劉鵬 岑妍慧 林江 梁忠秀 蘭太進(jìn) 韓絲銀 陳振興

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)創(chuàng)新綜合實(shí)驗室，南寧 530200）

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）主要分布在熱帶及亞熱帶近海岸地區(qū)，為嗜溫、嗜鹽、嗜堿型革蘭氏陰性細(xì)菌，是一種重要的人-魚共患致病菌［1］。2006 年8 月，Emerging infectious diseases雜志將創(chuàng)傷弧菌列入最危險的細(xì)菌行列。該菌通過污染的海產(chǎn)品（尤其是生蠔、海洋貝類產(chǎn)品）或傷口接觸感染人類，嚴(yán)重危及人類生命［2-3］。創(chuàng)傷弧菌可導(dǎo)致皮膚起泡潰爛、壞死性筋膜炎、敗血癥、急性腸胃炎和感染性休克，55%以上的敗血癥患者在發(fā)病48 h內(nèi)因多器官功能衰竭而死亡；免疫功能低下的患者屬于易感人群，尤其是有基礎(chǔ)性疾病的患者，如慢性肝炎、肝硬化、酗酒和遺傳性血色沉著病，以及有慢性疾病如糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎衰和淋巴瘤患者，嚴(yán)重感染該病原體的風(fēng)險較高［4］。另男性相比女性更易發(fā)生感染，占比86%，是女性的6 倍。且在男性群體中，創(chuàng)傷弧菌傾向于感染年長男性（＞40 歲）［5］。且值得注意的是，最近有越來越多的報道顯示健康宿主通過傷口感染創(chuàng)傷弧菌。

對于感染創(chuàng)傷弧菌患者，在大部分情況下，必須通過外科手術(shù)來清理創(chuàng)口，避免創(chuàng)傷弧菌快速增殖［6］。目前對創(chuàng)傷弧菌的致病機(jī)理并不明了，但可以肯定的是，其原因是多方面的。如創(chuàng)傷弧菌具有多種公認(rèn)的毒力因子，如溶血素、彈性蛋白酶、莢膜多糖、脂多糖和膠原酶等［7］。此外，毒素多功能自動重復(fù)序列（Multifunctional-autoprocessing repeatsin-toxin，MARTX）毒素亦存在于創(chuàng)傷弧菌中，在其致病性中承擔(dān)重要角色，創(chuàng)傷弧菌可利用MARTX毒素蛋白抵抗宿主免疫防御，使細(xì)菌在宿主體內(nèi)增殖擴(kuò)散［8］。

上述毒力因子大部分都是蛋白質(zhì)，可見蛋白質(zhì)的翻譯質(zhì)量對于細(xì)菌的生存、毒力等方面發(fā)揮重要作用。而幾乎所有的原核微生物中，均有一套由轉(zhuǎn)移信使RNA（Transfer-messenger RNA，tmRNA）和小蛋白B（Small molecular protein B，SmpB）介導(dǎo)的反式翻譯系統(tǒng)。細(xì)菌主要通過該系統(tǒng)確保蛋白質(zhì)翻譯質(zhì)量，對致病菌的毒力因子的表達(dá)、維持細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)態(tài)和在逆境下的生存能力等方面發(fā)揮著非常重要作用［9］。因此本研究以海洋致病菌創(chuàng)傷弧菌為研究對象，對其反式翻譯系統(tǒng)核心蛋白SmpB 進(jìn)行基因克隆及原核表達(dá)，旨為后續(xù)進(jìn)一步研究SmpB 蛋白與創(chuàng)傷弧菌致病性之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑 創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27526，購自上海士鋒生物科技有限公司；E. coliDH5αD、E. coliBL21 菌株以及含pET-28a載體的大腸桿菌，均為實(shí)驗室保存菌株；卡那霉素、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside；IPTG）購自碧云天生物技術(shù)研究所；Pfu mix DNA 聚合酶、高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；PCR 產(chǎn)物回收試劑盒購自江蘇溥博生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I-HF、XhoI、T4 DNA 連接酶購自NEB公司；引物及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備 NanoDropTMOne/Onec微量紫外可見光分光光度計，美國Thermo Scientific 公司；THZ-300C 型恒溫?fù)u床（可制冷）、上海一恒科學(xué)儀器有限公司；XY-SH-150- ⅢY-SH-150-XY-JH-11C型個人型單面超凈臺，上海昕儀儀器儀表有限公司；T100 型梯度PCR 儀、GelDoc XR+型全自動凝膠成像系統(tǒng)、PowerPac Universal 型通用電泳儀、1658001小型垂直電泳槽，美國Bio-Rad 公司；HE-120 多功能水平電泳槽，南京普陽科學(xué)儀器研究所；YXQLS-100A 型內(nèi)循環(huán)立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 創(chuàng)傷弧菌基因組DNA 的提取 創(chuàng)傷弧菌富含莢膜多糖，使用常規(guī)DNA 提取方法無法有效獲取基因組DNA。因此，參照侯衛(wèi)國等［10］的文獻(xiàn)，采用LiCl 沉淀法提取創(chuàng)傷弧菌基因組DNA。提取后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，以及使用NanoDropTMOne/Onec微量紫外可見光分光光度計（美國Thermo Scientific 公司）測定基因組DNA 濃度及純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫公布的V.vulnificusCECT 4999菌株smpB基因序列（NZCP014636），使用Oligo6軟件設(shè)計一對引物：F：5'-CGGAATTCATGGCAAAGAAAAATTCAAAAC-3'和R：5'-CCGCTCGAGACGCAGCGAGCTCTTCATC-3'，在引物5'端分別添加原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a 多克隆位點(diǎn)中所包含的EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)及對應(yīng)的保護(hù)堿基，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3smpB基因的擴(kuò)增 以創(chuàng)傷弧菌基因組DNA為模板，利用Pfu DNA 聚合酶PCR 擴(kuò)增smpB基因，其片段大小為486 bp。PCR 反應(yīng)體系為：2×Pfu mix 25 μL，SmpB-F（10 μmol/L）1 μL，SmpB-R（10 μmol/L）1 μL，創(chuàng)傷弧菌基因組DNA1μL，ddH2O 22 μL，反應(yīng)總體積為50 μL。瞬間離心混勻，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30 個循環(huán)，72℃后延伸5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并使用PCR 產(chǎn)物回收試劑盒純化回收。

