李 燕，劉 聰，陳玉梅，胡昌江*，許潤春

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都611137；2.四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司/國家企業(yè)技術(shù)中心/國家中醫(yī)藥管理局“中藥配方顆粒質(zhì)量與療效評價”重點研究室，四川 成都 611900)

虎杖來源于蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根莖和根[1]，為常用清熱藥，主產(chǎn)于華東、中南、西南等地，包括四川、貴州、浙江、安徽、陜西、廣東等省市[2]。具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰等功效，用于治療濕熱黃疸、淋濁、帶下、風(fēng)濕痹痛等癥[1]?；⒄戎饕瘜W(xué)成分包括蒽醌類、二苯乙烯類、黃酮類、香豆素類以及一些脂肪酸類化合物等，具有抗菌、抗病毒、擴血管、抗血栓等多種藥理作用[3-7]。根據(jù)2016年國家藥典委員會發(fā)布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)》，中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑系遵循中醫(yī)藥理論，采用合格飲片按照臨床湯劑煎煮方法規(guī)范化煎煮，固液分離，經(jīng)適當(dāng)濃縮制得或經(jīng)適宜方法干燥制得，作為衡量中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的標(biāo)準(zhǔn)參照物[8]。標(biāo)準(zhǔn)湯劑系由不少于15批原料分別制得，計算相關(guān)平均值，并規(guī)定其變化可接受的范圍。中藥配方顆粒的所有藥學(xué)研究均須與標(biāo)準(zhǔn)湯劑進行對比，以保證與標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量的一致性。

虎杖作為中藥的重要品種，目前對其標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究報道較少。本研究嚴格遵循相關(guān)文件中標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備的要求，收集主產(chǎn)區(qū)的20批虎杖藥材制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，以虎杖苷和大黃素為指標(biāo)成分，測定其含量，計算轉(zhuǎn)移率和出膏率范圍，并進行指紋圖譜研究，為虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供研究數(shù)據(jù)，同時為虎杖配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

安捷倫1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；CT-C-3型熱風(fēng)循環(huán)烘箱(杭州金竺機械有限公司)；MS205DU型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；ME204E/02型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；細胞型1810A超純水機(上海摩勒科學(xué)儀器有限公司)；KQ5200DB型超聲波清洗器(600 W，40 kHz；昆山市超聲儀器有限公司)；分體式陶瓷煎藥壺4 L(美味世家)；LGJ-100F型真空冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)。

1.2 藥品及試劑

按照《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》(征求意見稿)的要求共收集20批來自四川、貴州、浙江、安徽、陜西等主產(chǎn)區(qū)的虎杖藥材(經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)胡昌江教授鑒定為蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根莖和根)，并加工成飲片，飲片具體信息見表1?；⒄溶?中國食品藥品檢定研究院，批號：111575-201603，含量以87.3%計)，大黃素(中國食品藥品檢定研究院，批號：110756-201512，含量以98.7%計)，白藜蘆醇(中國食品藥品檢定研究院，批號：11535-201703，含量以99.4%計)；乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

表1 飲片產(chǎn)地信息

2 方法和結(jié)果

2.1 虎杖飲片含量測定

采用 《中國藥典》 2015版方法，以Agilent ZORBAX Extend-C18為色譜柱，以甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)為流動相；檢測波長為254 nm，測定飲片的大黃素含量；以乙腈-水(23∶77)為流動相；檢測波長為306 nm，測定飲片的虎杖苷含量。結(jié)果見表3。

2.2 虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備[9]

根據(jù)前期的預(yù)實驗，確定虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法為：取虎杖飲片150 g，加水煎煮二次，一煎加8倍水，浸泡30 min，煮沸，保持微沸煎煮20 min，200目篩網(wǎng)過濾；二煎加6倍水，煮沸，保持微沸煎煮15 min，200目篩網(wǎng)過濾，合并水煎液，立即冷卻至室溫，進行真空冷凍干燥，得到虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑干燥粉末，收膏率見表2。

