萬楷楊，李秋芳

(1.鄭州市第一人民醫(yī)院，河南 鄭州 450004；2.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450006)

望春花為木蘭科植物望春花MagnoliabiondiiPamp.的干燥花蕾，其性溫，味辛，歸肺、胃經(jīng)，具有散風(fēng)寒、通鼻竅的功效[1]。辛夷為河南省的道地藥材，原產(chǎn)湖北，今分布于河南、湖北、陜西及四川等省，多為栽培，少有野生[2]，河南省野生品種多為望春花，望春花花蕾為辛夷藥材來源的主流品種，約占辛夷藥材的80%。南北朝《名醫(yī)別錄》[3]中記載產(chǎn)地有“漢中，魏興，梁州川谷”，說明辛夷長(zhǎng)在漢中(今陜西西南部)、魏興(今陜西東南部)、梁州(今陜西西南部)等地的山川河谷地帶?！侗静菅芰x》[4]中記載全國(guó)各地均有辛夷，《本草圖經(jīng)》[5]中初次出現(xiàn)了“人家園庭亦多種植”，表明此時(shí)辛夷的種植已較為常見，各個(gè)產(chǎn)地皆有種植。清代《本草崇原》[6]中記載“今近道處處有之”，近道即中原一帶，即現(xiàn)代河南省及其毗鄰地區(qū)。現(xiàn)代《中國(guó)藥材學(xué)》[7]中記載：“分布于甘肅、陜西、湖北、河南、四川、湖南，生于海拔400～2 000 m山地”“以四川、河南產(chǎn)量大，質(zhì)量佳?！毙烈牡乃幱眉跋阌糜行С煞志鶠槠渌膿]發(fā)油[8]。其主要化學(xué)成分有單萜、倍半萜類及其含氧衍生物和脂肪族化合物等[9]。但目前對(duì)望春花的開發(fā)利用僅限于精油提取和鼻炎用藥，許多其他藥理作用尚沒有充分開發(fā)[10]。王文魁等[8]對(duì)望春花油的藥理效應(yīng)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，證明其有明顯的抗炎作用。管正等[11]發(fā)現(xiàn)了辛夷揮發(fā)油可減輕實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性鼻炎(AR)大鼠的炎癥反應(yīng)，說明辛夷揮發(fā)油的抗組胺和乙酰膽堿作用是其發(fā)揮抗炎、抗過敏作用的藥理基礎(chǔ)。陳志東等[12]建立腎缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察辛夷揮發(fā)油治療前后腎組織病理學(xué)與腎功能改變的表達(dá)，說明辛夷揮發(fā)油對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。另外辛夷揮發(fā)油能抑制活化的人內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞黏附，從而發(fā)揮抗炎與抗黏附效應(yīng)。因此，本文研究不同產(chǎn)地望春花揮發(fā)油的化學(xué)成分，以期對(duì)望春花揮發(fā)油的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

TSQ8000EVO三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)賽默飛世爾公司)；NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)；BSA124S萬分之一分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、DGX-9143B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)；KQ-500DV 型數(shù)控超聲波清洗器( 昆明市超聲儀器有限公司)，揮發(fā)油提取器、KDM 型調(diào)溫電熱套(山東菏澤石油化工學(xué)校儀器設(shè)備廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

樣品收集于廣西、湖北、四川、安徽、河南共14份樣品。經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定為木蘭科Magnoliaceae植物望春花MagnoliabiondiiPamp.的干燥花蕾。具體樣品見表1。

2 實(shí)驗(yàn)條件

2.1 提取方法

取供試品30 g稱量(準(zhǔn)確至0.01 g)至燒杯中，加水500 mL與玻璃珠數(shù)粒，振搖混勻后，連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分，并溢流入燒瓶中為止。置電熱套中緩緩加熱至沸騰，并保持微沸約5 h，至測(cè)定器中油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開啟測(cè)定器下端的活塞，將水緩緩放出，至油層上端到達(dá)刻度0線上面5 mm處為止。放置1 h以上，再開啟活塞使油層下降至其上端恰與刻度0線平齊，讀取揮發(fā)油量，并計(jì)算供試品中含揮發(fā)油的百分?jǐn)?shù)。

