王麗娜，羅 竹，黃小朵，徐昌君，嚴(yán)春蘭，駱進(jìn)程，楊長福

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002)

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF)是一種會引起肺間質(zhì)膠原蛋白增生，破壞正常肺泡結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致肺泡數(shù)量減少、閉鎖的疾病。IPF發(fā)病早期細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrixc，ECM)沉積伴隨大量炎癥細(xì)胞浸潤[1]。相關(guān)研究顯示IPF發(fā)病廣泛，主要以中老年人為主，并且患病率呈現(xiàn)上升趨勢[2]，且一旦確診為該疾病，預(yù)后差，生存期短，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。目前，臨床主要以西醫(yī)激素類藥物治療為主，激素類藥物對IPF具有良好的抑制作用。

目前，中醫(yī)治療IPF引起社會各界廣泛關(guān)注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)加減補(bǔ)肺湯(黃芪、黨參、百部、補(bǔ)骨脂、桑白皮、丹參)能改善博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠炎性細(xì)胞浸潤，減輕肺纖維化程度[3]。黃芪、丹參是臨床常用藥物，可以組成藥對，從而擴(kuò)大藥物療效。有實(shí)驗(yàn)研究提示，黃芪、丹參可抑制COPD 肺組織大鼠 NF-κB活化，有利于減輕氣道重構(gòu)[4]，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃芪-丹參藥對在動物實(shí)驗(yàn)中可以有效抑制炎癥，但是否能夠在體外實(shí)驗(yàn)中起到相應(yīng)的作用，目前還缺乏研究。故本實(shí)驗(yàn)研究黃芪-丹參藥對通過體外實(shí)驗(yàn)對小鼠巨噬細(xì)胞活化后炎癥的影響，并探討其與焦亡相關(guān)的可能性。

1 材料

1.1 動物及細(xì)胞株

SPF級雄性SD 大鼠20只，體質(zhì)量200～220 g，許可證號SCXK(湘)2014-0011，購于長沙天勤生物技術(shù)有限公司。RAW264.7單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞，干細(xì)胞庫編號ZQ 0098，購于上海中喬新舟有限公司。

1.2 藥物

黃芪購自貴州同濟(jì)堂中藥飲片有限公司，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為豆科植物蒙黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。

丹參購自貴州同濟(jì)堂中藥飲片有限公司，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為唇形科植物SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根，根據(jù)《中國藥典》2015版，稱取丹參15 g。

黃芪-丹參藥對：根據(jù)《中國藥典》2015版，稱取黃芪47 g，丹參23.5 g，以1倍量水量取，10倍量水浸泡，用武火煮開后文火煎煮30 min，濾過，殘?jiān)?倍量水再煎煮2次，濾過，合并濾液，濃縮過濾藥物至50 mL，取30 mL備用，藥物濃度為0.47 g/mL。

脂多糖(LPS)：北京索萊寶科技有限公司，批號：Lot.No.320V033。

1.3 主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)液(美國Hyclone 公司，批號LOT NO.：319005121)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號18050302)；臺盼藍(lán)染色液(北京索萊寶科技有限公司 Lot No.20151026)；CCK-8檢測試劑盒(東仁化學(xué)科技上海有限公司，批號Lot NN710)；BCA 蛋白定量試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：20180629)，小鼠IL-1β ELISA試劑盒(愛必信(上海)生物科技有限公司，Lot#AB02)；抗體TNF-α(英國Abcam公司，ab1793，批號：GR54204-2)；抗體NF-κB(碧云天 AF1234)；蛋白提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：Lot.No.20190719)，L600臺式低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，編號：7111040047)，Bio-Rad 蛋白凝膠電泳儀(BIO-RAD公司，批號：10006938RevB)，PVDF膜(德國默克公司，Lot.No.R8BA4734F)，SDS-PAGE 凝膠試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，BIO-RAD半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀(批號：690BR023628)，5×電泳液(索萊寶公司，Lot.No.20181022)，轉(zhuǎn)膜液(Bio-Rad公司，cat.#10026938)，10×TBST(索萊寶公司，Lot.No.20181101)，膜再生液(北京索萊寶科技有限公司，Lot.No.20180508)，ECL 超敏發(fā)光液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，Lot.#1815a01)；BIO-RAD 凝膠成相系統(tǒng)(美國 Bio-Rad 公司)。

2 方法

2.1 含藥血清的制備

20只SD大鼠隨機(jī)分為兩組，正常組(10只)、黃芪-丹參藥對組(10只)，適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，進(jìn)行大鼠灌胃，黃芪-丹參藥對組：藥對黃芪-丹參濃縮液0.47 g/mL/d(人與大鼠表皮面積換算公式=標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量/人的體重×6.3)；空白組給予等劑量自來水灌胃，連續(xù)灌胃1周，每天1次，灌胃期間，正常飲食飲水。第7天灌胃2 h后，大鼠麻醉，用一次性無菌注射器腹主動脈取血，收集血清于離心管中，室溫靜置30 min，4 ℃，3 500 r·min-1離心10 min，取細(xì)胞上清液，0.22 μm的微孔濾膜過濾，分裝，-80 ℃保存，使用前56 ℃水浴滅活30 min。

