古炳明

(梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所，廣東 梅州 514071)

大黃是中國(guó)傳統(tǒng)的中藥，收載于2015版《中國(guó)藥典》一部，來(lái)源于寥科植物掌葉大黃palmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim，ex Balf.或藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根和根莖[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，關(guān)于大黃主要活性物質(zhì)的研究中對(duì)蒽醌類(lèi)成分的研究最多，蒽醌類(lèi)成分的平均總量約為3%～5%，以游離型蒽醌類(lèi)和結(jié)合型蒽醌類(lèi)兩種形式存在[2-3]。在2015版《中國(guó)藥典》中，大黃含量測(cè)定采用以甲醇作為溶劑，回流1h的方法對(duì)蒽醌類(lèi)成分進(jìn)行提取，此法操作較繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，工作效率較低。高速勻漿法是先將物料與提取溶劑混合后，利用勻漿儀內(nèi)流體力學(xué)和高速機(jī)械剪切刀的工作，將物料研磨成均勻的糊狀物，從而達(dá)到粉碎與提取有效成分的目的[4]。此方法粉碎效果好，具有工作效率高、能耗低、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。目前關(guān)于高速勻漿法提取大黃蒽醌類(lèi)成分的工藝研究未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)旨在利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法找尋一種節(jié)能、高效、操作便利的提取工藝以提高工作效率，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)過(guò)程報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀；Agilent ZORBAX SB-C18柱：(4.6 mm×250 mm，5 μm，SN：USCL054036)；Sartorius BP211D電子分析天平(十萬(wàn)分之一)；AB204-N電子分析天平(萬(wàn)分之一)；ULUP-I-10T純水系統(tǒng)；IKA高速勻漿機(jī)；IKA中藥材粉碎機(jī)。

1.2 試藥與試劑

大黃素(批號(hào)：110756-200110，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)；大黃(批號(hào)：17040910，安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司)；甲醇(批號(hào)：503332-08444，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司出品，河北四友卓越科技有限公司制造)，磷酸(批號(hào)：20160520，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)均為色譜純；水為超純水；甲醇(批號(hào)：20170301-2，廣州化學(xué)試劑廠)，乙醇(批號(hào)：20170702-2，廣州化學(xué)試劑廠)，乙酸乙酯(批號(hào)：20161201-2，廣州化學(xué)試劑廠)均為分析純。試驗(yàn)用大黃均經(jīng)梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所陳繁華副主任中藥師鑒定為藥典來(lái)源大黃。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱：(4.6 mm×250 mm，5 μm，SN：USCL054036)；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫箱溫度為30 ℃；進(jìn)樣體積10.0 μL，理論塔板數(shù)按大黃素計(jì)算應(yīng)不少于3 000[1]。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取大黃素對(duì)照品10.85 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取8 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即可得對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取大黃粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置燒杯中，精密加入甲醇25 mL，提取3 min，轉(zhuǎn)速10 000 r/min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即可得供試品溶液。

2.4 對(duì)照品及樣品測(cè)定

分別按“2.1.2”“2.1.3”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品、供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。見(jiàn)圖1 。

注：1．大黃素

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 提取溶劑對(duì)有效成分的影響 取大黃粉末(過(guò)四號(hào)篩)，精密稱取3份各0.5 g，分別精密加入甲醇、乙醇、乙酸乙酯各25 mL，勻漿3 min，轉(zhuǎn)速10 000 r/min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定大黃素含量，平行6次，求平均值。甲醇提取的大黃素含量最高。

2.5.2 勻漿轉(zhuǎn)速對(duì)有效成分的影響 取大黃粉末(過(guò)四號(hào)篩)，精密稱取6份各0.5 g，精密加入甲醇25 mL，勻漿3 min，轉(zhuǎn)速分別為6 000 r/min、8 000 r/min、10 000 r/min、12 000 r/min、14 000 r/min、16 000 r/min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定大黃素含量，平行6次，求平均值。當(dāng)勻漿轉(zhuǎn)速為10 000r/min時(shí)，大黃素含量最高。

