蒙 濤，駱 璽，王 強

(中南民族大學 藥學院，湖北 武漢 430074)

糖尿病所致的血管內(nèi)皮功能障礙引起的糖尿病血管并發(fā)癥是糖尿病患者致死、致殘的重要原因，尋找有效保護血管內(nèi)皮細胞的藥物對防治糖尿病具有重要意義[1]。中醫(yī)經(jīng)典方劑金芪降糖片由黃連、黃芪和金銀花3味中藥配伍而成，具有降血糖、保護血管和改善糖尿病血管并發(fā)癥的作用[2]。雖然金芪降糖片在糖尿病血管并發(fā)癥的治療方面頗有成效，但其成分復雜、活性多樣的特點，使其作用機制尚未闡明。

網(wǎng)絡藥理學融合了系統(tǒng)生物學、計算生物學等多學科的技術(shù)和內(nèi)容，從整體和系統(tǒng)的角度去探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，闡明藥物作用機制[3]，其系統(tǒng)性、整體性的特點與中醫(yī)中藥整體觀、辨證論治的原則不謀而合，目前己被廣泛應用到中醫(yī)藥研究領(lǐng)域[4-5]。本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法，旨在探討金芪降糖片保護血管的作用機制。

1 材料與方法

1.1 黃芪降糖片有效成分的獲取

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得黃連、黃芪、金銀花已知的化學成分，以口服生物利用度(OB≥30%)、類藥性(DL≥0.18)和Caco-2滲透性(Caco-2≥0.40)為參數(shù)，篩選出活性較高的化合物[6]，獲取化合物PubChem CID，并從化合物的“Related targets”中獲得其對應的預測靶點，然后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫對所得到的化合物預測靶點名稱進行矯正統(tǒng)一。

1.2 關(guān)鍵靶點篩選

將矯正后的化合物靶點基因名稱上傳到CTD(http：//ctdbase.org/)數(shù)據(jù)庫，利用其自身的Set Analyzer分析工具，設(shè)置P-value≤0.01，對靶基因進行疾病聚類(Enriched Diseases)，在結(jié)果中選擇Vascular Diseases，篩選出保護血管關(guān)鍵靶點。

1.3 疾病靶點GO注釋及通路分析

利用Cytoscape軟件的GlueGO工具，對篩選出的血管保護關(guān)鍵靶基因進行GO (gene ontology) 生物學過程富集分析和KEGG (KEGG pathway analysis)通路注釋分析，設(shè)定閾值P<0.05，選取具有顯著性差異的所有通路。

1.4 成分-靶點-通路網(wǎng)絡的構(gòu)建

利用軟件 Cytoscape 3.6.1，根據(jù)上述收集到的化合物及其預測靶點、通路，構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖。在網(wǎng)絡圖中，化合物、靶點、通路等信息用節(jié)點(Node)表示，化合物與其潛在作用靶點、靶點參與的疾病均以邊(edge)相連。以節(jié)點大小表示節(jié)點度(degree)，節(jié)點的度(degree)值越大，則這個點對應的成分、靶點或通路越有可能是作用機制中的關(guān)鍵點。

1.5 有效指數(shù)計算

以有效指數(shù)(Er)評價化合物對通路的作用效果，篩選出金芪降糖片保護血管的關(guān)鍵通路。

注：NT為該化合物作用的靶點總數(shù)，NTP為該化合物作用的靶點中參與該條通路的靶點數(shù)目，NP為該條通路的靶點總數(shù)。

1.6 整合通路構(gòu)建

根據(jù)分子對接結(jié)果，將活性成分作用靶點的基因名稱導入KEGG數(shù)據(jù)庫，利用KEGG mapping工具，將靶點映射到對應通路獲取通路圖，得出金芪降糖片保護血管的關(guān)鍵作用機制。

1.7 活性成分與靶蛋白分子對接

利用Sybyl 1.0軟件對關(guān)鍵通路對應的成分靶點進行分子對接計算，以驗證關(guān)鍵靶蛋白與對應化合物的結(jié)合活性。在PDB (http：//www.rcsb.org/pdb/)蛋白數(shù)據(jù)庫中下載含有原配體的靶蛋白晶體結(jié)構(gòu)及其配體結(jié)構(gòu)。利用PubChem CID，在PubChem數(shù)據(jù)庫檢索并下載對應金芪降糖片活性化合物的3D結(jié)構(gòu)(sdf格式)，之后利用ChemDraw 3D將sdf格式的化合物文件轉(zhuǎn)換為mol2格式文件。運用Sybyl軟件中的SurFlex-Dock模塊，選定靶蛋白中的原配體小分子藥物結(jié)合位點為活性中心，采用總分(Total Score)函數(shù)作為打分函數(shù)，進行對接計算。

2 結(jié)果

2.1 化學成分

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中分別獲得黃連、黃芪、金銀花目前已知成分48、87、236 種，具有較好口服生物利用度(OB≥30%)、類藥性(DL≥0.18)和Caco-2滲透性(Caco-2≥0.40)的化合物分別為黃連9種、黃芪12種、金銀花10種，其中24個化合物預測與115個靶點相關(guān)，見表1。

