李錦堂，王賢兒，關琴笑，譚娥玉，盧穎欣

(1.江門市五邑中醫(yī)院/暨南大學附屬江門中醫(yī)院 藥學部，廣東 江門 529000；2.江門市五邑中醫(yī)院 陳皮研究院，廣東 江門 529000；3.廣東藥科大學，廣東 中山 528400)

紫冬油為我院治療皮膚燒燙傷、小兒濕疹、褥瘡等皮膚疾病的有效制劑，已沿用40余年，深受醫(yī)師推崇、患者好評且產值較大。原方由紫草、忍冬藤、白芷等組成，有清熱解毒、消腫排膿之功，臨床使用發(fā)現(xiàn)也有一定的破損肌膚修復作用。紫草作為原方君藥，現(xiàn)代研究表明其主要成分紫草素、紫草寧及其衍生物為萘醌類化合物，具有抗病毒、抑菌、抗腫瘤活性等作用[1-3]。但因原方提取需經油炸提取后與蜂蠟、麻油等混合制成，制備工藝繁瑣，且現(xiàn)代研究表明，在成分提取方面存在一些弊端，因此為提高制劑效能，方便患者使用，本課題將在保持中醫(yī)藥特色的基礎上，采用現(xiàn)代制劑研究方法，對該制劑進行全面系統(tǒng)研究，以水凝膠作為劑型基質，以期將其改進成為既保持療效又方便臨床使用的新劑型——紫冬凝膠。本實驗將采用正交試驗研究方法，對該制劑的提取方法進行優(yōu)化研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與設備

LQ-C20002電子天平(五鑫衡器有限公司)；ME104電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用有限責任公司)；WH-800超聲波清洗機(濟寧萬和超聲電子設備有限公司)；電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；HH-3A數(shù)顯恒溫三溫水浴鍋(金壇市精達儀器制造有限公司)。

1.2 藥品與試劑

新疆紫草(1710001)(廣州市嶺南中藥飲片有限公司佛山分公司)；忍冬藤(161101)(安徽匯仁堂中藥飲片有限公司)；白芷(20170301)(國藥集團馮了性(佛山)藥材飲片有限公司)；左旋紫草素對照品(0769-9903)(中國食品藥品檢定研究院)；95%乙醇(分析純，廣東光華科技股份有限公司)；蒸餾水(實驗室自制)。

2 方法及結果

2.1 總萘醌測定方法

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱定左旋紫草素對照品4.20 mg，加95%乙醇使溶解，并定容至10 mL，搖勻，即得濃度為0.42 mg/mL對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取處方藥1份粉碎，精密稱定，加入8倍量70%乙醇，超聲30 min，過濾，分別取濾液10 mL，揮干乙醇，置于烘箱中60 ℃烘干4 h，放冷，稱重。另分別精密吸取0.5 mL濾液于20 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，得到供試品溶液。

2.1.3 測定波長的選擇 精密移取上述制備的對照品溶液、供試品溶液各1 mL，分別置入10 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，定容，搖勻。隨行試劑為空白對照組，照紫外-可見分光光度法于400～600 nm波長范圍全程掃描。結果對照品及供試品均在516 nm處有最大吸收，且空白試劑對照均無干擾，故選擇516 nm為測定波長。結果見圖1-圖3。

圖1 左旋紫草素紫外吸收光譜

圖2 供試品紫外吸收光譜

圖3 陰性對照試驗紫外吸收光譜

2.1.4 標準曲線的制備 分別精密量取濃度為0.42 mg/mL對照品溶液0.3、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，置于25 mL量瓶中，用乙醇定容至刻度，采用紫外-可見分光光度法進行測定。以左旋紫草素對照品溶液濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標進行線性回歸，計算得回歸方程：A=19.608c+0.003 8(r=0.999 9)，結果表明，供試品溶液濃度在0.005 04～0.050 4 mg/mL范圍內，其吸收度線性關系良好。

2.2 提取方法的選擇和單因素考察

2.2.1 權重系數(shù)法 以羥基萘醌總色素的含量和浸膏得率為綜合指標進行評分，由于主要考察君藥——紫草有效成分的提取工藝，羥基萘醌總色素的含量更為重要，因此，羥基萘醌總色素含量與浸膏得率的權重比為7∶3。

2.2.2 提取方法的選擇 根據(jù)實際生產條件，對醇回流法、醇超聲法、醇浸漬法3種方法進行優(yōu)選確定，測定在不同提取方法下總萘醌的含量及浸膏得率，結果見表1。結果顯示，有效成分羥基萘醌總色素的含量在醇回流提取條件下最低；浸膏得率約在4%～6%之間，3種方法相差不大；采用“2.2.1”項下的權重系數(shù)評分法，3種方法評價得分由高至低：乙醇超聲法>乙醇浸漬法>乙醇回流法。根據(jù)實驗結果，醇浸漬法和醇超聲法評價得分相近，結合實際生產效率，最終選擇醇超聲法作為本研究的基本提取方法。

