周 蓉，曹 峰，劉 楊，陳開宇，郭宇弘，王雅霞

(貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025)

幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp以下簡稱)是一種從胃黏膜內(nèi)分離出來的螺旋狀彎曲桿菌，與許多惡性腫瘤和非惡性疾病相關[1]，被國際癌癥機構(gòu)列為第一類致癌因子[2]，在人群中傳播，全球人群感染率高達50%以上[3-4]，嚴重影響人類健康。目前認為幽門螺旋桿菌感染是能夠預防胃癌最重要且可控的一個危險因素[5]。Hp感染關乎我國國計民生，更是消化科的熱點，而根除它并非易事，抗生素的廣泛應用使得治療出現(xiàn)了瓶頸[6]，非抗生素的治療越來越被研究者重視，目前已發(fā)現(xiàn)一些中藥在Hp根除治療中有可觀的療效，中藥抗Hp研究也在醫(yī)學界備受關注[7]，中國幽門螺旋桿菌治療共識建議考慮將中藥用于Hp根除。基于對地區(qū)環(huán)境及當?shù)鼐用耋w質(zhì)與前期研究等發(fā)現(xiàn)茯苓甘草湯能有效改善胃腸不適的癥狀，故開展茯苓甘草湯對Hp感染的研究。本文主要進行體外的抑菌實驗研究，分析茯苓甘草湯及方中有效成分體外抑菌作用，探討其治療Hp的作用機制，為進一步研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 動物及菌株

動物：12只SD雌性大鼠，體重為180～220 g，由長沙天勤生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2019-0014。

菌株：Hp SS1菌株，來自國家疾病控制和預防中心。

1.2 藥物與材料

藥物：實驗所用到中藥購于貴州同濟堂藥房：炙甘草片(生產(chǎn)批號：19060101)、茯苓(生產(chǎn)批號：1905101)、桂枝(生產(chǎn)批號：C190423)、肉桂(生產(chǎn)批號：C190426)、生姜購于農(nóng)貿(mào)市場。

材料：哥倫比亞血培養(yǎng)基(生產(chǎn)編號：HB0124)、幽門螺旋桿菌添加劑(生產(chǎn)編號：HB8646a)、腦心浸液(生產(chǎn)編號：HB8297-1)、尿素酶試劑 (生產(chǎn)編號：GS004)、氧化酶試紙(生產(chǎn)編號：HB2100)、革蘭染色試劑盒(生產(chǎn)編號：HB878)均購于青島海博；無菌脫纖維羊血由河南巨石生物有限公司提供；麥氏比濁管由環(huán)凱生物有限公司提供；厭氧培養(yǎng)盒、微需氧產(chǎn)氣袋來自日本三菱瓦斯化學株式會社；游標卡尺。

1.3 主要儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠) 、恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)、電子天平(日本島津)、CX21型光學顯微鏡(日本Olympus公司提供)、高壓滅菌鍋(上海安亭)、無菌操作臺等。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基制備

固體培養(yǎng)基由哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基每93 mL加1支1 mL幽門螺旋桿菌添加劑作為抗生素+7%無菌脫纖維羊血，傾入無菌平皿。保存液制備：腦心浸液加30%甘油高壓滅菌冷卻，每1 mL分裝入無菌保存管中。4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 Hp鑒定及菌液制備

在制作好的固體培養(yǎng)基上涂布平板法接種Hp菌液后放入微需氧環(huán)境下37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，超凈工作臺下打開后肉眼觀察菌落生長情況，革蘭染色顯微鏡下觀察菌體形狀，快速尿素酶試驗、氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗等方法檢測細菌情況。檢測結(jié)果均為陽性后將細菌進行保存，濃度用麥氏比濁法調(diào)至0.5麥氏濁度，即每管保存液中細菌濃度為1×108CFU/mL。

2.3 中藥水煎液制備

將茯苓、炙甘草、生姜、桂枝、肉桂單味中藥及茯苓甘草湯原方、肉桂方各藥劑量按經(jīng)方比例3∶2∶2∶1配制換算，8倍蒸餾水浸泡30 min后煎煮30 min，再用6倍雙蒸水浸泡煎煮2次，將3次煎液合并后用雙層紗布過濾，80 ℃熱水浴揮發(fā)濃縮至1∶1水煎液，最后得水煎液中含生藥量為1 g/mL。放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 藥敏紙片瓊脂擴散法測抑菌圈直徑

取6 mm無菌空白藥敏紙片加入1 mL中藥水煎液，浸泡過夜后取出紙片于干燥無菌管中密封，放入50～60 ℃烘干箱中干燥，直至干燥完全。取濃度為1×108CFU/mL的Hp保存液100 μL，用一次性L棒充分涂勻平板，待菌液干燥后等間距的放置4個藥敏紙片，將平板倒放在裝有微需氧產(chǎn)氣袋的厭氧培養(yǎng)盒中，充分密封后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h后取出，測量抑菌圈直徑，同種藥物重復5次。