表1 金芪降糖片成分篩選結(jié)果

續(xù)表1

No.PubChemCIDMolecule NameOB (%)Caco-2DL相關(guān)靶點數(shù)來源M226436722phytofluene43.182.290.500金銀花M235280489beta-carotene37.182.250.5822金銀花M245281235kryptoxanthin47.251.690.570金銀花M256371716Ethyl linolenate46.101.540.202金銀花M265282184Mandenol42.001.460.193金銀花M275280794Stigmasterol43.831.440.7631金銀花M2811870462ZINC0397878143.831.320.760金銀花M29222284beta-sitosterol36.911.320.7538金銀花M305380108All-trans-Rhodoxanthin31.221.170.550金銀花M3110970376Corymbosin51.960.880.4126金銀花

2.2 CTD篩選及ClueGO分析結(jié)果

由CTD篩選出血管保護核心靶點49個，見表2。由ClueGO分析，49個核心靶點最相關(guān)的通路和生物過程(前15個)，見圖1。結(jié)果顯示，這些基因主要參與循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程(Vascular process in circulatory system)、調(diào)節(jié)鈣離子轉(zhuǎn)運(Regulation of calcium ion transport)、調(diào)節(jié)血管直徑(Regulation of blood vessel diameter)等生物過程。在KEGG通路中，這些基因涉及糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、癌癥相關(guān)的蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、流體剪切應力和動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)等信號通路。

2.3 成分-靶點-通路網(wǎng)絡的構(gòu)建

圖2為金芪降糖片成分-靶點-通路網(wǎng)絡，其中包含了66個節(jié)點和229條邊。66個節(jié)點中包括21個化合物，30個潛在靶點和15條通路。由網(wǎng)絡圖可知，化合物 M23、M29和M13具有較大節(jié)點度(degree)值，是金芪降糖片主要活性成分，PTGS2、NOS3和NOS2相鄰化合物節(jié)點最多，分別有多個活性化合物與之結(jié)合。

圖1 GlueGO分析結(jié)果

表2 CTD篩選結(jié)果

圖2 金芪降糖片成分-靶點-通路網(wǎng)絡

2.4 有效指數(shù)計算分析和通路圖獲取

活性化合物對相關(guān)通路的有效指數(shù)Er計算結(jié)果見圖3，計算值越大說明化合物對該通路作用越強。有效指數(shù)計算結(jié)果顯示，金芪降糖片活性化合物對VEGF信號通路作用最強，其中化合物M23對多條通路均有顯著作用。在KEGG數(shù)據(jù)庫，利用KEGG mapping工具，將參與VEGF信號通路的金芪降糖片活性化合物相關(guān)靶點映射到VEGF信號通路獲取通路圖，得到金芪降糖片保護血管核心作用機制，見圖4。

2.5 分子對接計算分析

以分子對接計算，驗證金芪降糖片活性化合物與VEGF信號通路相關(guān)靶蛋白的結(jié)合活性。根據(jù)有效指數(shù)Er計算結(jié)果，篩選出對VEGF信號通路活性最高的10個化合物，與對應的關(guān)鍵靶蛋白CASP9、MAPK14、NOS3、PTGS2進行分子對接，對接計算結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，4個靶蛋白均有2個或2個以上的化合物對接打分接近或者超過原配體小分子，顯示金芪降糖片活性化合物對上述靶蛋白具有較好的結(jié)合活性。

圖3 有效指數(shù)計算結(jié)果

注：紅色為金芪降糖片活性化合物潛在作用靶點圖4 VEGF信號通路

表3 分子對接結(jié)果

3 討論

金芪降糖片對糖尿病所致的血管并發(fā)癥具有較為顯著的治療作用，針對中藥及其復方研究局限性的限制，本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法分析金芪降糖片保護血管的分子機制。本研究收集到金芪降糖片24個活性化合物可能作用于115個靶蛋白，其中49個核心靶點(表2)涉及血管病變，這提示金芪降糖片活性化合物可能是通過作用于這49個核心靶點保護血管。通過ClueGO分析生物過程富集(圖1)發(fā)現(xiàn)，金芪降糖片保護血管的活性成分潛在作用靶點在循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、調(diào)節(jié)鈣離子轉(zhuǎn)運和調(diào)節(jié)血管直徑等生物過程富集，這些生物學過程紊亂很可能是病理性血管損傷的原因，同時表明金芪降糖片可能通過改善這些生物過程發(fā)揮其保護血管的作用。KEGG通路富集(圖1)以及“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(圖2)分析發(fā)現(xiàn)，金芪降糖片保護血管的活性成分潛在作用靶點參與糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路、癌癥相關(guān)的蛋白聚糖、流體剪切應力和動脈粥樣硬化等信號通路，這些通路異常也是糖尿病血管病變的誘因，同時也有大量文獻證實金芪降糖片通過調(diào)控這些通路發(fā)揮其保護血管的作用。

