張建濤 ，蔣麗紅，陳明子，王 婷，董奕含，范宏剛

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

與傳統(tǒng)手術(shù)相比，腹腔鏡手術(shù)具有視野清晰、出血少、術(shù)后恢復(fù)時間短等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用獸醫(yī)臨床實(shí)踐[1]，在動物疾病診斷和治療過程中發(fā)揮重要作用[2-3]。通常需連續(xù)向腹腔內(nèi)注入CO2，提供充足腹腔鏡手術(shù)空間，手術(shù)結(jié)束后排出CO2，造成機(jī)體缺血再灌注損傷，影響生理功能[4]。腎臟由于血供豐富，最易受影響，缺血再灌注損傷導(dǎo)致的急性腎衰竭已成為腹腔鏡手術(shù)常見并發(fā)癥。缺血損害器官，再灌注則導(dǎo)致大量自由基產(chǎn)生，抑制機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷[5]。外科手術(shù)過程常選擇低氣腹壓灌注和缺血預(yù)處理[6-7]，但對減輕氣腹對機(jī)體損傷效果不理想。

研究指出，氫氣具有抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，可顯著改善腦缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激損傷[8]，氫氣治療作用在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域成為全新的研究方向。因此，本試驗(yàn)探究氫氣對CO2氣腹引起的腎臟缺血再灌注性損傷的保護(hù)作用，并初步闡明其機(jī)制，為臨床上減輕CO2氣腹所致腎臟損傷提供一種可選擇的保護(hù)方法，促進(jìn)腹腔鏡外科和氫氣醫(yī)學(xué)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及分組

15 只體重250～300 g 雄性Wistar 大鼠，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動物學(xué)部提供，大鼠飼喂標(biāo)準(zhǔn)化鼠糧，不限制飲水，試驗(yàn)過程中保持飼養(yǎng)環(huán)境不變。

試驗(yàn)動物隨機(jī)分為3 組，分別為對照組（C）、氣腹組（P15）和氫氣組（H2），每組各5 只大鼠。C組大鼠僅維持麻醉90 min；P15 組為CO2氣腹組，氣腹壓力維持15 mmHg，時間為90 min；H2組于氣腹前10 min皮下注射氫氣（0.2 mL·kg-1），10 min后建立CO2氣腹，并維持15 mmHg氣腹90 min。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：紫外分光光度計(jì)（美國Thermo 公司），熒光定量PCR 儀（美國Roche，Light Cycler 2.0），成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，Tanon 5200）

試劑：肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）和過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒（購自南京建城生物工程研究所）；PrieScriptTMRT 試劑盒和SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ試劑盒（購自大連TaKaRa 公司）；Trizol 試劑（購自美國Invitrogen）；Nrf2 一抗（購自武漢愛博泰克生物科技有限公司），HO-1和NQO1一抗（購自美國Abcam 公司），Bax，Bcl-2 和Caspase-3一抗（購自沈陽萬類生物公司）；HRP-山羊抗兔IgG（購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司）：ECL試劑盒（購自碧云天生物技術(shù)公司）；其他常規(guī)藥品及試劑均為國產(chǎn)。

1.3 血液和組織樣本采集

放氣后2 h斷頭處死大鼠。收集血樣，分離血清并于-20 ℃下保存，用于腎功能檢測。取大鼠腎臟，分為3部分，一部分固定于10%福爾馬林，制作病理組織學(xué)切片；一部分在冷鹽水中勻漿，上清液存儲于-20 ℃，用于檢測肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)；第三部分放于液氮中速凍并存儲于-80 ℃，用于相關(guān)基因和蛋白檢測。

1.4 生化分析

根據(jù)檢測試劑盒說明檢測血清中Cr 和BUN 含量及腎臟組織勻漿中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、SOD、GSH、CAT含量。

1.5 組織病理學(xué)檢查

將固定在10%福爾馬林中的腎臟修剪合適尺寸，于包埋盒中流水沖洗過夜，梯度脫水、透明、浸蠟，包埋后切片、脫蠟，HE 染色，光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織病理學(xué)變化。

1.6 熒光定量PCR

采用qRT-PCR方法開展基因水平檢測。Trizol試劑從腎臟中提取總RNA，使用PrieScriptTMRT 試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)產(chǎn)品說明書，使用SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ，在LightCycler 2.0中實(shí)時定量PCR。具體引物（見表1）由TaKaRa 合成。反應(yīng)參數(shù)如下：95 ℃持續(xù)30 s，45 個循環(huán)在95 ℃持續(xù)5 s，引物特異性退火溫度持續(xù)20 s，并在72 ℃延伸20 s。使用2-ΔΔCt方法分析相對mRNA表達(dá)。

