王 琳，王寶娟，鄭曙光

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

膝骨性關(guān)節(jié)炎 (Knee Osteoarthritis，KOA) 是一種以膝關(guān)節(jié)軟骨變性、缺損、軟骨下骨質(zhì)及關(guān)節(jié)邊緣骨贅生成等為病理特征的慢性退行性疾病，常見于中老年人群。由于其發(fā)病機制多而復(fù)雜、病程長、易復(fù)發(fā)、不可逆性的特點，導(dǎo)致該疾病致殘率極高，嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量[1]。膝關(guān)節(jié)滑膜炎是一種以膝關(guān)節(jié)腫痛、積液、活動不便及功能受限為主要臨床癥狀的骨傷科常見疾病，由慢性勞損或急慢性創(chuàng)傷造成滑膜細(xì)胞增多、血管生成和炎性細(xì)胞浸潤等病理改變，并由此而發(fā)的非感染性炎癥[2]。隨著科學(xué)的進步，針對膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的研究，人們不再局限于對關(guān)節(jié)軟骨和軟骨細(xì)胞病理改變的關(guān)注上，而是逐步明確滑膜炎癥與鄰近軟骨之間的關(guān)系，以及在膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的始末中所充當(dāng)?shù)闹匾巧??；そM織中分布著一些游離神經(jīng)，且作用于這些游離神經(jīng)中的神經(jīng)因子和蛋白的高表達被認(rèn)為與膝骨性關(guān)節(jié)炎癥狀的產(chǎn)生與變化有關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，滑膜炎癥產(chǎn)生的促炎介質(zhì)可打破軟骨基質(zhì)合成與降解間的平衡，改變關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)，再加上過多產(chǎn)生的蛋白水解酶的理化作用，使膝關(guān)節(jié)的退變進程加快，反向而論，軟骨的改變也會加劇滑膜炎癥，造成惡性循環(huán)[4]。中醫(yī)針對KOA的治療，方式多樣、療效顯著，并在預(yù)防和緩解臨床癥狀、減輕患者痛苦、提高生活質(zhì)量方面優(yōu)于西藥，且毒副作用較小[5]。本研究通過對KOA家兔模型治療前后滑膜組織的各項指標(biāo)表達的分析，探討苗醫(yī)熏蒸驗方對膝關(guān)節(jié)滑膜炎的治療效果，以及對膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)展進程的延緩作用。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

取50只體質(zhì)量為(2.0±0.2)kg的成年健康新西蘭大白兔，雌雄各半，由重慶騰鑫養(yǎng)殖公司提供，許可證號：SCXK(渝)2017-0010，標(biāo)準(zhǔn)清潔級動物房飼養(yǎng)，室溫下給予復(fù)合飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑

骨炎消是由黑骨藤、透骨香、大血藤、小血藤、飛龍掌血、蜘蛛香、淫羊藿等12味藥材組成的苗藥經(jīng)驗方，均購于貴州同濟堂；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒，批號：C0105，購自碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，批號：CW0014S，購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；蛋白上樣Maker，批號：26625，購自Thermo生物有限公司；SDS-PAGE上樣緩沖液，批號：BL502A，購自biosharp生物科技有限公司；碘乙酸鈉，批號：305-53-3 BR，購自上海萌芽生物科技有限公司；β-Actin，批號：ab6040，購自abcom生物科技有限公司；PMSF(批號：R0010)、高效RIPA組織裂解液(批號：R0010)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號：P1200-2)均購自北京索萊寶生物科技有限公司；Rabbit Anti-TNF-α(批號：bs-33207M)、Rabbit Anti-NF-κB p65(批號：bs-0465R)、Rabbit Anti-P38 MAPK(批號：bs-0637R)、Rabbit Anti-IL-1β(批號：bs-0862R)均購自北京博奧森生物有限公司。

1.3 主要儀器

切片機，型號：RM2245，德國萊卡公司；高速冷凍離心機，型號：TGL20M，長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；百樂凝膠圖像分析儀，型號：ChemiDocTM Touch imaging systerm，成都百樂科技有限公司；水平電泳儀，型號：JY300，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 實驗分組

將50只體質(zhì)量為(2.0±0.2)kg的成年新西蘭大白兔，雌雄各半，隨機分為正常組、模型組、陽性組、早期苗熏組和苗藥熏蒸組，每組各10只。根據(jù)王興桂等[6]前期的實驗數(shù)據(jù)顯示，將苗藥熏蒸組與清水熏蒸組進行對照治療后，其結(jié)果表明二者是具有統(tǒng)計學(xué)差異的，故本實驗不再增設(shè)清水熏蒸組作為對照治療。