續(xù)表2

飲片批號飲片投料量(g)標(biāo)準(zhǔn)湯劑批號標(biāo)準(zhǔn)湯劑收粉量(g)標(biāo)準(zhǔn)湯劑收膏率(%)HZ180409150.2HZBT18040925.517.0HZ180410150.6HZBT18041026.617.6HZ180411150.4HZBT18041124.816.5HZ180412150.4HZBT18041226.117.3HZ180413150.0HZBT18041326.317.5HZ180414150.3HZBT18041426.617.7HZ180415150.4HZBT18041525.016.6HZ180416150.2HZBT18041625.216.8HZ180417150.0HZBT18041724.316.2HZ180418150.2HZBT18041824.316.2HZ180419150.8HZBT18041924.216.1

由表2計算可知，20批虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率的范圍為14.9%～19.0%，平均值為17.1%，平均值的70%～130%的范圍為12.0%～22.2%。

2.3 虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測定

2.3.1 色譜條件 采用Agilent ZORBAX Extend-C18色譜柱(柱長為250 mm，內(nèi)徑為4.6 mm，粒度為5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～45 min，15%～65%A)；流速為mL·min-1；柱溫25 ℃；檢測波長分別為254 nm(大黃素)、306 nm(虎杖苷)；進樣體積10 μL。色譜見圖1。

圖1 虎杖苷、大黃素對照品和樣品HPLC色譜

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品約0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇40 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率600 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 線性關(guān)系考察 分別取混合對照品溶液(虎杖苷302.8 μg·mL-1；大黃素23.4 μg·mL-1)1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、6 μL、8 μL注入液相色譜儀，分別得到峰面積，以進樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)計算得到回歸方程，虎杖苷Y=4744X-22.66，r=0.999，線性范圍0.263 4～2.107 5 μg；大黃素Y=5326X-4.133，r=0.999，線性范圍0.263 4～2.107 5 μg，0.023 1～0.184 5 μg；虎杖苷和大黃素在各自范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系。

2.3.4 精密度實驗 取配置的混合對照品溶液按“2.3.1”項下方法連續(xù)進樣6次，記錄虎杖苷和大黃素的峰面積，計算得到虎杖苷峰面積的RSD為1.3%(n=6)，大黃素峰面積的RSD為0.8%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性實驗 取本品(批號HZBT180218)0.1 g，精密稱定6份，按照擬定的方法制成供試品溶液，按“2.3.1”項下方法進樣分析，計算6份供試品含量的RSD值，得到虎杖苷含量RSD為1.2%(n=6)，大黃素RSD為0.6%(n=6)，符合要求，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h測定虎杖苷和大黃素色譜峰面積，計算得到虎杖苷峰面積的RSD為0.6%(n=6)，大黃素峰面積的RSD為0.9%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收實驗 取已知含量的供試品(批號HZBT180218，虎杖苷5.52%，大黃素0.29%)0.05 g，共6份，精密稱定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑中兩成分的含量按1∶1 的比例添加虎杖苷對照品和大黃素對照品，按擬定的方法進行供試品溶液的制備并測定，計算回收率，得虎杖苷平均回收率為101.86%，RSD為1.03%(n=6)；大黃素平均回收率為97.54%，RSD為0.52%(n=6)，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.3.8 虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測定 按擬定的方法對20批虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑進行虎杖苷和大黃素含量測定，并計算其轉(zhuǎn)移率(轉(zhuǎn)移率=標(biāo)準(zhǔn)湯劑中虎杖苷(大黃素)量/飲片中虎杖苷(大黃素)量×100%)，結(jié)果見表3。

表3 虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測定結(jié)果

結(jié)果表明，虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑中虎杖苷含量范圍為3.2%～8.2%，均值為6.4%，大黃素含量范圍為0.2%～0.4%，均值為0.3%；虎杖苷轉(zhuǎn)移率為19.2%～42.7%，平均值31.2%；大黃素轉(zhuǎn)移率為1.8%～3.2%，平均值2.4%。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 色譜條件 采用Agilent ZORBAX Extend-C18色譜柱；(柱長為250 mm，內(nèi)徑為4.6 mm，粒度為5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～45 min，15%～65%A)；流速為1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長為280 nm；進樣體積10 μL。樣品圖譜見圖2。

2.4.2 對照品溶液制備 取虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL各含50 μg的溶液，即得。對照品圖譜見圖2。