表1 實(shí)驗(yàn)樣品

2.2 實(shí)驗(yàn)條件

2.2.1 色譜柱 TG-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)石英毛細(xì)管柱；程序升溫：40 ℃，保持3 min，先以2 ℃/min升溫至60 ℃，然后以4 ℃/min升溫至90 ℃，再以3 ℃/min升溫至160 ℃，最后以20 ℃/min升溫至260 ℃，恒溫5 min，進(jìn)樣口溫度：260 ℃；載氣：氦氣；載氣流速：1.0 mL/min；分流比：100∶1；溶劑延時(shí)：5 min。質(zhì)譜條件：離子源：EI源；離子源溫度：250 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；傳輸線溫度；280 ℃電子能量：70 eV；倍增管電壓：1.2 kV；接口溫度：280 ℃；質(zhì)量范圍：35～550 m/z。

2.2.2 供試品溶液制備方法 稱量望春花樣品30 g，加入500 mL蒸餾水蒸餾5 h，得到淡黃色油狀物，用石油醚萃取，無水硫酸鈉干燥、放置過夜，過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干石油醚溶液，得到望春花揮發(fā)油。取5 μL揮發(fā)油，用二氯甲烷定容至1 mL，稀釋200倍，待測(cè)。

2.2.3 測(cè)定方法 分別吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液1 μL，注入GC-MS聯(lián)用儀，記錄55 min色譜圖。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品所得GC-MS圖譜手動(dòng)選取所有樣品的共有峰，26個(gè)共有峰的總貢獻(xiàn)率>90%，可以代表樣品的全部信息。

3.1 辛夷揮發(fā)油化學(xué)指標(biāo)的聚類分析

3.1.1 原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化 為了消除量綱的影響，首先將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

3.1.2 進(jìn)行聚類分析 采用樣本聚類分析，方法上采用相關(guān)系數(shù)法，得到聚類樹狀圖，見圖1。

3.2 望春花質(zhì)量評(píng)價(jià)主成分分析

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)化處理 由于原始數(shù)據(jù)存在數(shù)量級(jí)上的差異，故首先將供試材料化學(xué)指標(biāo)的含量標(biāo)準(zhǔn)化。

3.2.2 主成分的確定 計(jì)算相關(guān)系數(shù)的特征根和方差貢獻(xiàn)率見表2，從表2可以看出第1、2、3、4主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為91.85%>80%，所以選取4個(gè)主成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，代表望春花91.85%的信息。

圖1 聚類分析樹狀圖

主成分?jǐn)?shù)特征根方差貢獻(xiàn)率(%)方差總貢獻(xiàn)率(%)115.6060.0160.0124.0315.5175.5232.419.2684.7841.847.0891.85

3.2.3 計(jì)算初始因子載荷矩陣 通過SPSS分析得到的4個(gè)初始因子的載荷矩陣見表3，從初始矩陣計(jì)算得到的4個(gè)主向量矩陣見表4，從而得到4個(gè)主成分與各個(gè)變量的線性組合分別如下：