1.2.4 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將純化回收的PCR 產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pET-28a 分別經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切，再使用PCR 產(chǎn)物回收試劑盒純化回收酶切片段，酶切載體片段與酶切目的片段按1∶3的比例，進(jìn)行T4 DNA 連接酶4℃過夜酶連，連接產(chǎn)物經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)入E. coliDH5αDH5αli 產(chǎn)物經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)入，酶切載50 μg/mL 卡那霉素的LB 固體平板上，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到新的含卡那霉素的LB 平板上，進(jìn)行菌落PCR 驗證，擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。挑取陽性克隆子，接種到5 mL 含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 對測序獲得的smpB基因序列，使用DNAMAN 9.0 軟件進(jìn)行翻譯，獲得其氨基酸序列；使用ExPASy ProtParam 在線工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析SmpB 蛋白的理化性質(zhì)，TMHMM 2.0 在線工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析跨膜區(qū)域；使用SignalP 3.0 在線信號肽預(yù)測工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）進(jìn)行信號肽預(yù)測；使用NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進(jìn)行磷酸位點(diǎn)分析；使用JPred 4.0（http：//www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/）預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，Swiss-Model 對其高級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；最后通過String 蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測網(wǎng)站（https：//string-db.org/），預(yù)測創(chuàng)傷弧菌SmpB 蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6 SmpB 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將測序正確的重組原核表達(dá)質(zhì)粒熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，復(fù)蘇涂布到含50 μg/mL 卡那霉素的LB固體平板上，挑取陽性克隆子，轉(zhuǎn)接到5 mL 含50 μg/mL 的LB 液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，按1%的比例轉(zhuǎn)接到200 mL 含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)3-4 h，待OD600達(dá)到0.4-0.6 時，加入IPTG 至終濃度為100 μmol/L，25℃振蕩誘導(dǎo)表達(dá)5 h，同時設(shè)置不加IPTG 誘導(dǎo)劑組，最后均4℃4000 r/min 離心10 min，收集菌體，加入適量預(yù)冷PBS 懸浮，在冰水條件下進(jìn)行超聲破碎，破碎功率為300 W，工作時間5 s，間歇時間6s，全程時間45 min。4℃ 12 000 r/min 離心10 min，收集上清及沉淀，進(jìn)行12% SDS-PAGE 凝膠電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)傷弧菌基因組DNA提取