2.4.3 供試品溶液的制備 同“2.3.2”項下供試品溶液制備方法。

2.4.4 精密度試驗 取同一批虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，按“2.4.1”項下方法連續(xù)進樣6 次，以虎杖苷(2號峰)為參照峰，計算各共有峰保留時間和峰面積的RSD，結(jié)果表明各峰保留時間RSD<0.1%(n=6)，相對峰面積RSD<2.0%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗 平行制備6 份虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，按“2.4.1”項下方法進樣，測定供試品溶液中各共有峰的保留時間和峰面積。以虎杖苷(2號峰)為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD，結(jié)果表明各峰相對保留時間的RSD<0.10%(n=6)，相對峰面積的RSD<1.8%(n=6)，表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 取虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，分別于供第0、2、4、8、12、20、24 h按“2.4.1”項下方法進樣測定，以虎杖苷( 2號峰) 為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果各峰相對保留時間的RSD<0.10%(n=6)，相對峰面積的RSD<3.0%(n=6)，表明虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 樣品檢測與分析 分別取20批虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件分別測定，記錄HPLC 圖，生成對照圖譜，見圖3。將20批供試品色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2012版)，以HZBT180218色譜圖為參照，采用中位數(shù)法，時間窗為0.1，進行相似度計算，見圖4、表4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)20 批虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對照指紋圖譜相似度均大于0.95，表明各批次虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有較好的一致性。

2.虎杖苷；4.白藜蘆醇；10.大黃素

2.虎杖苷；4.白藜蘆醇；10.大黃素

圖4 20批標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC色譜

表4 20批標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度計算結(jié)果

3 討論

3.1 虎杖樣品來源

產(chǎn)區(qū)調(diào)查表明，虎杖藥材現(xiàn)主產(chǎn)于四川、貴州、浙江、安徽、陜西等省。本研究收集了20批來自四川達州、南充、廣安，浙江麗水，安徽安慶、池州，陜西漢中，貴州畢節(jié)、銅仁等多個省市的虎杖藥材，產(chǎn)地來源基本覆蓋了虎杖的傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)、主產(chǎn)區(qū)和主要種植區(qū)，樣品收集具有較強的代表性，能充分反映目前市場上的虎杖藥材情況。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝的合理性

本研究中虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑參照國家藥典委員會公布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)》和《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》中的相關(guān)規(guī)定，遵循中醫(yī)藥理論，按照臨床湯劑煎煮方法規(guī)范化煎煮，固液分離，利用真空冷凍干燥設(shè)備進行干燥，制得干燥粉末，最大限度保存了水煎液中的成分，達到與傳統(tǒng)湯劑基本一致。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量測定和指紋圖譜分析

本研究建立的分析方法是采用同一個梯度洗脫系統(tǒng)，同時采集三個波長進行虎杖苷(306 nm)、大黃素(254 nm)和指紋圖譜(280 nm)分析，該方法簡便快捷，可應(yīng)用于虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑分析。

分析結(jié)果表明20批標(biāo)湯中的虎杖苷含量遠高于飲片，但大黃素含量遠低于飲片，轉(zhuǎn)移率虎杖苷可達30%以上，但大黃素不足4%；這應(yīng)跟兩成分的水溶性有關(guān)：虎杖苷微溶于水，而大黃素幾乎不溶于水。20 批虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對照指紋圖譜相似度均在0.95以上，表明各批次虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有較好的一致性，質(zhì)量相對較穩(wěn)定，說明本實驗建立的虎杖飲片指紋圖譜中10 個共有峰及對照指紋圖譜可反映其指紋特征，具有鑒別評價意義。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的應(yīng)用及意義

中藥配方顆粒具有服用方便、易于攜帶、質(zhì)量穩(wěn)定等特點，這種新的飲片用藥形式是對傳統(tǒng)飲片的有益補充，但也存在標(biāo)準(zhǔn)不明確、劑量不統(tǒng)一、臨床合理性有待進一步論證等各種問題。中藥臨床多為湯劑，湯劑也是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用最早、目前臨床應(yīng)用最廣泛的劑型，所以，亟需建立中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑用于標(biāo)準(zhǔn)化中藥配方顆粒[9]。

本研究制備了 20批虎杖標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，并以虎杖苷、大黃素等有效成分為質(zhì)控指標(biāo)，結(jié)合指紋圖譜對標(biāo)準(zhǔn)湯劑的化學(xué)成分進行整體把控，得到相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果，該研究可以為虎杖配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究建立提供參考依據(jù)，保證成品與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量一致性。