2.2 造模方法

先用生理鹽水溶解碘乙酸鈉，且按照7.5 mg/kg的比例配置成實驗所需的不同濃度(根據(jù)家兔體重可得：將15 mg的碘乙酸鈉粉末用0.2 mL的生理鹽水溶解，所配置的碘乙酸鈉溶液為建立KOA模型實驗所需的最小濃度)。在無菌環(huán)境下把家兔置于解剖臺上，仰臥位固定，左膝關(guān)節(jié)微屈，剪掉膝關(guān)節(jié)周圍絨毛并進行消毒，用1 mL注射器由髕骨內(nèi)側(cè)下方斜上刺入關(guān)節(jié)腔，注入20%烏拉坦(4 mL/kg)進行麻醉，除去正常組不做任何處理外，其余4組各注射0.2 mL碘乙酸鈉溶液，若進針后出現(xiàn)落空感，即為注射成功。

2.3 各組給藥方法

正常組：清潔級動物房正常飼養(yǎng)，不做藥物干預(yù)。模型組：造模后放置清潔級動物房正常飼養(yǎng)，不做藥物干預(yù)。陽性組：造模成功(關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸鈉2周)后，膝關(guān)節(jié)上下各 4 cm范圍給予扶他林軟膏外用進行治療，每天1次，1.2 g/次，連續(xù)6周。早期苗熏組：造模后的第一天便給予苗藥熏蒸液做熏蒸治療，30 min/d，每天1次，連續(xù)8周。苗藥熏蒸組：造模成功(關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸鈉2周)后，給予苗藥熏蒸液做熏蒸治療，30 min/d，每天1次，治療6周。

2.4 熏蒸方法

(1)首先在超聲波霧化器裝置中倒入苗藥熏蒸濃縮液，溫度調(diào)至60 ℃，將熏蒸治療時的藥液蒸汽溫度控制在35～40 ℃；(2)為利于藥液吸收，剪掉膝關(guān)節(jié)周圍的兔毛，將充分暴露膝關(guān)節(jié)后的家兔仰臥位固定在兔解剖臺上；(3)使用固定器把與超聲波霧化器相連結(jié)的軟管固定在家兔的膝關(guān)節(jié)位置，進行熏蒸治療。

2.5 組織取材及處理

無菌環(huán)境下處死家兔，在髕骨上端用手術(shù)刀橫切斷各層組織，完全暴露膝關(guān)節(jié)腔，用鑷子在髕骨下端與脛骨上端的交界處取出左后肢的滑膜組織，一部分置于4 ℃、4%的多聚甲醛中固定保存24 h，石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察各組滑膜組織形態(tài)及免疫組化檢測；剩余標(biāo)本分裝于5 mL離心管中，放入-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?，為后續(xù)western blot檢測做準(zhǔn)備。

2.6 滑膜組織HE染色

將各組滑膜組織切片置二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各10 min；100%Ⅰ、100%Ⅱ、90%、80%、70%梯度乙醇中各5 min，蒸餾水中5 min；水化后放入蘇木精中8 min，使細(xì)胞著色；自來水沖洗掉多余的蘇木精染液，滴加伊紅進行染色，2 min，水洗；95%乙醇脫水2 min、二甲苯透明5 min，各2次；中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2.7 免疫組織化學(xué)檢測IL-1β與TNF-α的炎性表達

脫蠟：將石蠟切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各10 min；水化：100%Ⅰ、100%Ⅱ、90%、80%、70%梯度乙醇中各5 min，蒸餾水中5 min；置于枸櫞酸緩沖液中抗原修復(fù)，修復(fù)過程：微波爐中高溫3 min后轉(zhuǎn)低溫20 min，自然冷卻至室溫，PBS(0.01 mol/L、 pH =7.4)漂洗20次，各3 min；滴加阻斷內(nèi)源性過氧化物酶—封閉液—一抗—生物素標(biāo)記山羊抗兔IGg聚合物—辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液；DAB顯色，蒸餾水沖洗后滴加蘇木素染液進行復(fù)染；脫水、透明、封片、閱片并拍照記錄。

