黃鳳君 李佳皓 劉瑞林 余麗萍 王西瑤 李立芹

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130；2. 作物科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，成都 611130）

鉀素是植物生長所必須的營養(yǎng)元素之一，參與植物多種生理生化反應(yīng)過程，與植物的生長發(fā)育緊密相關(guān)。馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）作為我國第四大糧食作物，是典型的喜鉀植物，鉀素的吸收和利用與馬鈴薯的產(chǎn)量和質(zhì)量直接相關(guān)［1］。植物對(duì)鉀的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)主要依靠低親和性鉀離子通道和高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體。按照結(jié)構(gòu)和功能，鉀離子通道蛋白分為：Shaker 家族通道、TPK 通道及Krilike 通道［2］。鉀離子通道AKT1 影響植物的生長發(fā)育，與植物的抗旱、耐鹽性及抗病性有關(guān)［3］。鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體分為：KUP/HAK/KT 轉(zhuǎn)運(yùn)體、HKT/TrK 轉(zhuǎn)運(yùn)體、CHX 轉(zhuǎn)運(yùn)體及KEA 轉(zhuǎn)運(yùn)體［4］，其中KUP/HAK/KT家族是一類H+/K+同向轉(zhuǎn)運(yùn)的高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，能介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鉀的積累［4-5］。根據(jù)該家族基因的序列同源性分為：Cluster Ⅰ、Cluster Ⅱ、Cluster Ⅲ和 Cluster Ⅳ四個(gè)不同的亞家族，而 Cluster Ⅰ成員大部分屬于高親和性鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體；Cluster Ⅱ中的該家族多為低親和性鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體；Cluster Ⅲ和 Cluster Ⅳ成員多為高親和性鉀轉(zhuǎn)體［6］。KUP /HAK /KT 家族基因已在多種植物中被分離和克隆，擬南芥中鑒定出13 個(gè)［7］；水稻中27 個(gè)［8］；番茄中19 個(gè)［9］；桃中17 個(gè)［8］；木薯中21 個(gè)［10］。在擬南芥中，AtKUP1被證實(shí)介導(dǎo)根部細(xì)胞吸收外界K+，為雙親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)［11］；AtKUP7、AtKUP12為高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體［12-13］。PpeKUP11和PpeKUP1基因分別在桃花開放和果實(shí)發(fā)育過程中主導(dǎo) K+的吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)［14-15］；PpeKUP5主導(dǎo)桃樹根部 K+吸收的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體［16］。