2.5 打孔法測抑菌圈直徑

用L棒均勻涂布濃度為1×108CFU/mL的Hp保存液100 μL于哥倫比亞血平板上，待菌液稍干燥后，用打孔的方法在平板上等間距打上直徑為6 mm的小孔，每個小孔用移液槍注入不同藥物水煎液50 μL，微需氧環(huán)境下恒溫培養(yǎng)72 h后測抑菌圈直徑，同種藥物重復3次。

2.6 抗生素敏感度判定標準(抑菌圈直徑標準)

高敏抑菌作用的抑菌圈直徑>15 mm；中敏感度抑菌的抑菌圈直徑10～15 mm；低敏感度的抑菌圈直徑5～10 mm；無抑菌效果的抑菌圈為直徑<5 mm或者無明顯抑菌圈。

3 實驗結(jié)果

3.1 Hp檢測鑒定

用接種環(huán)挑取培養(yǎng)72 h后血平板上的少量菌落，快速尿素酶試驗在約2 min左右變?yōu)槊导t色(圖1A)，白色氧化酶試紙蘸有細菌后立即變藍色(圖1B)，觸酶試驗立即產(chǎn)生大量氣泡(圖1C)，革蘭染色顯微鏡下觀察，有螺旋狀、海鷗狀，少量可見球狀或桿狀的革蘭陰性菌(圖1D)。顯微鏡下觀察的形狀與Hp相似，快速尿素酶試驗、氧化酶試驗、觸酶試驗均呈陽性，符合Hp理化性質(zhì)，提示Hp培養(yǎng)成活。

3.2 藥物水煎液抑菌作用的結(jié)果

藥敏紙片法(見圖2)測定茯苓甘草湯及單味中藥抑菌圈直徑結(jié)果見表1，打孔法抑菌圈直徑結(jié)果見表2，綜合兩種測抑菌圈直徑方法的結(jié)果可得出，甘草、生姜、茯苓甘草湯原方、肉桂方體外抑制Hp有中敏感度抑菌作用，桂枝、肉桂對Hp的抑菌作用較低，茯苓對Hp體外藥敏紙片法抑菌中未見明顯抑菌圈，打孔法邊緣均有不同程度的Hp生長，由此判斷茯苓對Hp無明顯抑菌作用，將高敏和中敏視為敏感可得炙甘草、生姜、茯苓甘草湯原方及肉桂方為敏感。

注：鑒定結(jié)果：A.快速尿素酶試驗陽性；B.氧化酶試驗陽性；C.觸酶試驗陽性；D.顯微鏡觀察(×100)

圖1 Hp生化鑒定結(jié)果和顯微鏡

中醫(yī)用藥遣方主要講究君臣佐使的配伍，通過藥物復方之間相互作用來改善機體，在機體內(nèi)產(chǎn)生藥理效應，而單純的藥物水煎液未經(jīng)過代謝的過程，無法真實反映體內(nèi)量效關系，體外抑菌與體內(nèi)殺菌存在一定程度的差距，為全面了解茯苓甘草湯對Hp的作用機制，在藥物水煎液抑菌的基礎上給動物灌入不同濃度方藥水煎液后，在血清含藥量達高峰時取動物含藥血清進行體外抑菌實驗。

3.3 含藥血清抑菌測定

將茯苓甘草湯原方及肉桂方按劑量比例大小分為高、中、低劑量(40 g/kg；20 g/kg；10 g/kg)給大鼠灌胃連續(xù)7 d，后1 d連續(xù)2次灌胃，中間間隔2 h，末次給藥3 h后腹主動脈采血放置1 h，離心抽取血清，滅活除菌，制備出含藥血清，用打孔法(如圖3)測定含藥血清對Hp的抑菌作用，每組血清重復5次。結(jié)果如表3所示，得出茯苓甘草湯原方不同劑量對Hp的抑菌無明顯差距，茯苓甘草湯肉桂方的高劑量較中、低劑量抗Hp敏感，原方的不同劑量與肉桂方中的高劑量均為中敏感度抑菌作用，可將茯苓甘草湯原方高、中、低劑量及肉桂方高劑量視為敏感。

注：1.茯苓甘草湯水煎液組；2.生姜水煎液；3.茯苓甘草湯等量替換的肉桂組；4.茯苓水煎液

圖2 藥敏紙片瓊脂擴散法

注：均為茯苓甘草湯含藥血清：1.高劑量組；2.中劑量組；3.低劑量組

組別藥物濃度(g生藥·mL -1)抑菌圈直徑(mm)茯苓1.0g·mL-10甘草1.0g·mL-113.03±0.85桂枝1.0g·mL -19.41±0.33生姜1.0g·mL -111.99±1.64肉桂1.0g·mL -19.12±0.48茯苓甘草湯原方1.0g·mL-111.84±0.85茯苓甘草肉桂方1.0g·mL-112.09±0.97