2.8 蛋白免疫印跡法檢測NF-κB和p38的蛋白表達

各組稱取100 mg滑膜組織放入研缽中，不斷加入液氮以保持組織脆性，將其充分研磨至粉末狀；把樣本與1 mL含1 mmol/L PMSF的蛋白裂解液充分混勻后，為使蛋白充分裂解需放置于4 ℃冰箱內(nèi)靜置40 min；12 000 r/min，4 ℃低溫離心10 min，收集上清液，用BCA法測定各組樣品的蛋白濃度；SDS-PAGE技術(shù)分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，配置5%脫脂奶粉封閉液50 mL，室溫?fù)u床上封閉1 h；TBST緩沖液洗膜3次，5 min/次，然后將膜轉(zhuǎn)入自封袋中，加入一抗2 mL進行孵育，封口后放入4 ℃冰箱過夜；TBST緩沖液洗膜3次，5 min/次，加入二抗，室溫孵育2 h；再次洗膜除去二抗，滴入ECL發(fā)光液2 min后，凝膠成像系統(tǒng)顯影并分析條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 光鏡下觀察各組家兔滑膜組織HE染色形態(tài)學(xué)變化

與正常組相比，模型組的滑膜細(xì)胞增多、排列緊密，組織明顯增厚，全層均有大量炎細(xì)胞浸潤和成纖維細(xì)胞增生，且有血腫與血管生成；與模型組相比，陽性組、早期苗熏組和苗藥熏蒸組的滑膜細(xì)胞排列較為疏松，組織增生程度減輕，但仍有少量的炎性細(xì)胞浸潤和血管生成。如圖1所示。

3.2 免疫組織化學(xué)檢測IL-1β與TNF-α的炎性表達

與模型組相比，正常組、陽性組、早期苗熏組和苗藥熏蒸組滑膜細(xì)胞IL-1β和TNF-α的IOD值均低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；陽性組、早期苗熏組和苗藥熏蒸組三組間滑膜細(xì)胞IL-1β和TNF-α的IOD值，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖2、圖3。

組別IL-1βTNF-α正常組36.56±3.51*31.04±5.13*模型組102.97±8.6790.57±8.06陽性組49.99±3.55*46.29±5.45*早期苗熏組82.48±9.38*#76.44±9.73*#苗藥熏蒸組63.96±4.99*#58.05±6.51*#

注：與模型組相比，*P<0.05；與陽性組相比，#P>0.05。

圖1 各組滑膜組織HE染色結(jié)果(×200)

圖2 各組滑膜組織IL-1β和TNF-α免疫組化(×200)

注：與模型組相比，*P<0.05；與陽性組相比，#P>0.05

3.3 蛋白免疫印跡法檢測NF-κB和p38的蛋白表達

與模型組相比，正常組、陽性組、早期苗熏組和苗藥熏蒸組滑膜組織中NF-κB和p38的蛋白表達水平均低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；陽性組、早期苗熏組和苗藥熏蒸組3組滑膜組織中的NF-κB和p38蛋白差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖4、圖5。

組別NF-κB/β-actinp38/β-actin正常組0.35±0.08*0.43±0.10*模型組1.51±0.221.45±0.03陽性組0.51±0.09*0.43±0.06*早期苗熏組0.53±0.23*#0.52±0.01*#苗藥熏蒸組0.55±0.09*#0.51±0.03*#

注：與模型組相比，*P<0.05；與陽性組相比，#P>0.05。

注：與模型組相比，*P<0.05；與陽性組相比，#P>0.05

4 討論

膝關(guān)節(jié)滑膜炎屬中醫(yī)“痹證”“傷筋”“鶴膝風(fēng)”范疇，是因風(fēng)、寒、濕、熱邪氣侵襲關(guān)節(jié)，加上外傷、勞損等外部誘因，造成局部氣血運行不暢、正氣虧虛，使水濕之邪乘虛而入[7]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，滑膜炎積液是由筋脈閉阻、濁濕流注關(guān)節(jié)所致，且關(guān)節(jié)腔內(nèi)積血積液，易瘀久化熱、濕熱相持，使關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹、皮溫升高、筋肉拘攣、屈伸不利甚至僵硬等癥狀[8]。洪素蘭認(rèn)為，膝關(guān)節(jié)滑膜炎看似局部病變，實與內(nèi)臟、精、氣、血、陰陽密切相關(guān)，其基本病機為“肝脾腎虧虛，痰濕瘀血阻滯”，肝脾腎虛為其本，痰濕瘀阻滯為其標(biāo)[9]。所謂“不通則痛”，熏蒸療法正是從病理上治療此癥，通過皮膚滲透，從而擴張血管，促進局部血液循環(huán)，增強滑囊內(nèi)液體吸收，達到消炎止痛、除濕散瘀、舒筋通絡(luò)的作用，且方法簡便易行、療效確切和無毒副作用等特點，更是體現(xiàn)出濃郁的苗族特色和鄉(xiāng)土氣息。

