林青華，屈文佳，秦華珍，賈 哲，徐新房，李向日，3*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；3.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102488；4.廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200)

檳榔是棕櫚科植物檳榔(ArecacatechuL.)的干燥成熟種子，其味苦、辛，性溫，歸胃、大腸經(jīng)，具有殺蟲(chóng)、消積、行氣、利水、截瘧之功，用于絳蟲(chóng)病、蛔蟲(chóng)病、姜片蟲(chóng)病、蟲(chóng)積腹痛、里急后重、積滯泄痢、水腫腳氣、瘧疾的治療[1]。檳榔常被炮制成生檳榔、炒檳榔或焦檳榔而用于臨床?，F(xiàn)代研究表明檳榔含有生物堿類、鞣質(zhì)類、油脂類、黃酮類、三萜類和甾體類等多種化學(xué)成分，具有驅(qū)蟲(chóng)、助消化、抗氧化、抗抑郁等多種藥理活性[2-3]。近年來(lái)，檳榔的毒理學(xué)研究結(jié)果表明其具有口腔毒性、肝毒性、心臟毒性、腎毒性等多種毒性反應(yīng)[4-6]，但具體毒性成分仍未完全明確，且檳榔炮制品的毒性研究鮮有報(bào)道。因此，本文采用斑馬魚(yú)為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)生檳榔、炒檳榔和焦檳榔的急性毒性進(jìn)行研究，以期為檳榔毒性成分的篩選提供參考。

1 材料與儀器

1.1 藥材

生檳榔購(gòu)于北京同仁堂藥材有限責(zé)任公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)李向日教授鑒定為棕櫚科植物檳榔ArecacatechuL.成熟種子的炮制品；炒檳榔、焦檳榔為本實(shí)驗(yàn)室依照《中國(guó)藥典》(2015年版)規(guī)定而炒制的合格炮制品。樣品留樣存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院炮制教研室。

1.2 動(dòng)物

AB型斑馬魚(yú)幼魚(yú)(受精卵正常發(fā)育4天)由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供，斑馬魚(yú)親本購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所。

1.3 儀器與試劑

斑馬魚(yú)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛(ài)生科技公司)；LRH-250 Z型恒溫生化培養(yǎng)箱(廣州滬瑞明儀器有限公司)；島津LC-20 A高效液相色譜儀(LC-20 AD泵，SPD-20 A檢測(cè)器，Lcsolution處理軟件，島津公司)；Ultimater ?XB-SCX色譜柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm，月旭科技)；紫外-可見(jiàn)分光光度儀(北京普析通用儀器有限公司)；FA-1004電子分析天平(上海天平儀器廠)；SB 25-12 DTDN型數(shù)控超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

沒(méi)食子酸對(duì)照品(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)20121107，純度99.0%)；檳榔堿氫溴酸鹽(批號(hào)1391，純度>98.0%)購(gòu)于上海施丹德生物技術(shù)有限公司，去甲基檳榔堿氫溴酸鹽(批號(hào)Q-075-170930，純度>98.0%)；檳榔次堿鹽酸鹽(批號(hào)B-084-170928，純度>98.0%)購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司；去甲基檳榔次堿鹽酸鹽(批號(hào)JS20171103，純度>98.0%)購(gòu)于湖北巨勝科技有限公司；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、碳酸氫鈉、氯化鈣、鹽酸、溴水、磷酸、氨水(北京化工廠)，碳酸鈉、鎢酸鈉、硫酸鋰(天津福晨化學(xué)試劑廠)，鉬酸鈉(天津市化學(xué)試劑四廠)，干酪素(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，以上試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 斑馬魚(yú)的養(yǎng)殖與繁育

2.1.1 斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液配制 按照Z(yǔ)ebrafish Book標(biāo)準(zhǔn)，分別適量稱取NaCl、KCl、Na2HPO4、K2HPO4、MgSO4、NaHCO3、CaCl2，最終配成每升含0.14 moL NaCl、5.4 moL KCl、0.25 moL Na2HPO4、0.44 moL K2HPO4、1.3 moL CaCl2、1.0 moL MgSO4和4.2 moL NaHCO3水溶液，即得斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液。

