(guó)，黑斑蛙種群數(shù)量急劇減少，已于2004年4月30號(hào)被列入世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄[6]，其他蛙類數(shù)量也在急劇下降。蛙類在生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色，并且與人類關(guān)系越來(lái)越密切，在農(nóng)業(yè)生物防治中能食害蟲、保護(hù)作物，起到重要的作用，也是反映環(huán)境污染的前哨生物[7]。探討農(nóng)藥對(duì)蛙類的影響，對(duì)保護(hù)蛙類和環(huán)境具有重要的意義。

1 農(nóng)藥對(duì)蛙類的急性毒性研究

急性毒性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)農(nóng)藥對(duì)蛙類毒性的重要手段，以死亡情況為毒性終點(diǎn)，闡明不同農(nóng)藥劑量與效應(yīng)之間的關(guān)系，根據(jù)分析獲得的半致死濃度LC50進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)，可為慢性毒性、遺傳毒性等研究提供理論基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外關(guān)于不同農(nóng)藥對(duì)蛙類急性毒性的研究較多（表1），參照GB/T 31270.18—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[8]進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)同一農(nóng)藥對(duì)不同蛙類的毒性等級(jí)不同，可能是品種間的敏感性差異導(dǎo)致的。

表1 農(nóng)藥對(duì)蛙類的急性毒性結(jié)果

2 農(nóng)藥對(duì)蛙類毒性效應(yīng)研究

蛙類的生命周期從體外受精開始，經(jīng)歷受精卵、蝌蚪、幼蛙、成蛙4個(gè)過(guò)程，屬于變態(tài)發(fā)育。胚胎和幼體的生長(zhǎng)均在水中完成，且皮膚具有高透性，對(duì)農(nóng)藥敏感，在發(fā)育過(guò)程中易受到農(nóng)藥的脅迫，對(duì)蛙類的整個(gè)生命階段均會(huì)產(chǎn)生一定的毒性影響。

2.1 農(nóng)藥對(duì)蛙類生長(zhǎng)發(fā)育的影響

在農(nóng)藥的脅迫下，蛙類在不同的生命階段均呈現(xiàn)出抑制效應(yīng)，對(duì)整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程產(chǎn)生負(fù)面影響。在胚胎階段，農(nóng)藥的暴露會(huì)導(dǎo)致孵化時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)胚胎發(fā)育具有一定的抑制作用[22]。在蝌蚪階段，農(nóng)藥的暴露同樣也會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，賽林霖等[23]發(fā)現(xiàn)在0.40 μg/L的高效氯氰菊酯處理下，非洲爪蟾蝌蚪從第51期到完成變態(tài)發(fā)育所需時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組；肖永紅等[24]發(fā)現(xiàn)中華大蟾蜍蝌蚪的體長(zhǎng)、體寬、尾長(zhǎng)、尾寬和體質(zhì)量的增長(zhǎng)率均與草甘膦濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)，同時(shí)還能抑制運(yùn)動(dòng)頻率，并且對(duì)成體的撲食能力產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)；Babalola等[25]也發(fā)現(xiàn)草甘膦對(duì)蛙類蝌蚪生長(zhǎng)具有抑制效應(yīng)；馬瑜等[10]研究發(fā)現(xiàn)，敵百蟲能明顯抑制中國(guó)林蛙蝌蚪的生長(zhǎng)發(fā)育；王坤英等[26]發(fā)現(xiàn)噻嗪酮對(duì)黑斑蛙的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。胚胎和蝌蚪對(duì)農(nóng)藥的敏感程度也具有一定的差別，孔玄慶等[22]發(fā)現(xiàn)在雙唑草腈的脅迫下，非洲爪蟾胚胎較蝌蚪更為敏感；趙艷等[27]發(fā)現(xiàn)在丁草胺的脅迫下，胚后發(fā)育的毒性作用明顯強(qiáng)于胚胎發(fā)育。

農(nóng)藥對(duì)蛙類生長(zhǎng)發(fā)育的影響除了產(chǎn)生抑制效應(yīng)外，還會(huì)在蛙類生長(zhǎng)過(guò)程中誘導(dǎo)畸變效應(yīng)。一些野外調(diào)查表明兩棲類的畸形現(xiàn)象的確與包括農(nóng)藥在內(nèi)的污染物有關(guān)[28]。Babalola等[25]研究發(fā)現(xiàn)草甘膦對(duì)蛙類的致畸指數(shù)分別為1.7和1.6；劉迎等[14]發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥三唑磷、毒死蜱、乙草胺和丁草胺均能導(dǎo)致花姬蛙蝌蚪尾部出現(xiàn)彎曲；李賢賓等[29]也發(fā)現(xiàn)了乙草胺對(duì)熱帶爪蟾具有致畸效應(yīng)，表現(xiàn)為腹部水腫、面部畸形、脊柱彎曲；施時(shí)迪等[30]和盧祥云等[31]分別發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥對(duì)虎紋蛙和黑斑蛙產(chǎn)生的致畸表現(xiàn)為腹部膨大、尾部彎曲。當(dāng)蛙類出現(xiàn)畸變后，會(huì)影響其正常的取食、運(yùn)動(dòng)等生命活動(dòng)，最終導(dǎo)致死亡。