2.5.3 勻漿時(shí)間對(duì)有效成分的影響 取大黃粉末(過(guò)四號(hào)篩)，精密稱取6份各0.5 g，置燒杯中，精密加入甲醇25 mL，轉(zhuǎn)速10 000 r/min，勻漿提取時(shí)間分別為1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定大黃素含量，平行6次，求平均值。當(dāng)勻漿時(shí)間為4 min時(shí)，大黃素含量最高。

2.5.4 溶劑體積對(duì)有效成分的影響 取大黃粉末(過(guò)四號(hào)篩)，精密稱取9份各0.5 g，分別精密加入甲醇10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL、35 mL、40 mL、45 mL、50 mL，提取4 min，轉(zhuǎn)速10 000 r/min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定大黃素含量，平行6次，求平均值。當(dāng)甲醇體積為40 mL時(shí)，大黃素含量最高。

2.5.5 溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)有效成分的影響 取大黃粉末(過(guò)四號(hào)篩)，精密稱取6份各0.5 g，分別精密加入體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%、100%的甲醇40 mL，提取4 min，轉(zhuǎn)速10 000 r/min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。平測(cè)定大黃素含量，平行6次，求平均值。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，大黃素含量最高。

2.6 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化大黃中大黃素勻漿提取工藝

2.6.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì) 經(jīng)單因素考察確定溶劑為甲醇，以勻漿轉(zhuǎn)速、時(shí)間、甲醇體積及甲醇體積分?jǐn)?shù)(%)為考察因素，以大黃素含量為響應(yīng)值，每個(gè)因素設(shè)5個(gè)水平，并以-2、-1、0、1、2表示自變量的水平高低，按表1方案試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 勻漿提取星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素及水平

表2 勻漿提取大黃中大黃素試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.6.2 結(jié)果分析 采用Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行處理，以勻漿轉(zhuǎn)速(A)、時(shí)間(B)、甲醇體積(C)和甲醇體積分?jǐn)?shù)(D)為自變量，大黃素含量(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行線性及多項(xiàng)式擬合，根據(jù)P值和r值來(lái)判定模型的好壞。對(duì)其進(jìn)行模型擬合分析，可得二項(xiàng)式擬合方程：

Y=-0.40 998+5.97 917×10-6A+0.031 542B-3.51 667×10-3C+0.012 288D-3.12 500×10-7AB+5.00 000×10-8AC-5.62 500×10-8AD-1.50 000×10-4BC-1.37 500×10-4BD-2.50 000×10-5CD-3.64 583×10-11A2-1.02 083×0-3B2+6.41 667×10-5C2-6.02 083×10-5D2(P<0.05，r=0.8 897)

其模型項(xiàng)P<0.05，提示Y與A、B、C、D回歸關(guān)系顯著，失擬項(xiàng)P>0.05，提示其他未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾較小，模型相關(guān)系數(shù)r=0.8897，模型可信度高，此方程與實(shí)際情況擬合較好，可對(duì)大黃中大黃素的勻漿提取工藝進(jìn)行較好預(yù)測(cè)。A、B及D均P<0.05，提示上述因素對(duì)提取大黃中的大黃素影響顯著。各因素對(duì)提取大黃中的大黃素的影響順序?yàn)椋杭状俭w積分?jǐn)?shù)>勻漿時(shí)間>勻漿轉(zhuǎn)速>甲醇體積。

2.6.3 效應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測(cè) 根據(jù)回歸方程，在保持2個(gè)因素編碼值為0時(shí)，再對(duì)其他兩個(gè)因素進(jìn)行分析，通過(guò)Design-Expert 8.0.5軟件繪制大黃素含量與4個(gè)自變量的等高線圖及三維響應(yīng)面圖，見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 各因素對(duì)勻漿提取大黃素的等高線

圖3 甲醇體積分?jǐn)?shù)、甲醇體積對(duì)勻漿提取大黃素的響應(yīng)面

從圖2可看出，各因素之間的等高線圖不是趨向于橢圓，表明它們之間的交互作用影響不明顯；由圖3可知，甲醇體積分?jǐn)?shù)的曲面較陡峭，說(shuō)明甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大黃素含量的影響最大，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)增加，大黃素含量也逐漸增加，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)上升到82%～85%時(shí)，大黃素含量達(dá)到了最大值，之后隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，大黃素含量也逐漸下降。