按照侯衛(wèi)國等［10］的文獻(xiàn)報道提取海洋創(chuàng)傷弧菌基因組DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照，結(jié)果如圖1，條帶清晰無雜質(zhì)，使用NanoDropTM One/Onec 微量紫外可見光分光光度計檢測基因組DNA 的OD260/OD280和OD260/OD230分別為1.83 和2.22，表明其純度較好，濃度為 28.4 ng/μL，可用于后續(xù)實(shí)驗。

2.2 創(chuàng)傷弧菌smpB基因擴(kuò)增

圖1 創(chuàng)傷弧菌基因組DNA 電泳圖

創(chuàng)傷弧菌smpB基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見約486 bp 的特異條帶，大小與預(yù)期一致，如圖2。使用PCR 產(chǎn)物回收試劑盒純化回收PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)NanoDropTM One/Onec微量紫外可見光分光光度計檢測，其質(zhì)量濃度為101.5 ng/μL，OD260/OD280和OD260/OD230值各 為1.83和2.35，滿足后續(xù)實(shí)驗要求。

圖2 創(chuàng)傷弧菌smpB 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將創(chuàng)傷弧菌smpB基因PCR 產(chǎn)物雙酶切片段和pET-28a 雙酶切片段進(jìn)行T4 DNA 連接酶酶連后，熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 后，復(fù)蘇后涂布到50 μg/mL 卡那霉素的LB 固體平板上培養(yǎng)，對長出來的單菌落使用通用載體引物進(jìn)行菌落PCR 驗證，結(jié)果如圖3，1-3 號，5-8 號可見約800 bp 的特異條帶，包含目的基因及載體部分片段，其大小與預(yù)期一致，為目的陽性克隆子。挑取陽性克隆子，接種到含卡那霉素的LB 培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒測序，測序結(jié)果表明，克隆的smpB基因序列與GenBank 報道的序列一致，表明成功構(gòu)建好原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-SmpB。

圖3 陽性克隆子菌落PCR 鑒定電泳圖

2.4 生物信息學(xué)分析

DNAMAN 9.0 軟件翻譯測序獲得的smpB基因序列，獲得其氨基酸序列如圖4，共161 個氨基酸。與GenBank 報道的創(chuàng)傷弧菌smpB基因序列一致。

ExPASy ProtParam 在線分析軟件分析SmpB 蛋白的分子式為C808H1331N247O230S7，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量約為18.41 kD，理論等電點(diǎn)為10.28。SmpB 蛋白含18 個帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（天冬氨酸和谷氨酸）及33 個帶正電荷的氨基酸殘基（精氨酸和賴氨酸）。其蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為35.02＜40，為穩(wěn)定蛋白，總平均親水性（GRAVY）為-0.635＜0，表明該蛋白為親水蛋白。TMHMM 結(jié)果顯示SmpB 蛋白并不形成跨膜結(jié)構(gòu)，主要定位于胞質(zhì)溶膠中。NetPhos 3.1 結(jié)果表明SmpB 蛋白可能含有11 個磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸7 個、蘇氨酸3 個、酪氨酸1 個。我們使用Jpred4預(yù)測了創(chuàng)傷弧菌SmpB 蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示主要由7 個β 折疊、3 個α 螺旋組成，如圖5-A。同時，以恥垢分枝桿菌Mycobacterium smegmatis SmpB 電子顯微鏡結(jié)構(gòu)為模板（PDB ID：5zeyC），Swiss-Model預(yù)測的SmpB 高級結(jié)構(gòu)如圖5-B，其中核心結(jié)構(gòu)為5個β 折疊組成，C 端30 個氨基酸形成α 螺旋。

String 方法對創(chuàng)傷弧菌SmpB 蛋白進(jìn)行互作預(yù)測結(jié)果顯示，SmpB 蛋白與10 種蛋白質(zhì)存在相互作用，其中50S 核糖體蛋白L19（50Sribosomal protein L19，RplS）、苯丙氨酸t(yī)RNA 合成酶A 氨酸iphenylalanyl-tRNA synthetase subunit alpha，PheS）、核糖核酸酶R（Ribonuclease R，RNase R）與SmpB蛋白互作比較顯著（圖6）。

圖4 創(chuàng)傷弧菌smpB 核苷酸序列及推測的氨基酸序列

圖5 創(chuàng)傷弧菌SmpB 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)

SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果顯示，可見pET-28a-SmpB 的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物在25 kD 附件有一條特異蛋白條帶（圖7），雖然表觀分子量要大于理論分子量，分析可能是融合了6 個組氨酸標(biāo)簽，組氨酸是堿性氨基酸，具有強(qiáng)正電荷，會改變SmpB 蛋白在SDSPAGE 凝膠中的泳動，降低其泳動速率，導(dǎo)致出現(xiàn)滯后現(xiàn)象，表觀分子量在一定范圍內(nèi)變大［11］。