2.1.2 斑馬魚(yú)的養(yǎng)殖及繁育 斑馬魚(yú)在循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中馴養(yǎng)，其水溫為(28±0.5) ℃，pH=7.0～7.2，電導(dǎo)率為450～550 μs/cm，每天黑暗環(huán)境(10 h)與光照環(huán)境(14 h)交替進(jìn)行，以豐年蝦幼蟲(chóng)喂食成年斑馬魚(yú)，每日3次。

暗周期開(kāi)始前，將選取的雄性與雌性成年斑馬魚(yú)按照2∶1的比例放入產(chǎn)卵缸中，用隔板將其分開(kāi)；暗周期結(jié)束后抽去隔板，雄魚(yú)與雌魚(yú)在光照刺激下完成交配，4 h后收集合格受精卵，將其用胚胎培養(yǎng)液清洗干凈后轉(zhuǎn)移到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置生化培養(yǎng)箱中孵育；每日上午更換胚胎培養(yǎng)液并及時(shí)除去死亡胚胎及胎衣，4天后選取發(fā)育正常的斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行急性毒性研究。

2.2 試藥制備

稱取生檳榔、炒檳榔和焦檳榔粉末(過(guò)80目篩)各20 g，分別置500 mL圓底燒瓶中，加10倍量去離子水，回流提取3次，每次1 h；分別合并提取液，減壓濃縮，濃縮液水浴至流浸膏狀，60 ℃減壓干燥，分別得生檳榔、炒檳榔和焦檳榔提取物2.48 g、2.22 g和2.81 g，具體見(jiàn)表1。

表1 生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物的制備 (n=2)

2.3 試藥中生物堿含量測(cè)定

按照本課題組確定的HPLC方法對(duì)生檳榔、炒檳榔和焦檳榔提取物中的生物堿進(jìn)行含量測(cè)定。

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Ultimate XB-SCX (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-磷酸鹽溶液(2 mL磷酸，2 mL氨水→1 000 mL)(72∶28)；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；流速為1 mL/min。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取檳榔堿氫溴酸鹽、去甲基檳榔堿氫溴酸鹽、檳榔次堿鹽酸鹽和去甲基檳榔次堿鹽酸鹽6.40 mg、4.20 mg、3.37 mg和4.90 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解，定容，搖勻，得各對(duì)照品母液；精密移取各對(duì)照品母液1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL和2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，得各對(duì)照品的單標(biāo)溶液；精密移取各單標(biāo)溶液1.0 mL、0.5 mL、0.5 mL、2.0 mL，置于相同的5 mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物12.7 mg、15.3 mg和14.1 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解，定容，搖勻，得各供試品母液；精密移取生檳榔、炒檳榔和焦檳榔母液各2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，分別過(guò)0.45 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，得各供試品溶液。

2.3.4 供試品的測(cè)定及含量計(jì)算 采用上述HPLC方法分別對(duì)供試品和對(duì)照品進(jìn)行檢測(cè)，各樣品平行檢測(cè)2次。通過(guò)外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算各供試品中生物堿的含量，具體計(jì)算公式為：檳榔堿重量=氫溴酸檳榔堿重量/1.521 4，去甲基檳榔堿重量=去甲基檳榔堿氫溴酸/1.573 2，檳榔次堿重量=鹽酸檳榔次堿/1.258 3，去甲基檳榔次堿重量=鹽酸去甲基檳榔次堿重量/1.286 7。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物中生物堿的含量 (n=2)

2.4 試藥中鞣質(zhì)的含量測(cè)定

各供試品中鞣質(zhì)的含量測(cè)定方法參照2015版《中國(guó)藥典》(四部)中“2202 鞣質(zhì)含量測(cè)定法”項(xiàng)下規(guī)定內(nèi)容進(jìn)行檢測(cè)，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物中總鞣質(zhì)的含量 (n=2)

2.5 試藥對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性試驗(yàn)

2.5.1 供試液制備 精密稱取生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物各0.200 8 g，0.200 4 g和0.200 4 g，分別加50 mL胚胎培養(yǎng)液，超聲溶解，制得濃度為4 000 μg/mL的生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物母液，分裝，凍存，用時(shí)根據(jù)所需濃度稀釋即得供試液。