2.2.3 單因素考察 按“2.1.3”項的測定方法以及“2.2.2”項下篩選的提取方法，進行單因素水平考察，最終以乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數(shù)設置L9(34)正交實驗因素水平表(如表2)，實驗研究發(fā)現(xiàn)超聲提取溫度應控制在(60±3)℃。

2.2.4 正交試驗 以“2.2.3”項下L9(34)表進行正交試驗，以羥基萘醌總色素含量及浸膏得率為綜合指標，進行正交試驗，結果見正交試驗分析表3和方差分析表4。

表1 不同提取方法的實驗結果

表2 正交試驗因素水平

2.2.5 正交試驗結果與方差分析 由表4可知，因素的主次為A>B>C>D，因素A、B有顯著性差異，因素C、D沒有顯著性差異。結合極差分析，基于實驗的效率及節(jié)約溶劑、時間、節(jié)能等方面的考慮，最終確定提取的最佳條件為A1B3C1D1，即70%乙醇、料液比1∶12、提取45 min、提取1次。

表3 正交試驗結果分析

表4 方差分析結果

注：F0.05(2,2)=19.000，*顯著性。

2.2.6 提取工藝驗證 取處方藥各3份，粉碎，精密稱定，加入12倍量70%乙醇，超聲45 min，過濾，分別取濾液10 mL，揮干乙醇，再置于烘箱中65℃烘干4 h，放冷，稱重。另分別精密吸取0.5 mL濾液于20 mL容量瓶中，分別加入70%乙醇定容至刻度，得到供試品溶液。

按“2.1.2”和“2.1.3”項的方法，測定在最佳提取工藝下羥基萘醌總色素的含量及浸膏得率，結果見表5。

表5 最佳提取工藝驗證

結果顯示，羥基萘醌總色素平均含量為11.17 mg，RSD%為1.42%；浸膏得率平均為6.66%，RSD%為2.57%，表明正交試驗優(yōu)選條件具有較強的可操作性及穩(wěn)定性。

3 討論

3.1 有效成分含量測定方法的選擇

紫冬凝膠原劑型為以蜂蠟和麻油等制成的油劑，由于自身使用的缺陷而被改進為水凝膠劑，該制劑為院內制劑，用量大，產值高，值得進一步研發(fā)。本實驗根據(jù)實際情況，采用紫外分光光度法作為該制劑的含量測定方法，可操作性強、方法簡單高效，亦可為該制劑的質量標準提高提供研究數(shù)據(jù)，方便日后藥檢工作。

3.2 溫度對有效成分的影響

實驗過程中發(fā)現(xiàn)，用乙醇回流法對紫草進行提取時，加熱到一定溫度，提取液顏色會由紅色變成紫黑色，其供試品溶液的紫外吸收圖譜在516nm處沒有吸收峰，表明紫草中萘醌類色素在一定溫度下會發(fā)生改變，對熱不穩(wěn)定，因此也提示對該制劑的生產過程中應注意溫度的控制。本次實驗發(fā)現(xiàn)，醇回流80℃時，紫草中萘醌類色素已處于不穩(wěn)定的狀態(tài)。在對乙醇超聲提取工藝進行優(yōu)化的過程中，考察了紫草在30～70℃乙醇超聲環(huán)境下的萘醌類總色素含量，結果表明隨著溫度的升高，紫草中羥基萘醌總色素含量與浸膏得率均有增加；同時表明紫草中萘醌類總色素在70℃時仍可穩(wěn)定存在。李曉瑾等[4]研究表明紫草素在50～70 ℃范圍內的影響很小，在超過80 ℃后，紫草素含量快速降低。因此建議提取時候將溫度穩(wěn)定在79℃以下，本實驗過程控制在(60±3) ℃。

3.3 提取方法的選擇

在考察最佳提取方法的實驗中，乙醇浸漬法綜合評分雖稍低于乙醇超聲法，但實際差別不大。乙醇浸漬法除去耗時這一缺點，在穩(wěn)定性上比起乙醇超聲法有較大的優(yōu)勢，且更節(jié)約能源，因此在時間充裕的條件下還可對乙醇浸漬法進行更加全面深入的研究。

查閱相關文獻[5]可知，紫草素具有光不穩(wěn)定性，且因羥基的存在，易被氧化，長時間置于空氣中，紫草素的含量會下降。本課題的實驗過程均沒有在避光條件下進行，但在實驗過程中，對密封無避光放置2天之后的紫草藥液再次進行含量測定，對比發(fā)現(xiàn)羥基萘醌總色素含量無明顯變化，故未采取避光的操作。實驗中，超聲過程均在密封條件下，且過濾與取樣的時間較短，受氧化的影響較低，但在實際生產工作中，應避免長時間暴露于空氣中。