1.7 蛋白質(zhì)印跡

將冰凍腎臟組織在RIPA∶PMSF（1 000∶1）裂解液中，充分裂解勻漿。將勻漿于4 ℃下12 000 g離心20 min，取上清，BAC蛋白試劑盒測定上清中蛋白質(zhì)含量。將每個樣品中等量蛋白質(zhì)（30 μg）加入5×上樣緩沖液，100 ℃變性5 min。冷卻后，開展后續(xù)Western blot試驗(yàn)。

采用Western blot 技術(shù)檢測相關(guān)蛋白表達(dá)。按照說明書使用SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒配制凝膠。點(diǎn)樣，接通電源，80 V，30 min分離上層膠，120 V，60 min分離下層膠；取出凝膠板，采用濕轉(zhuǎn)方法，300 mA，40～80 V下，將蛋白帶轉(zhuǎn)移至NC 膜上；將NC 膜在37 ℃，5%脫脂乳中封閉2 h。將NC膜；置于含有一抗的稀釋液中4 ℃孵育過夜，再用二抗HRP-山羊抗兔IgG在37 ℃孵育2 h。使用ECL試劑盒對信號可視化處理，并使用成像系統(tǒng)掃描印跡，imagine Pro-plus 6.0讀取蛋白灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析。與C 組相比，“*”代表P<0.05；“**”代表P<0.01；與P15 組相比，“#”代表P<0.05，“##”代表P<0.01。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 血清Cr和BUN水平

與C 組相比，P15 和H2組氣腹后血清BUN 和Cr 水平極顯著升高（P<0.01）。但與P15 組相比H2組BUN和顯著降低（P<0.05，見圖1）。

2.2 腎臟組織病理學(xué)變化

C 組的腎組織未顯示任何明顯病理變化（見圖2A）。P15 組，CO2氣腹導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞周圍明顯液泡變性（見圖2B）；H2組觀察到相似組織學(xué)變化，但損傷變形程度較?。ㄒ妶D2C）。

圖1 血清中BUN及Cr含量Fig.1 Serum BUN and Cr levels

2.3 腎臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)變化

與C 組相比，P15 組和H2組血清中MDA 極顯著升高（P<0.01），血清中GSH 和CAT 極顯著下降（P<0.01），H2 組GSH 和CAT 極 顯 著 降 低（P<0.01），SOD 顯著降低（P<0.05）；與P15 組相比，血清中MDA、SOD、GSH和CAT均差異極顯著（P<0.01，見圖3）。

圖2 腎臟組織病理學(xué)變化（200×）Fig.2 Histopathological changes of kidney

圖3 腎臟組織中MDA、SOD、GSH和CAT含量Fig.3 MDA,SOD,GSH and CAT levels in kidney tissues

2.4 Nrf2信號通路基因和蛋白的表達(dá)水平

與C 組 相 比，P15 組Nrf2、HO-1 和NQO1 mRNA水平顯著上調(diào)（P<0.05）；在H2干預(yù)氣腹過程后，Nrf2、HO-1 和NQO1 mRNA 進(jìn)一步升高，與P15組相比，差異顯著（P<0.05）。蛋白表達(dá)結(jié)果證實(shí)實(shí)時PCR結(jié)果（見圖4）。

2.5 Bax/Bcl-2和Caspase-3基因和蛋白表達(dá)

與C 組相比，氣腹后Bax/Bcl-2 和Caspase-3 mRNA 表達(dá)極顯著增加（P<0.01），H2組Bax/Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著下降（P<0.05），Caspase-3 mRNA表達(dá)顯著升高Caspase-3 mRNA；與P15 組，H2組Bax/Bcl-2 和Caspase-3 mRNA 表達(dá)差異（P<0.01）極顯著。蛋白表達(dá)結(jié)果驗(yàn)證基因表達(dá)結(jié)果（見圖5）。

2.6 炎性細(xì)胞因子基因和蛋白表達(dá)

與C 組相比，P15 和H2 組腎臟組織中TNF-α，ICAM-1 和NF-κBp65 mRNA 表達(dá)均極顯著升高（P<0.01），P15 組IL-10 mRNA 表達(dá)極顯著下降（P<0.01），而H2組IL-10 mRNA 表達(dá)顯著下降（P<0.05）；與P15 組相比，ICAM-1 和IL-10 mRNA 表達(dá)差異均極顯著，NF-κBp65和TNF-α mRNA表達(dá)差異不顯著（P>0.05）。蛋白表達(dá)結(jié)果與基因表達(dá)結(jié)果一致（見圖6）。

圖4 腎臟中Nrf2、HO-1、NQO1基因和蛋白表達(dá)Fig.4 Nrf2,HO-1 and NQO1 genes and proteins expression in the kidney

圖5 腎臟中Bax/Bcl-2和Caspase-3基因和蛋白質(zhì)表達(dá)Fig.5 Bax/Bcl-2 and Caspase-3 genes and protein expression in the kidney