目前，該家族在馬鈴薯的研究報(bào)道相對(duì)較少，張子義等［17］的研究表明，鉀離子濃度為0.1 mmol/L、1.0 mmol/L 及10.0 mmol/L 時(shí)StKUP6和StKUP7表達(dá)存在不同程度的上調(diào)，1.00 mmol/L 時(shí)，StKUP6和StKUP7表達(dá)上調(diào)最明顯。本研究采用同源克隆的方法，從馬鈴薯品種費(fèi)烏瑞它中克隆得到一個(gè)StKUP12基因，運(yùn)用生物信息學(xué)對(duì)其結(jié)構(gòu)、序列特征、進(jìn)化規(guī)律等進(jìn)行分析；利用qRT- PCR 技術(shù)對(duì)該基因的表達(dá)進(jìn)行分析；最后利用鉀營養(yǎng)缺陷型酵母的功能互補(bǔ)，初步研究該基因的鉀吸收功能，旨為該基因在鉀營養(yǎng)方面的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試馬鈴薯品種為費(fèi)烏瑞它（Solanum tuberosumL. Favorita），組培苗由本實(shí)驗(yàn)室提供。主要試劑包括：Vazyme Biotech 的感受態(tài)大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA 凝膠純化回收試劑盒、克隆載 體pMD19-T、10× Loading Buffer、Trizol、Gold View Ⅰ型核酸染色劑，其中2× Taq PCR Master Mix和cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa。酵母表達(dá)載體P416 和鉀吸收營養(yǎng)缺陷型酵母菌株R5421 由本實(shí)驗(yàn)室提供，測序與引物合成由上海生工生物股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 非生物脅迫材料處理 供試馬鈴薯品種為費(fèi)烏瑞它。將組培苗接種于MS 培養(yǎng)基，25℃恒溫光照培養(yǎng)室培養(yǎng)30 d，挑選長勢一致的組培苗，洗凈根部原有的MS 培養(yǎng)基，分別接種到低鉀（10 μmol/L K+）、高鹽（200 mmol/L NaCl）、脫落酸（1 μmol/L ABA）以及聚乙二醇（5% PEG-6000）培養(yǎng)基，放于25℃恒溫光照培養(yǎng)箱，分別在處理時(shí)間為0 h、3 h、6 h、12h和24h的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行整株取樣，液氮速凍，放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2StKUP12基因的克隆 馬鈴薯苗在25℃恒溫光照培養(yǎng)室培養(yǎng)60d后，選擇長勢較好的葉片進(jìn)行取樣，液氮速凍，保存在-80℃?zhèn)溆?。參考GenBank 收錄的馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）StKUP12序列（XM_006340052.1.），采用同源克隆的方法，Premier5.0 軟件設(shè)計(jì)全長引物StKUP12-F 和StKUP12-R（表1，下劃線為BamHI和SalI酶切位點(diǎn)序列），擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸2 min 40 s；35 個(gè)循環(huán)。目的片段純化后與pMD19-T 載體16℃下連接過夜，轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α，隨后在含有氨芐青霉素（Ampicillin）的LB 固體平板上進(jìn)行篩選，利用菌落PCR 檢測篩選出陽性克隆，送往上海生工生物股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 StKUP12 生物信息學(xué)分析 采用ExPASy ProtParam tool分析StKUP12的理化性 質(zhì)；ExPaSy-ProScale 分析該蛋白的親疏水性；NetPhos 3.1 Server分析蛋白磷酸化位點(diǎn)；利用NCBI 網(wǎng)站的CDD 程序分析蛋白的同源結(jié)構(gòu)域；利用MEGA5.0 軟件，以鄰近分析法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4StKUP12基因的表達(dá)分析 分別對(duì)馬鈴薯費(fèi)烏瑞它塊莖的芽眼、愈傷15d的原種頂芽以及正常生長60d馬鈴薯植株的根、莖、葉進(jìn)行取樣，在液氮中速凍后-80℃保存?zhèn)溆?。利用Trizol 法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA 進(jìn)行qRT- PCR。用Premier5.0設(shè)計(jì)Real-Time PCR 引物StKUP12-qF 和StKUP12-qR（表1），以馬鈴薯的EF1ɑL作為內(nèi)參。反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5℃反應(yīng)30 s；95℃反應(yīng)5 s；52℃反應(yīng)30 s。所有的樣品均設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用 2-ΔΔCt方法。

表1 引物名稱及序列

1.2.5StKUP12基因轉(zhuǎn)化酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn) 將克隆載體StKUP12-pMD19-T 與表達(dá)載體P416 進(jìn)行BamHI和SalI雙酶切，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)后，挑選單菌落進(jìn)行菌落PCR 檢測法，篩選構(gòu)建成功的陽性克隆，送往上海生工生物股份有限公司進(jìn)行測序。將構(gòu)建成功的酵母表達(dá)載體P416-StKUP12轉(zhuǎn)入鉀吸收缺陷型釀酒酵母菌株R5421，取200 μL 轉(zhuǎn)化混合物鋪于營養(yǎng)缺陷型平板，30℃培養(yǎng)3d后，用PCR 鑒定酵母的陽性克隆。挑選鑒定過的酵母單菌落在營養(yǎng)缺陷型平板上劃線，30℃培養(yǎng)3d后，用牙簽蘸取少量菌體進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，調(diào)OD600為0.8，分別稀釋10 倍、100 倍和1 000 倍后，各取4 μL 于正常和鉀缺陷（2.25 mmol/L、0.12 mmol/L）的AP 培養(yǎng)基，3 次重復(fù)，28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2-3d后觀察酵母的生長情況。

2 結(jié)果

2.1 StKUP12基因的克隆

提取馬鈴薯葉片的R NA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在2 000-3 000 bp 的位置上有清晰明亮的條帶（圖1）。將該條帶回收純化后與pMD19-T 載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，利用菌落PCR 鑒定陽性克隆，隨機(jī)挑選3 個(gè)陽性克隆送測序。結(jié)果顯示，3 個(gè)陽性克隆測序結(jié)果一致，目的片段長度為2547 bp。