2.2 農(nóng)藥對(duì)蛙類器官的影響

蛙類長(zhǎng)期暴露在含有農(nóng)藥的水體中，農(nóng)藥會(huì)對(duì)蛙類體內(nèi)的鰓、肝臟、精巢、卵巢、膽囊等器官產(chǎn)生毒害作用。Allran等[32]發(fā)現(xiàn)阿特拉津能干擾非洲爪蟾器官的正常發(fā)育；Jaclyn等[33]發(fā)現(xiàn)阿特拉津質(zhì)量濃度大于200 μg/L時(shí)，對(duì)蛙類心肌形態(tài)產(chǎn)生負(fù)面影響，可能引起心臟組織收縮功能紊亂和功能障礙，對(duì)蛙類的存活和壽命均不利；馬瑜等[10]解剖蝌蚪發(fā)現(xiàn)，敵百蟲對(duì)蝌蚪器官的毒性效應(yīng)表現(xiàn)為鰓腔內(nèi)充水、內(nèi)鰓萎縮，從而影響蝌蚪的正常呼吸，肝臟、腸管和腎臟呈灰白色；黃敏毅等[34]研究發(fā)現(xiàn)，三氯殺螨醇對(duì)黑斑蛙的膽囊滲透壓具有一定的影響，滲透壓波動(dòng)范圍較大時(shí)，會(huì)引起膽道疾病，最終影響蛙類的新陳代謝；耿寶榮等[11]發(fā)現(xiàn)在敵敵畏和丁草胺處理下，沼蛙蝌蚪精巢體積分別縮小68.14%和68.27%，造成性腺發(fā)育缺陷；王丹丹等[35]報(bào)道了阿維菌素對(duì)黑斑側(cè)褶蛙肝臟損傷較大，損傷程度與藥劑濃度呈正相關(guān)。綜上所述，農(nóng)藥的脅迫可影響器官的各項(xiàng)生理功能，最終可導(dǎo)致呼吸、生殖、消化等系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)受到阻礙。

2.3 農(nóng)藥對(duì)蛙類抗氧化系統(tǒng)的影響

蛙類暴露于含有農(nóng)藥的水體中，農(nóng)藥會(huì)誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生。為維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、保護(hù)機(jī)體免受傷害，抗氧化系統(tǒng)將會(huì)清除氧自由基，以達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)這種平衡被打破，體內(nèi)氧自由基大量蓄積，會(huì)導(dǎo)致過(guò)氧化，對(duì)細(xì)胞造成損害。動(dòng)物在正常的生理狀態(tài)下，抗氧化系統(tǒng)能維持體內(nèi)氧自由基的平衡，其中抗氧化酶是組成抗氧化系統(tǒng)的主要成分，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、谷胱甘肽還原酶（GR）等。抗氧化系統(tǒng)對(duì)外界的脅迫比較敏感，其各種酶活性的變化常作為生態(tài)環(huán)境污染的監(jiān)測(cè)指標(biāo)[36]。SOD可以清除體內(nèi)過(guò)量的超氧自由基對(duì)不飽和脂肪酸的過(guò)氧化作用，從而維持細(xì)胞的正常代謝功能，CAT保護(hù)生物免受活性氧的損害，是一種催化H2O2分解成水和氧的抗氧化防御性功能酶，鐘碧槿等[37]研究發(fā)現(xiàn)三唑磷和乙酰甲胺磷對(duì)沼水蛙蝌蚪的SOD和CAT活性皆有一定的影響，因此這兩種有機(jī)磷農(nóng)藥不同程度地改變了沼水蛙蝌蚪抗氧化系統(tǒng)，造成毒害作用。T-AOC是衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)，其大小反映了機(jī)體清除自由基的能力，可以直觀地反映環(huán)境污染物對(duì)生物體的生理毒性影響，常作為檢測(cè)及評(píng)價(jià)污染物引起的機(jī)體生化效應(yīng)的一種重要生物標(biāo)志物[38-39]，鄭書梅等[40]等的研究表明，吡蚜酮會(huì)影響鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪抗氧化酶系統(tǒng)活性的變化，對(duì)抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生了毒性。黃修平等[41]研究發(fā)現(xiàn)，高效氯氰菊酯對(duì)中華蟾蜍蝌蚪的總抗氧化能力（T-AOC）具有一定的抑制作用，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。