圖6 腎臟中TNF-α、ICAM-1、IL-10和NF-κBp65基因和蛋白質(zhì)表達(dá)Fig.6 TNF-α,ICAM-1,IL-10 and NF-κBp65 genes and proteins expression in the kidney

3 討 論

腎臟通過腎動脈由腹主動脈供應(yīng)血液，血流量大，血供豐富。在腹腔鏡手術(shù)期間，由于CO2氣腹壓迫腎臟血管，使腎主動脈、腎段動脈、葉間動脈、腎主靜脈、腎段靜脈、葉間靜脈血液流速明顯變慢[9]，腎臟缺血、缺氧，當(dāng)CO2氣腹肖除且血液循環(huán)恢復(fù)正常時，血液被氧氣重新灌注，導(dǎo)致組織和器官缺血再灌注損傷[10]。李維等發(fā)現(xiàn)隨氣腹壓升高，腎臟病理組織學(xué)在形態(tài)上發(fā)生改變，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，影響腎功能[11]。臨床上氣腹壓較高可使腎臟BUN和Cr顯著升高[12]。與本試驗(yàn)結(jié)果一致，在氣腹壓15 mmHg 時，造成腎臟功能損傷，但氣腹前皮下注射H2干預(yù)后BUN和Cr水平得到改善，組織病理結(jié)果顯示腎小管上皮損傷減輕，說明皮下注射H2可減輕CO2氣腹后腎損傷程度。

H2在生物體抗氧化防御機(jī)制中具有重要作用[13]。外源H2補(bǔ)充劑可治療慢性氧化應(yīng)激相關(guān)疾病[14]。Nrf2 及其下游調(diào)控基因HO1和NQO1 為調(diào)控抗氧化反應(yīng)的重要基因，在氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[15-16]。SOD、CAT 和GSH 通過清除過氧化物和其他自由基，減少脂質(zhì)過氧化并消除受傷細(xì)胞和組織維持氧化及抗氧化平衡。MDA 為細(xì)胞膜不飽和脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物，為氧化應(yīng)激敏感指標(biāo)。試驗(yàn)顯示CO2氣腹后Nrf2，HO-1和NQO1上調(diào)，表明CO2氣腹誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激觸發(fā)體內(nèi)抗氧化反應(yīng)，使MDA 顯著升高，SOD，GSH 和CAT 含量顯著下降，引起腎臟氧化應(yīng)激損傷。但H2干預(yù)后，與氣腹組相比，Nrf2，HO-1 和NQO1 進(jìn)一步顯著升高，MDA 顯著下降，SOD、GSH 和CAT 含量顯著升高，減輕機(jī)體腎臟組織氧化損傷。與胡英等N-乙酰半胱氨酸可有效預(yù)防長時間氣腹誘發(fā)氧化應(yīng)激所致的腎功能損害結(jié)論一致[17]。

炎癥反應(yīng)為缺血再灌注損傷機(jī)制之一，在缺血再灌注損傷過程中活性氧（ROS）的產(chǎn)生，激活NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子及炎癥細(xì)胞因子，包括TNFα，IL-6 和ICAM-1 在內(nèi)表達(dá)上升，IL-10 表達(dá)下降[18-19]。TNF-α和IL-6為促炎因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，IL-10為一種抗炎細(xì)胞因子，抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生，ICAM-1是重要粘附因子，促進(jìn)炎癥細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞粘附增強(qiáng)，這幾種因子共同作用引發(fā)炎癥反應(yīng)[20-21]。本試驗(yàn)應(yīng)用氫氣干預(yù)氣腹過程后，抑制ICAM-1 和TNF-α分泌，增加IL-10 分泌，表明氫氣干預(yù)氣腹具有保護(hù)性抗炎作用，可減輕腎臟損傷，保護(hù)腎功能。

缺血再灌注可激活腎臟組織內(nèi)細(xì)胞凋亡通路，導(dǎo)致腎臟損傷[22]。Bcl-2 和Bax 為細(xì)胞凋亡重要介體，細(xì)胞中Bax/Bcl-2 為細(xì)胞凋亡指標(biāo)，其增加代表細(xì)胞凋亡。外在凋亡途徑由胞質(zhì)中胱天蛋白酶的活化介導(dǎo)，活化Caspase-3水平為細(xì)胞凋亡指標(biāo)[23]。李維等指出高氣腹壓力可導(dǎo)致Caspase-3和Bax/Bcl-2 表達(dá)升高，使腎臟組織細(xì)胞凋亡[11]。陳貝貝等發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)處理后Bax/Bcl-2 顯著下降，說明氣腹造成的腎臟組織細(xì)胞凋亡可以通過預(yù)處理得到緩解[24]。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)Caspase-3 和Bax/Bcl-2 表達(dá)升高，說明氣腹造成腎臟組織細(xì)胞凋亡，H2干預(yù)后腎臟組織細(xì)胞凋亡緩解。