圖6 創(chuàng)傷弧菌SmpB 相互作用蛋白預(yù)測

圖7 創(chuàng)傷弧菌SmpB 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE 凝膠電泳圖

3 討論

創(chuàng)傷弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽細(xì)菌和機(jī)會性人類病原體，可引起原發(fā)性敗血癥和傷口感染［12］。由于其廣泛存在于近海和海灣區(qū)域，一些生蠔、貝類等海洋產(chǎn)品可能受到創(chuàng)傷弧菌的污染，人們一旦生食，或者傷口接觸到這樣的海產(chǎn)品，均可能導(dǎo)致感染，對人們的健康帶來巨大威脅［13］。目前創(chuàng)傷弧菌已成為全球最危險的海產(chǎn)食品病原體，其生物安全危害程度分級為3-4 級［14］。并且隨著全球氣溫變暖，海洋溫度上升，創(chuàng)傷弧菌感染發(fā)生率逐步上升［15］。因此深入研究創(chuàng)傷弧菌致病機(jī)制，尋找抗菌靶標(biāo)，研發(fā)有效的疫苗具有重要意義。尤其是近年來越來越多研究報道，創(chuàng)傷弧菌對多種抗菌藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，開發(fā)新型抑菌靶標(biāo)，研究新型抑菌藥物變得更為迫切。

而幾乎在所有的原核生物中，均存在一套由tmRNA-SmpB 介導(dǎo)的反式翻譯系統(tǒng)，確保細(xì)菌蛋白翻譯質(zhì)量［16］。細(xì)菌在正常生長條件和逆境條件下，均有可能發(fā)生基因轉(zhuǎn)錄錯誤，mRNA 受損，翻譯移碼錯誤等問題。一旦出現(xiàn)mRNA 畸變，缺乏正常終止密碼子，核糖體會卡在mRNA 鏈的3'端，無法釋放下來，所產(chǎn)生的新生不完整肽鏈，會導(dǎo)致細(xì)菌中毒，同時占用了細(xì)菌中數(shù)量有限的核糖體，影響細(xì)菌的生長及毒力水平，而反式翻譯系統(tǒng)就是糾正mRNA翻譯畸變的一種主要的修復(fù)方式，通過其核心分子tmRNA 和SmpB 進(jìn)行滯留核糖體的拯救，通過對新生的肽鏈加上一段10 個氨基酸長度的標(biāo)簽肽，被體內(nèi)的管家蛋白酶識別水解掉，從而使滯留的核糖體釋放下來，使核糖體、tRNA 等重新合成蛋白。此外除了翻譯質(zhì)量控制以外，反式翻譯系統(tǒng)對細(xì)菌的耐壓、基因調(diào)控表達(dá)、毒力水平以及生長水平等方面也起到重要作用［17］。

許多報道均表明反式翻譯系統(tǒng)核心分子SmpB蛋白在細(xì)菌發(fā)病過程中起著重要作用。如Baumler等［18］報道鼠傷寒沙門氏菌SmpB 突變體在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力出現(xiàn)降低，Okan 等［19］也報道假結(jié)核耶爾森菌SmpB 突變體，在巨噬細(xì)胞中的生存能力和增殖能力均下降，并且表現(xiàn)出對小鼠無毒現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)SmpB 突變體在毒力效應(yīng)蛋白的表達(dá)和分泌方面具有嚴(yán)重缺損?？傊?，SmpB 蛋白對于細(xì)菌毒力具有非常重要作用。而在創(chuàng)傷弧菌中，關(guān)于SmpB對于其毒力調(diào)控或致病機(jī)制方面的研究尚無相關(guān)報道，因此本研究通過克隆創(chuàng)傷弧菌smpB基因，構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒，并成功可溶性表達(dá)，為后續(xù)重組蛋白SmpB 的純化，以及深入研究SmpB 蛋白互作、SmpB 與創(chuàng)傷弧菌致病性之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，并為尋找抗創(chuàng)傷弧菌的新靶點(diǎn)提供一定的實(shí)驗數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

成功克隆創(chuàng)傷弧菌反式翻譯系統(tǒng)smpB基因，并成功構(gòu)建pET-28a-SmpB 原核表達(dá)重組質(zhì)粒，在E. coliBL21（DE3）中可以大量可溶性表達(dá)。