2.2 StKUP12生物信息學(xué)分析

圖1 StKUP12 基因的克隆

2.2.1 StKUP12 的理化性質(zhì)及親疏水性分析 理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，該基因編碼848 個(gè)氨基酸，其中亮氨酸Leu（97，1.4%）含量最高；其次為絲氨（76，9.0%），而色氨酸（11，3%）含量最少。帶正電荷氨基酸（Arg+Lys）74 個(gè)，帶負(fù)電荷氨基酸（Asp+Glu）77 個(gè)。StKUP12 蛋白的分子式為 C4294H6726N1080O1193S44，分子量大小為93.9 kD，理論等電點(diǎn)pI 為6.59，不穩(wěn)定系數(shù)為39.57，脂肪系數(shù)為104.35，表明其屬于穩(wěn)定的酸性蛋白。在親疏水性序列譜中，默認(rèn)疏水氨基酸為較高的打分值（打分值＞0 代表疏水性，打分值＜0 代表親水性），結(jié)果顯示，該蛋白預(yù)測親水性的平均值（GRAVY）僅為0.329，存在14 個(gè)高打分峰值（scare＞2.0），最低值在第600-700 位氨基酸域；最高值在500-600 位氨基酸域（圖2），結(jié)合 GRAVY 值推測該蛋白為疏水性蛋白。

圖2 StKUP12 親疏水區(qū)預(yù)測

2.2.2 StKUP12 的磷酸化位點(diǎn)及同源結(jié)構(gòu)域分析 磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，該蛋白磷酸化位點(diǎn)數(shù)量較多、分布廣。共包含49 個(gè)Ser 磷酸化位點(diǎn)、19個(gè)Thr 磷酸化位點(diǎn)和9 個(gè)Tyr 磷酸化位點(diǎn)（圖3-A）。結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析結(jié)果顯示，該蛋白的第103-676 位氨基酸序列區(qū)為K+轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，屬于K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族（圖3-B）。

圖3 StKUP12 的磷酸化位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.2.3 StKUP12 的氨基酸序列同源性分析 選擇20個(gè)不同物種的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，該蛋白與潘那利番茄KUP12、番茄KUP12 具有較高的氨基酸序列同源性（98.00%、97.88%），與巴西橡膠樹KUP12 的同源性最低（77.74%）。另外，該蛋白與潘那利番茄、番茄、辣椒、煙草、美花煙草、芝麻、歐洲橄欖、胡蘿卜及咖啡樹的KUP12 蛋白在一個(gè)進(jìn)化組（圖4）。

2.3 StKUP12的組織表達(dá)分析

采用qRT-PCR 反應(yīng)分析該基因的組織表達(dá)情況，LSD法P＜0.05水平下進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，StKUP12基因在根、莖、葉、頂芽和芽眼均有表達(dá)，表達(dá)量在莖、葉和頂芽3 個(gè)組織中較高；其次是芽眼，分別是根的1.75、2.08、2.50 和1.63 倍（圖5）。

2.4 StKUP12的非生物脅迫表達(dá)分析

采用qRT-PCR 反應(yīng)分析該基因在4 種脅迫處理下的表達(dá)情況，在LSD 法P＜0.05 水平下進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果表明，低鉀脅迫處理后該基因表達(dá)量明顯上調(diào)，24h內(nèi)呈先上升后下降的趨勢，在脅迫12h后表達(dá)量達(dá)到最大且為對(duì)照組的32.86 倍（圖6-A）。ABA 脅迫處理后該基因表達(dá)量先顯著上調(diào)后受到抑制，在脅迫3h后表達(dá)量達(dá)到最大且為對(duì)照組的2.49倍，隨后表達(dá)量明顯下降（圖6-B）。高鹽脅迫處理后該基因表達(dá)量受到抑制，在脅迫6h后表達(dá)量最低且為對(duì)照組的0.36 倍（圖6-C）。PEG 脅迫處理后該基因表達(dá)量上調(diào)，24h內(nèi)呈先上升后下降的趨勢，在脅迫處理6h后表達(dá)量最大且為對(duì)照組的2.62 倍（圖6-D）。

2.5 StKUP12參與鉀營養(yǎng)的功能研究

取轉(zhuǎn)化成功的酵母，振蕩培養(yǎng)16h后，轉(zhuǎn)移到低鉀和正常的AP 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)觀察，結(jié)果表明，在正常的AP 培養(yǎng)基上，表達(dá)StKUP12 和AtAKT1的酵母在4 種稀釋濃度下均正常生長，而轉(zhuǎn)P416 的酵母在100、1 000 倍稀釋濃度生長緩慢；在鉀缺陷的AP 培養(yǎng)基上，表達(dá) AtAKT1 和StKUP12 的酵母均能正常生長，而轉(zhuǎn)P416 酵母不能生長。結(jié)果表明，StKUP12 轉(zhuǎn)運(yùn)體能恢復(fù)鉀吸收營養(yǎng)缺陷型酵母在低鉀條件下的K+吸收功能，在酵母中具有吸收外界 K+的能力（圖7）。