2.6.4 條件優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn) 以Design-Expert 8.0.5軟件預(yù)測(cè)分析，得出勻漿提取最佳工藝為：轉(zhuǎn)速為11 999.99 r/min，時(shí)間為5 min，甲醇體積為35 mL，甲醇體積分?jǐn)?shù)為83.5%，在此條件下預(yù)測(cè)出大黃素含量為0.139%。根據(jù)實(shí)際，最終確定最佳提取工藝為：轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，時(shí)間為5 min，甲醇體積為35 mL，甲醇體積分?jǐn)?shù)為83.5%，按此提取工藝條件提取大黃中的大黃素，平行試驗(yàn)3次，結(jié)果見(jiàn)表3，實(shí)測(cè)值與理論預(yù)測(cè)值間相對(duì)誤差RE均在5%以下，提示本研究?jī)?yōu)化的勻漿提取大黃中大黃素的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

表3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

注：相對(duì)誤差RE=(預(yù)測(cè)值-實(shí)測(cè)值)/預(yù)測(cè)值×100%。

2.7 高速勻漿提取與回流提取效果對(duì)比

以2號(hào)樣品分別精密稱取0.5 g各6份，按《中國(guó)藥典》一部下提取方法與本研究?jī)?yōu)化后的提取方法進(jìn)行提取后，以HPLC法對(duì)大黃素含量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算RSD值為1.39%。

3 討論

大黃游離蒽醌類(lèi)成分在甲醇、乙醇、乙酸乙酯中均可溶，故選擇上述溶劑進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)甲醇提取大黃素的含量最高，乙醇次之，乙酸乙酯最低，且從色譜圖上發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取的游離蒽醌類(lèi)成分不完全。本研究選取提取溶劑體積、體積分?jǐn)?shù)、轉(zhuǎn)速及勻漿時(shí)間4個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在提取溶劑體積方面，體積過(guò)少無(wú)法充分地浸潤(rùn)物料，使目標(biāo)成分溶解受限。但本研究單因素發(fā)現(xiàn)甲醇體積達(dá)40 mL后，隨著甲醇體積的增加，目標(biāo)成分含量開(kāi)始下降?？赡芤蛉軇┻^(guò)多勻漿轉(zhuǎn)頭與物料接觸不夠充分，物料粉碎不足而使目標(biāo)成分溶出不全。在溶劑濃度方面，隨著甲醇濃度增大，大黃素含量逐漸升高，提示適量的水分可促進(jìn)溶劑浸入細(xì)胞內(nèi)部，可更好地溶解目標(biāo)成分而在一定程度上提高提取效率。在甲醇濃度達(dá)到80%之后，隨著甲醇濃度的增大，大黃素的含量呈下降趨勢(shì)，可能與此時(shí)提取溶劑中水的比例下降，極性相應(yīng)有所下降，在此極性范圍內(nèi)不適宜目標(biāo)成分的溶解。理論上來(lái)說(shuō)轉(zhuǎn)速越大，物料粉碎效果越好，目標(biāo)成分提取效率越高，但轉(zhuǎn)速過(guò)大時(shí)可能導(dǎo)致目標(biāo)成分結(jié)構(gòu)被破壞而使含量不升反降。本研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)速為16 000 r/min時(shí)，大黃素含量明顯下降，可能與過(guò)大的轉(zhuǎn)速破壞了大黃素的結(jié)構(gòu)有關(guān)。勻漿時(shí)間越長(zhǎng)，物料粉碎越充分，大黃素含量理論上應(yīng)有所提高，但在單因素分析時(shí)發(fā)現(xiàn)勻漿時(shí)間增加到4 min之后，隨著勻漿時(shí)間的增加，大黃素含量反而下降，可能隨著時(shí)間增加物料過(guò)度粉碎，使勻漿液黏度增加，濾過(guò)時(shí)單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)的目標(biāo)成分量下降而使其含量下降。因大黃中大黃素提取受上述因素的綜合影響，故在單因素分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，以分析各因素綜合作用的影響[5]。