2.4 農(nóng)藥對(duì)蛙類遺傳物質(zhì)的影響

農(nóng)藥對(duì)蛙類遺傳物質(zhì)的影響主要表現(xiàn)為對(duì)遺傳物質(zhì)DNA的損傷和染色體的損傷，也稱為遺傳毒性。其中DNA的損傷可通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)也稱彗星試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行鑒別[42]，染色體的損傷可通過(guò)微核試驗(yàn)來(lái)完成，彗星試驗(yàn)和微核試驗(yàn)在檢測(cè)污染物對(duì)蝌蚪的遺傳毒性方面具有較大的應(yīng)用價(jià)值[43]。李賢賓等[29]發(fā)現(xiàn)乙草胺能引起熱帶爪蟾蝌蚪血細(xì)胞的微核率升高和DNA的損傷，且隨著藥劑濃度的增加，DNA損傷程度增強(qiáng)；方曉清等[44]研究發(fā)現(xiàn)甲維鹽的劑量與鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪紅細(xì)胞損傷率及DNA損傷程度呈顯著的線性相關(guān)關(guān)系；王坤英等[26]也發(fā)現(xiàn)噻嗪酮對(duì)黑斑蛙外周血細(xì)胞DNA具有損傷效應(yīng)；鐘碧瑾等[43]發(fā)現(xiàn)三唑磷對(duì)沼水蛙蝌蚪具有遺傳損傷效應(yīng)，其中DNA的損傷具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，微核試驗(yàn)中同一染毒時(shí)間下，隨著三唑磷濃度的升高，蝌蚪的微核率和核異常率總體上隨之增加，在同一染毒濃度下，隨著染毒時(shí)間的增加，低質(zhì)量濃度組（≤0.4 mg/L）微核率呈升高趨勢(shì)，而高質(zhì)量濃度組（≥1.2 mg/L）微核率則先增加后降低；潘海乙等[45]發(fā)現(xiàn)吡蟲啉質(zhì)量濃度達(dá)到0.04 g/L時(shí)，紅細(xì)胞微核率及核異常率產(chǎn)生了極顯著的影響；南旭陽(yáng)等[46]和林小娜等[47]分別報(bào)道了除草劑精克草星制劑對(duì)牛蛙和澤蛙血紅細(xì)胞的影響，其主要成分為19.4%乙草胺和5.6%芐嘧磺隆，研究均發(fā)現(xiàn)血紅細(xì)胞微核率出現(xiàn)較大的變化，與對(duì)照組相比，皆達(dá)到了差異顯著水平。遺傳物質(zhì)含有蛙類全套遺傳信息，在農(nóng)藥的脅迫下，遺傳信息的表達(dá)可能受到影響，導(dǎo)致蛙類的生存受到不同程度的威脅，輕者發(fā)生發(fā)育受阻、突變，重者可導(dǎo)致死亡。

2.5 農(nóng)藥對(duì)蛙類繁殖能力的影響

蛙類繁殖能力與其生殖系統(tǒng)的健康與否有關(guān)。在農(nóng)藥的脅迫下，蛙類的生殖器官和兩性分化受到影響，從而影響其繁殖能力。李煥婷等[48]發(fā)現(xiàn)西瑪津可能與阿特拉津一樣能夠通過(guò)雌性化/去雄性化作用影響非洲爪蟾睪丸的發(fā)育；秦曉飛等[49]研究發(fā)現(xiàn)乙草胺也對(duì)非洲爪蟾的睪丸發(fā)育有抑制雄性化作用和雌性化作用，睪丸發(fā)育不良會(huì)影響雄性非洲爪蟾產(chǎn)生精細(xì)胞受到影響，影響受精的完成，甚至是喪失生育能力；黃敏毅等[50]發(fā)現(xiàn)三氯殺螨醇能降低黑斑蛙精子活力，減少精子總數(shù)，增加精子畸形率，影響黑斑蛙的繁殖和種群發(fā)展；Tavera-Mendoza等[51-52]報(bào)道阿特拉津能夠嚴(yán)重影響兩棲動(dòng)物非洲爪蟾的睪丸和卵巢的性別分化，Hayes[53-54]等報(bào)道環(huán)境劑量的阿特拉津能導(dǎo)致雄性非洲爪蟾和野外豹蛙的雌雄同體現(xiàn)象；王棟等[55]發(fā)現(xiàn)敵百蟲可促進(jìn)非洲爪蟾卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂的發(fā)生，但高劑量可能通過(guò)對(duì)細(xì)胞毒性等其他生理作用，影響卵母細(xì)胞最終成熟，從而影響蛙類的繁殖。

3 展 望

20世紀(jì)80年代以來(lái)，國(guó)外逐漸加強(qiáng)開展了環(huán)境污染物對(duì)蛙類的影響研究，并建立相關(guān)的保護(hù)機(jī)制，但國(guó)內(nèi)關(guān)于農(nóng)藥對(duì)蛙類影響的深入研究相對(duì)較少。相關(guān)研究人員應(yīng)開展更深層次、更系統(tǒng)化的研究，從宏觀到微觀，從個(gè)體到分子水平，為探索不同農(nóng)藥對(duì)蛙類的致毒機(jī)理提供依據(jù)，為維持水生態(tài)系統(tǒng)平衡和保護(hù)蛙類提供更多的理論依據(jù)和指導(dǎo)作用。