高級糖基化終產(chǎn)物(AGEs)是誘導血管內(nèi)皮細胞功能紊亂，引發(fā)糖尿病血管并發(fā)癥的重要原因。尹登科等[7]研究證實，黃連多糖能顯著減少高級糖基化終產(chǎn)物(AGEs)誘導下人臍靜脈內(nèi)皮細胞高級糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)的表達，降低AGEs對內(nèi)皮細胞的激活作用，進而改善AGEs誘導的內(nèi)皮細胞損傷。血液流體剪切應力異常也是誘導內(nèi)皮功能紊亂的重要因素。當歸補血湯由當歸和黃芪配伍而成，秦臻等[8]研究證實，增大當歸補血湯中黃芪的比例，可促進低血液流體剪切應力作用下受損內(nèi)皮細胞的eNOS表達和NO分泌，進而顯著增強血管內(nèi)皮保護效應。這些研究結(jié)果充分顯示出金芪降糖片調(diào)節(jié)AGE-RAGE信號通路，改善血液流體剪切應力異常，保護血管內(nèi)皮細胞的作用，與本文網(wǎng)絡藥理學研究結(jié)果一致。

根據(jù)活性化合物對相關(guān)通路的有效指數(shù)Er計算結(jié)果(圖3)分析發(fā)現(xiàn)，金芪降糖片活性化合物對VEGF信號通路作用最強，其中涉及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、半胱氨酸蛋白酶9(CASP9)、絲裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)、一氧化氮合酶(NOS3)、環(huán)氧合酶2(PTGS2)等5個靶點。根據(jù)VEGF信號通路圖(圖4)的信息以及查閱的相關(guān)文獻，發(fā)現(xiàn)參與VEGF信號通路的5個金芪降糖片活性化合物作用的靶點在糖尿病血管病變中發(fā)揮著重要作用。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)能有效誘導血管再生，王興木等[9]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清中的血管內(nèi)皮生長因子水平隨著病變的加重而顯著增加，這表明血管內(nèi)皮生長因子在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。此外，VEGF也能通過影響下游靶點，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能。Xu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF過表達可影響PI-3K/AKT/m-TOR/eNOS和p38/MAPK信號，進而改善棕櫚酸誘導的糖尿病內(nèi)皮細胞功能障礙。PI3K/AKT/mTOR磷酸化活化后，促進細胞周期，加速細胞增殖[11]。AKT磷酸化可促進eNOS磷酸化催化產(chǎn)生NO[12]，適量的NO 分泌可保護血管內(nèi)皮功能，而過量的NO分泌則會引起內(nèi)皮細胞通透性的改變，致使內(nèi)皮細胞功能紊亂，引起血管內(nèi)皮損傷[13]。P38/MAPK信號通路則通過調(diào)節(jié)膠原纖維蛋白原和纖溶酶原活性，誘導內(nèi)皮細胞遷移和細胞骨架重組[14]。NO和PGI2是VEGF信號下游的分子，分別由eNOS和PTGS2催化產(chǎn)生，F(xiàn)edorowicz等[15]研究證實，NO和PGI2依賴的機體功能受損是糖尿病主動脈內(nèi)皮功能障礙的重要因素。這些研究結(jié)果提示金芪降糖片活性化合物可能通過作用于上述靶點，調(diào)節(jié)VEGF信號通路，進而保護血管，改善糖尿病血管并發(fā)癥。

現(xiàn)代藥理學研究指出，金芪降糖片活性化合物具有改善VEGF信號，進而保護血管的作用。鄭凝等[16]發(fā)現(xiàn)金芪降糖片具有抑制RAGE表達，降低腎組織VEGF、TGF-β1、CTGF 水平的作用。封芬等[17]研究發(fā)現(xiàn)，黃連素治療可促進糖尿病大鼠胸主動脈PI3K、Akt 和eNOS等蛋白表達，證實黃連素可能是通過激活PI3K/Akt/eNOS信號途徑，改善糖尿病血管內(nèi)皮功能。本研究分子對接結(jié)果顯示(表3)，金芪降糖片活性化合物黃連素(M2)、表小檗堿(M5)、β-胡蘿卜素(M23)和十八碳二烯(M26)分別與2個或2個以上的靶蛋白對接打分接近或者超過原配體小分子，顯示出對VEGF信號通路靶蛋白具有較好的結(jié)合活性，這提示這4個化合物可能是金芪降糖片調(diào)節(jié)VEGF信號通路的主要活性化合物。其中，黃連素分子對接結(jié)果與文獻報道相符，進一步證實本研究結(jié)果的準確性。

本研究從網(wǎng)絡藥理學角度探討并揭示了金芪降糖片保護血管的主要成分、作用靶點和相關(guān)生物信號通路。網(wǎng)絡分析推測金芪降糖片活性化合物主要通過作用于VEGF、CASP9、MAPK14、NOS3、PTGS2等5個靶點，影響VEGF信號通路，從而起到保護血管的作用，其中發(fā)揮作用的關(guān)鍵活性化合物可能是黃連素、表小檗堿、β-胡蘿卜素和十八碳二烯。本研究為進一步深入探討金芪降糖片保護血管的作用機制提供借鑒。