圖4 StKUP12 進(jìn)化樹分析

圖5 StKUP12 在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量分析

3 討論

圖6 StKUP12 在非生物脅迫條件下的表達(dá)模式分析

圖7 酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

生物信息學(xué)分析結(jié)果預(yù)測StKUP12編碼蛋白為一個(gè)穩(wěn)定的酸性疏水蛋白，具有多個(gè)絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，韓敏等［12］對(duì)AtKUP7蛋白3 個(gè)磷酸化位點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)對(duì)該基因的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)活性發(fā)揮著一定的作用，說明StKUP12蛋白具有磷酸化位點(diǎn)，能被激酶磷酸化，從而參與生理過程的調(diào)控。該基因編碼蛋白的第103-676 位氨基酸序列屬于K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族結(jié)構(gòu)域，表明StKUP12 蛋白可能參與鉀離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。

已有報(bào)道表明，AtKUP12在嫩葉中表達(dá)量較 高［13］，AtKUP4在植物根中的表達(dá)較強(qiáng)［18］，NsHAK11在各組織器官中均有表達(dá)，在主根中的表達(dá)量最高［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，StKUP12基因在組織中均有明顯的表達(dá)，其中在莖、葉、頂芽表達(dá)較高，與AtKUP12的表達(dá)一致［13］。StKUP12基因的表達(dá)受到低鉀脅迫的誘導(dǎo)，處理12h時(shí)表達(dá)量達(dá)到對(duì)照組的32.86 倍，與AtKUP3、AtHAK5等受低鉀誘導(dǎo)表達(dá)情況一致［20-21］，推測該基因參與馬鈴薯低鉀脅迫的響應(yīng)。該基因的表達(dá)在ABA 脅迫下先顯著誘導(dǎo)后受到抑制，而宋志忠等［16］的實(shí)驗(yàn)表明PpeKUP5在ABA 脅迫下表達(dá)上調(diào)，推測是由于兩個(gè)研究所用的ABA 處理濃度不同。HAK/KUP/KT 家族在鹽脅迫下受到 Ca2+信號(hào)、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)激素（如乙烯、ABA 和生長素）等的調(diào)控［22］，StKUP12基因在鹽脅迫下表達(dá)受到抑制，而AtKUP2、AtKUP3及AtKUP6的表達(dá)受鹽脅迫的誘導(dǎo)［23］，可能是由于基因和材料的差異造成。干旱是影響植物生長和發(fā)育的一個(gè)重要因素，該基因的表達(dá)在PEG 脅迫下受到誘導(dǎo)，與獐茅的AlHAK1基因響應(yīng)干旱脅迫的結(jié)果一致［24］，推測該基因參與馬鈴薯對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。

利用酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)，韓敏等［12］證明了AtKUP7具有鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性，楊天元等［25］發(fā)現(xiàn)OsHAK5表現(xiàn)為高親和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)特性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在正常的AP 培養(yǎng)基中3 種酵母可以正常生長；在鉀缺陷的AP 培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)StKUP12和陽性對(duì)照的酵母可以正常生長，而陰性對(duì)照的酵母不能正常生長，表明StKUP12 在酵母中具有轉(zhuǎn)運(yùn)外界K+的功能，與韓敏［12］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。后續(xù)可通過構(gòu)建過表達(dá)或CRISPR 基因編輯載體轉(zhuǎn)化馬鈴薯，獲得轉(zhuǎn)基因材料，進(jìn)一步明確該基因在鉀營養(yǎng)方面的功能。

4 結(jié)論

本研究利用同源克隆的方法獲得了StKUP12，生物信息學(xué)分析預(yù)測該基因編碼一種穩(wěn)定的酸性疏水蛋白，該蛋白存在鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，屬于鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體。表達(dá)分析結(jié)果說明，StKUP12在組織中均有明顯的表達(dá)，表達(dá)量在莖、葉、頂芽3 個(gè)組織中較高；其次是芽眼，最后是根。其表達(dá)量受低鉀、高鹽、ABA 和PEG 的調(diào)控，其中在低鉀和PEG 脅迫下表達(dá)受到誘導(dǎo)，在高鹽和ABA 脅迫下表達(dá)受到抑制。酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，該轉(zhuǎn)運(yùn)體能恢復(fù)鉀吸收缺陷型酵母在低鉀培養(yǎng)基上生長的能力。