組別藥物濃度(g生藥·mL-1)抑菌圈直徑(mm)茯苓1.0g·mL-10甘草1.0g·mL-111.74±0.56桂枝1.0g·mL-19.21±0.42生姜1.0g·mL-112.90±0.29肉桂1.0g·mL-19.43±0.31茯苓甘草湯原方1.0g·mL-112.12±0.33茯苓甘草肉桂方1.0g·mL-111.56±0.19

中藥名藥物濃度(g生藥mL-1)抑菌圈直徑(mm)茯苓甘草湯原方5.0 (高劑量組)13.37±0.432.5(中劑量組)12.65±0.651.25(低劑量組)12.79±0.67苓甘草湯肉桂方5.0(高劑量組)12.46±0.662.5(中劑量組)9.70±1.241.25(低劑量組)9.41±0.76

4 討論

我國是世界上人口最多的國家，Hp感染人口也最多，特別是飲食衛(wèi)生環(huán)境差、經(jīng)濟較落后的地區(qū)感染率更高，貴州地區(qū)的平均感染率高于全國平均水平[8]。當前治療Hp主流是依賴抗生素，取得了一定的療效，但近年來發(fā)現(xiàn)抗生素耐藥、副作用發(fā)生、療效欠穩(wěn)定的問題，使得Hp根除率受到了嚴重的影響，Hp根除的新路徑是今后研究的方向，對Hp根除使用中醫(yī)藥治療方法是一種新的選擇。

中醫(yī)沒有關于Hp感染相關的病名，主要是通過整體觀念來認識疾病的發(fā)生、了解疾病的發(fā)展，進而對疾病進行預防和治療。大多數(shù)中醫(yī)學者認為脾胃虛弱是Hp感染致病之本[9]，脾胃虛弱，運化無力而痰飲內(nèi)生，體內(nèi)脾胃陽氣虧虛，失于溫運則水濕停聚于體內(nèi)。形成的痰飲水濕反作用為Hp在體內(nèi)的附著、繁殖和致病提供條件。脾胃虛弱為Hp定植在胃黏膜上提供前提條件[10]，形成的水飲停聚于體內(nèi)的現(xiàn)象又為Hp在胃黏膜的繁殖提供有利條件[11]，這一病變機理與中醫(yī)的胃虛飲停證不謀而和，運用中醫(yī)思維來治療疾病，以扶正祛邪為基本治療原則，代表方為茯苓甘草湯。茯苓淡滲利水，桂枝通陽化氣，生姜溫胃陽辛散水氣，甘草健脾和中，調(diào)和諸藥，四藥共奏溫胃化飲、通陽利水之功效來治療Hp感染引起的疾病。

茯苓甘草湯中茯苓、生姜、甘草均屬藥食同源之物，安全性高。組方中的桂枝與藥食同源的肉桂來自同一樟科植物的一部分[12]，為了使藥物組方更安全，實驗結(jié)果被推廣應用，以及能夠在日常生活中自行食用預防性用藥的角度考慮，在開展茯苓甘草湯對Hp的研究時，增加一組將全方中桂枝同等量換為肉桂的茯苓甘草肉桂湯方進行實驗比照。

本次實驗中發(fā)現(xiàn)茯苓經(jīng)過多次抑菌圈測定都無抑菌作用，早期文獻中也有報道[13]，但近期有研究報道茯苓水提物對Hp有一定抑菌作用[14]，與本次實驗有差異，考慮藥物提取存在差異，有抑菌作用的茯苓實驗中茯苓多糖的抑菌作用較茯苓水煎液差，說明茯苓抑制Hp的主要成分不是多糖成分，實驗用80 ℃回流提取，而本次實驗是通過煎煮的方法，溫度遠超過80 ℃，考慮有效成分可能被破壞。中藥體外抑菌是中醫(yī)抗Hp研究的基礎，為了真實有效對比抑菌情況，需要對中藥材的生產(chǎn)進行嚴格的監(jiān)控，中藥的煎煮問題、藥敏實驗方法等都需建立起規(guī)范公認的方法。

本文根據(jù)當?shù)貫镠p高發(fā)地區(qū)，地處寒濕氣候，當?shù)鼐用裣彩撤矢屎裎?、辛辣、酒食的飲食習慣，故痰濕體質(zhì)多見，從中醫(yī)角度認為Hp致病與胃虛水飲發(fā)病機制類似，治療時從“溫藥和之”治療思想考慮，故用茯苓甘草湯溫胃陽化水飲治Hp，通過體外研究得到一定的驗證，體內(nèi)治療Hp及茯苓甘草湯等質(zhì)量替換肉桂的預防性實驗，有待進一步研究。