F1=0.197ZX1-0.212ZX2+0.217ZX3+……+0.213ZX26

F2=-0.257ZX1-0.089ZX2-0.205ZX3+……+0.037ZX26

F3=0.114ZX1-0.275ZX2-0.075ZX3+……-0.037ZX26

F4=0.041ZX1-0.027ZX2-0.009ZX3+……+0.120ZX26

表3 初始因子載荷矩陣

續(xù)表3

1234Zscore(峰4)0.815-0.3870.2540.093Zscore(峰5)0.848-0.4620.0270.227Zscore(峰6)0.826-0.3270.3190.279Zscore(峰7)0.764-0.020.1-0.503Zscore(峰8)0.859-0.3940.0860.244Zscore(峰9)0.8240.2270.2120.317Zscore(峰10)-0.899-0.139-0.241-0.069Zscore(峰11)0.5640.0530.732-0.212Zscore(峰12)0.3240.5390.362-0.64Zscore(峰13)0.3680.8430.2380.164Zscore(峰14)0.7230.604-0.199-0.169Zscore(峰15)0.7220.53-0.0390.299Zscore(峰16)0.7490.519-0.0860.277Zscore(峰17)-0.8650.3350.1430.287Zscore(峰18)0.6670.517-0.3740.28Zscore(峰19)0.5910.514-0.4850.142Zscore(峰20)-0.8320.3030.4040.115Zscore(峰21)-0.8630.3980.281-0.098Zscore(峰22)-0.910.1390.3180.134Zscore(峰23)-0.823-0.122-0.3840.12Zscore(峰24)-0.8170.0030.3770.391Zscore(峰25)-0.815-0.1280.2990.433Zscore(峰26)0.8410.074-0.0570.163

表4 主成分向量

3.2.4 計(jì)算主成分得分及綜合得分并排序 以每個(gè)主成分所對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率占所提取主成分的總的方差貢獻(xiàn)率之和的比例作為權(quán)重計(jì)算主成分綜合模型，即F=0.653F1+0.169F2+0.101F3+0.077F4計(jì)算綜合分。具體得分及排序見表5。

表5 綜合得分及排序

3.3 化學(xué)成分分析

通過對(duì)望春花揮發(fā)油進(jìn)行提取分析，得到總離子流圖，見圖2。然后，通過Xcalibur化學(xué)工作站檢索Nist標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)，同時(shí)結(jié)合有關(guān)質(zhì)譜圖文獻(xiàn)解析，以匹配度大于750為篩選依據(jù)[13]，并選取所有樣品共有峰，共有峰總貢獻(xiàn)率均>90%，可代表望春花揮發(fā)油的總體信息，并初步鑒定了其中 26個(gè)揮發(fā)性成分，結(jié)果見表6，通過GC-MS分析，經(jīng)面積歸一法計(jì)算得出各個(gè)樣品共有峰的相對(duì)百分含量，見表7。

圖2 望春花揮發(fā)油總離子流

表6 望春花揮發(fā)油化學(xué)成分

4 結(jié)果分析

4.1 聚類分析意義

通過聚類分析樹狀圖1的結(jié)果可以看出，在產(chǎn)地上，樣品9、10、11、12、13、14聚為一類，即產(chǎn)地為河南。其他樣品即廣西、湖北、四川、安徽聚為一類。由此可見，道地藥材聚為一類，非道地藥材聚為一類，道地藥材可與非道地藥材分開，望春花藥材的揮發(fā)油成分與產(chǎn)地之間具有一定相關(guān)性，可能與其生長(zhǎng)環(huán)境、氣候、海拔、土壤等有關(guān)。

4.2 主成分結(jié)果分析

4.2.1 望春花揮發(fā)油主成分意義 據(jù)表2、表3可知，第一主成分特征根為15.602，累計(jì)貢獻(xiàn)率為60.01%，即一個(gè)因子模型解釋了樣品60.01%的信息，在峰1、3、4、5、6、7、8、9的載荷系數(shù)較大，且為正相關(guān)，可視為1、3、4、5、6、7、8、9為含量主因子，結(jié)合化學(xué)成分分析，可知其含量主因子為α-蒎烯、β-蒎烯、香檜烯、α-月桂烯、桉樹腦、芳樟醇、γ-松油烯、檸檬烯等；第二主成分在峰12、13、14的載荷系數(shù)較大，且為正相關(guān)，可視為峰12、13、14為含量主因子，結(jié)合化學(xué)成分分析，可知其含量主因子為α-松油醇、β-石竹烯等；第三主成分在峰11、12的載荷系數(shù)較大，且為正相關(guān)，可視峰11、12為含量主因子，結(jié)合化學(xué)成分分析，可知其含量主因子為α-松油醇、β-欖香烯等。這三個(gè)主成分對(duì)樣品的貢獻(xiàn)率為84.776%，可通過這三個(gè)主成分確定望春花揮發(fā)油的主要化學(xué)成分為α-蒎烯、β-蒎烯、香檜烯、桉樹腦、α-松油醇。