2.5.2 急性毒性研究 選取發(fā)育正常的斑馬魚(yú)幼魚(yú)置于12孔板中，每孔20條，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，次日吸棄各孔培養(yǎng)液，加入4 mL不同濃度的各炮制品供試液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，次日統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)死亡情況并計(jì)算半數(shù)致死濃度(LC50)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。結(jié)果具體見(jiàn)表4。

表4 生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的LC50 (μg/mL)

注：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的機(jī)率單位加權(quán)回歸法(Bliss法) 計(jì)算LC50。

3 討論

斑馬魚(yú)為鯉科短擔(dān)尼魚(yú)屬的一種硬骨魚(yú)，其基因與人類相似度達(dá)87%，且對(duì)藥物的反應(yīng)與人的臨床反應(yīng)類似，并具有個(gè)體小、繁殖量大、實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已成為毒理學(xué)評(píng)價(jià)中重要的模型動(dòng)物[7-8]。研究表明生物堿類和鞣質(zhì)類成分是檳榔的主要成分也是毒性成分[9]，且檳榔經(jīng)炮制后兩者的含量會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。因此，對(duì)生檳榔、炒檳榔和焦檳榔的急性毒性進(jìn)行研究，既可以通過(guò)其LC50值比較檳榔不同炮制品的毒性大小，又可以結(jié)合其生物堿和鞣質(zhì)的含量為檳榔毒性成分的初步篩選提供參考。

檳榔不同炮制品的提取結(jié)果(表1)表明，焦檳榔的提取率(14.03%)較生檳榔(12.39%)和炒檳榔(11.08%)高，這可能與焦檳榔經(jīng)武火炒制后飲片堅(jiān)硬度降低而利于成分溶出有關(guān)。生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物中總生物堿的含量分別為3.24%、2.56%和2.07%(表2)，說(shuō)明檳榔各炮制品中生物堿的總量隨著炒制溫度的升高而降低，這可能與檳榔中小分子生物堿類成分易揮發(fā)有關(guān)；而其總鞣質(zhì)的含量分別為22.72%、26.68%和18.28%(表3)，說(shuō)明檳榔中鞣質(zhì)類成分的含量隨著炒制溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致[10]。

檳榔各炮制品對(duì)斑馬魚(yú)急性毒性的試驗(yàn)結(jié)果表明，生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物對(duì)斑馬魚(yú)的LC50值分別為29.74 μg/mL、32.47 μg/mL和40.03 μg/mL(表4)，說(shuō)明生檳榔經(jīng)不同的溫度炒制后毒性降低，符合中藥“炮制減毒”的基本理論。當(dāng)檳榔各炮制品在LC50值時(shí)，生檳榔、炒檳榔、焦檳榔中總生物堿的含量分別為0.964 μg/mL、0.831 μg/mL和0.829 μg/mL，呈現(xiàn)毒性越大生物堿含量越高的趨勢(shì)，提示生物堿類成分可能是檳榔中的毒性成分，這也與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[9]；而生檳榔、炒檳榔和焦檳榔總鞣質(zhì)的含量分別為6.76 μg/mL、8.66 μg/mL和7.32 μg/mL，與其LC50值不呈量效關(guān)系，但文獻(xiàn)報(bào)道檳榔中的鞣質(zhì)類成分具有毒性甚至致癌性，因此檳榔鞣質(zhì)類成分的毒性仍需要進(jìn)一步研究。此外，檳榔各炮制品對(duì)斑馬魚(yú)LC50值是否完全取決于生物堿、鞣質(zhì)類成分的含量仍有待于研究。

綜上所述，采用斑馬魚(yú)為試驗(yàn)對(duì)象對(duì)檳榔炮制品的急性毒性研究結(jié)果表明生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物對(duì)斑馬魚(yú)的LC50值分別為29.74 μg/mL、32.47 μg/mL和40.03 μg/mL，符合中藥炮制減毒的基本理論，并推測(cè)生物堿類成分可能是生檳榔的毒性成分，而檳榔中鞣質(zhì)類成分的毒性仍有待于進(jìn)一步研究。