骨炎消為黔南、黔東南地區(qū)的民間收集驗方，由黑骨藤、透骨香、大血藤、小血藤、雞血藤、飛龍掌血、蜘蛛香、淫羊藿等12味藥組成，方中黑骨藤味苦、辛，性涼，具有很好的抗炎和鎮(zhèn)痛作用，且疏通筋骨、活血止痛、祛風(fēng)除濕、解毒；透骨香味辛，性平，具有清熱解毒、活血祛瘀、祛風(fēng)除濕、降氣平喘等作用，與蜘蛛香共用可祛風(fēng)除濕、表出毒邪，使機體祛除“外毒內(nèi)亂”，恢復(fù)正常的狀態(tài)，同時蜘蛛香還能理氣和中、調(diào)理脾胃，使氣血能夠得到不斷補充；飛龍掌血，味辛，微苦，性溫，歸脾、胃經(jīng)，散瘀止血、祛風(fēng)止痛、消腫解毒[10-11]。又因“膝者筋之府”，膝關(guān)節(jié)乃經(jīng)筋會聚之所，具有連屬關(guān)節(jié)、絡(luò)綴肢體、主司關(guān)節(jié)運動的功能。當(dāng)筋脈失去血液養(yǎng)分，筋脈不榮導(dǎo)致筋脈攣縮，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動功能發(fā)生嚴(yán)重障礙。方中大血藤、小血藤和雞血藤皆為藤本類植物，苗醫(yī)認(rèn)為這類植物細(xì)長蔓延與人體的筋脈相似，可舒通筋脈、通氣散血。其中，大血藤和雞血藤又具有補血的療效，為軟骨提供必要物質(zhì)，使肌肉、筋骨得以濡養(yǎng)，從而修復(fù)受損滑膜、增強營養(yǎng)補給、減少炎癥滲出、促進積液吸收，以解除關(guān)節(jié)的腫脹、僵硬、疼痛等癥狀，促進功能改善。故上述藥味合用，共奏舒筋活血、消腫止痛、舒筋通絡(luò)之功[12]。而骨碎補、狗脊、杜仲、仙靈脾均有補肝腎、強筋骨之效，為輸送基礎(chǔ)物質(zhì)提供能量。故上述諸藥合用，條理有序、互補長短，既能調(diào)節(jié)內(nèi)亂、排除毒素，又能打通筋脈、提供“氣”“血”，達到治愈疾病的目的，并且療效顯著[13]。課題組前期已經(jīng)證實骨炎消在治療骨性關(guān)節(jié)炎方面具有消炎鎮(zhèn)痛、改善功能的作用，且苗族熏蒸療法在臨床適應(yīng)癥中的免疫系統(tǒng)疾病、肌肉骨骼系統(tǒng)結(jié)締組織疾病、皮膚病的聚集度較高，尤以關(guān)節(jié)炎的治療效果較為突出[14-15]。

圖5 各組滑膜組織NF-κB和p38的蛋白表達

本實驗運用熏蒸療法對KOA家兔模型進行干預(yù)治療，通過滑膜組織相關(guān)炎性指標(biāo)的檢測結(jié)果，表明骨炎消能夠改善模型組的滑膜組織形態(tài)，且降低其IL-1β、TNF-α的炎性表達和增加NF-κB、p38的蛋白表達，從而減輕滑膜組織炎癥反應(yīng)，起到對膝關(guān)節(jié)的保護作用，具有很好的治療效果和推廣價值。但同時，本實驗也存在不足之處，雖然通過熏蒸方式可以降低KOA家兔滑膜組織中的炎性因子和蛋白表達水平，但具體作用在膝關(guān)節(jié)的有效治療時間和濃度還不明確，需進一步探索，且實驗過程中未對各組家兔的體重及膝關(guān)節(jié)周徑、形態(tài)、皮溫做相應(yīng)的監(jiān)測記錄，導(dǎo)致其變化無法進行組間對比；早期苗熏組與成模后進行治療的苗藥熏蒸組間無統(tǒng)計學(xué)差異，說明早期干預(yù)治療對膝關(guān)節(jié)滑膜炎的預(yù)防效果不明顯。