4.2.2 望春花揮發(fā)油主成分綜合評(píng)價(jià) 據(jù)表5可知，可得出不同產(chǎn)地的望春花揮發(fā)油質(zhì)量?jī)?yōu)劣的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果，樣品9、10、11、12、13、14排名較靠前，表明其揮發(fā)油成分較好。且這些產(chǎn)地樣品均采集于河南，由此可見，在望春花揮發(fā)油成分上，河南省所產(chǎn)望春花要優(yōu)于其他省份。結(jié)合表7各個(gè)樣品的化學(xué)成分的含量分析，可以看出在α-蒎烯、香檜烯這兩個(gè)成分上，河南、湖北的樣品含量要高于其他產(chǎn)地；在桉樹腦、α-松油醇成分上，河南、安徽的樣品含量要高于其他產(chǎn)地；在β-蒎烯成分上，湖北、安徽的樣品含量高于其他產(chǎn)地；綜合這五個(gè)成分的含量比較，可以看出在望春花揮發(fā)油的總成分上，河南省的質(zhì)量較優(yōu)。

5 討論

由于望春花的產(chǎn)地較多，難以從提取的揮發(fā)油上來區(qū)分其產(chǎn)地并評(píng)價(jià)其質(zhì)量，因此，通過GC-MS技術(shù)對(duì)望春花揮發(fā)油進(jìn)行綜合分析，并通過聚類分析和主成分分析法對(duì)望春花揮發(fā)油的圖譜進(jìn)行分析，聚類分析以“物以類聚”的思想，通過計(jì)算樣品間的聚類統(tǒng)計(jì)量(距離、相關(guān)系數(shù)等)，逐步將相關(guān)性最大的樣品聚在一起，直到所有樣品歸為一類[14]，可以直觀地看出其中河南的樣品聚為一類，其他樣品聚為一類，說明望春花藥材的揮發(fā)油成分與產(chǎn)地之間具有一定相關(guān)性?？赡芘c其生長(zhǎng)環(huán)境、氣候、海拔、土壤等有關(guān)；主成分分析作為數(shù)據(jù)挖掘的一種方法能夠用于中藥指紋圖譜的統(tǒng)計(jì)分析。在不損失樣本特征值的數(shù)量和信息前提下，采用降維模式分類方法，僅用4個(gè)主成分就能基本描述望春花藥材揮發(fā)油圖譜中原有的多維數(shù)據(jù)特征，起到了降維作用，便于數(shù)據(jù)分析，而且原有信息損失少[15]。盧金清等[9]分析了望春花揮發(fā)油中的化學(xué)成分，其中桉樹腦含量最高，其次為β-蒎烯和α-松油醇。王娟等[16]通過對(duì)望春花揮發(fā)油指紋圖譜的研究，指認(rèn)了其中的三個(gè)主要成分為α-蒎烯、β-蒎烯、檜烯，并對(duì)不同產(chǎn)地的樣品進(jìn)行聚類分析及這三個(gè)成分的含量對(duì)比分析，得出河南、安徽兩個(gè)產(chǎn)地的樣品可聚為一類，與其他產(chǎn)地樣品可區(qū)分開，與本實(shí)驗(yàn)聚類分析結(jié)果保持一致，再次驗(yàn)證了望春花在地域方面的差異。本文通過指認(rèn)的5個(gè)化學(xué)成分(α-蒎烯、β-蒎烯、香檜烯、桉樹腦、α-松油醇)的含量比較，發(fā)現(xiàn)河南的樣品這五個(gè)成分的含量均在前三名中分布，再結(jié)合主成分的綜合得分，能對(duì)不同產(chǎn)地望春花藥材揮發(fā)油的質(zhì)量作出綜合評(píng)價(jià)，其中河南的望春花綜合得分排名第一位，并與聚類分析結(jié)果相統(tǒng)一，而且在α-蒎烯、β-蒎烯、香檜烯、桉樹腦、α-松油醇這五個(gè)成分上，排名都很靠前，可見河南省所產(chǎn)望春花揮發(fā)油優(yōu)于其他省份，可作為區(qū)分望春花道地藥材與非道地藥材的依據(jù)，這為望春花藥材揮發(fā)油的進(jìn)一步利用提供了可靠的理論依據(jù)。