2.2 CCK-8 檢測不同濃度LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞活力

取生長至滿足條件要求的巨噬細(xì)胞(聚合度80%)，胰蛋白酶消化并離心后，重置細(xì)胞懸液并取適量用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，剩余細(xì)胞懸液稀釋至合適的密度，按照分組情況接種到無菌96 孔板中，每孔加入100 μL(約8 000個(gè)細(xì)胞)，12 h后，按0，1，2.5，5，10，25，50，100 μg/mL的LPS 濃度進(jìn)行刺激，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，做好相應(yīng)標(biāo)記。于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后，每孔分別加入10 μLCCK-8 液，用酶標(biāo)儀檢測450 nm光密度值時(shí)各組吸光度A，根據(jù)細(xì)胞活力值=[(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/(對照組-空白組)]×100%計(jì)算各組細(xì)胞活力值。

2.3 細(xì)胞分組與造模

將RAW264.7 細(xì)胞隨機(jī)分為3組，分別為空白含藥血清組(20%空白血清+10 μg/mL LPS)，模型組(10%空白血清+10 μg/mL LPS)，黃芪-丹參藥對含藥血清組(20%含藥血清+10 μg/mL LPS)。RAW264.7 巨噬細(xì)胞匯合度達(dá)到約80%時(shí)，PBS 潤洗3遍，按上面的分組，加入10 mg·L-1LPS造模，12 h后棄去廢液，PBS潤洗，加入如上分組濃度的含藥血清和胎牛血清濃度，置于溫箱中培養(yǎng)24 h。

2.4 ELISA 法檢測RAW264.7 巨噬細(xì)胞IL-1β的濃度

按照上述方法，細(xì)胞置于溫箱培養(yǎng)24 h后，收集上清液備用，于-20 ℃保存。準(zhǔn)備ELISA試劑盒和樣品，放置至室溫，大約20 min。按照說明書配置1×清洗液，1×抗體稀釋液，按要求稀釋檢測抗體、HRP，配置底物溶液等相關(guān)溶液。室溫后，先于包被抗體的96孔板中依次加入對照品和各組樣品，每孔100 μL，設(shè)置復(fù)孔，室溫2 h后，清洗液清洗3次，最后1次倒扣96孔板，吸干孔內(nèi)殘留液體。加入稀釋后的檢測抗體，每孔100 μL，室溫1 h后，清洗，方法同上。加入100 μL HRP稀釋液，室溫20 min后，清洗。加入100 μL底物溶液，室溫20 min后，清洗。加入50 μL終止液，30 min內(nèi)，用酶標(biāo)儀設(shè)置波長450 nm，檢測各組OD值。

2.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)測定通路蛋白TNF-、NF-κB的表達(dá)

按照“2.3”的細(xì)胞培養(yǎng)方法，24 h后，收集上清液，PBS潤洗后，細(xì)胞刮收集細(xì)胞，離心，細(xì)胞沉淀加入含1% PMSF的RIPA高效裂解液裂解細(xì)胞蛋白，冰上裂解25 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，取4 μL稀釋后樣品做BCA定量，得到標(biāo)準(zhǔn)品與樣品吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白樣品原液濃度，配平后加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃滅活10 min，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。制膠，蛋白上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，敷目的蛋白對應(yīng)的特異性抗體TNF-(1∶500)、NF-κB(1∶1 000)，4 ℃過夜，搖床洗膜5 min/次，共3次，加入相應(yīng)二抗(1∶5000)室溫孵育1 h，搖床洗膜5 min/次，共3次，配置化學(xué)發(fā)光液，顯影，拍照保存，用 Image J圖像分析軟件測定條帶的灰度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 CCK-8法檢測不同濃度的LPS對RAW264.7巨噬細(xì)胞活力值的影響

細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，內(nèi)毒素脂多糖(LPS)的刺激是炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要原因，從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS藥物濃度在1～100 μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞活力值會有峰值變化，其中在濃度10 μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞活力值達(dá)到最高峰，其余均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。故本實(shí)驗(yàn)均采用10 μg/mL的LPS藥物濃度來誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的炎癥模型。見表1。

組別質(zhì)量濃度A活力值空白-0.459-10.4030.810±0.5392.50.4090.820±0.50250.4400.966±0.327LPS100.7812.527±1.436250.6041.992±2.155500.6371.817±0.3271000.6331.793±0.670

3.2 ELISA檢測巨噬細(xì)胞外炎癥因子IL-1的表達(dá)

LPS激活后的巨噬細(xì)胞可以在細(xì)胞膜外釋放大量的炎癥因子IL-1，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組IL-1濃度升高明顯(P<0.01)；與模型組相比，藥對組的濃度呈現(xiàn)下降的趨勢(P<0.05)。見表2。

表2 黃芪-丹參藥對對IL-1濃度的影響

組別濃度(pg/mL)空白組28.108±3.459模型組67.530±10.5468##藥對組50.0986±7.98684##*

注：與空白組相比，##P<0.01；與模型組比，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 Western blot檢測TNF-/ NF-κB通路蛋白的表達(dá)

免疫蛋白印跡結(jié)果顯示(圖 1)：與空白組比較，模型組TNF-、NF-κB表達(dá)水平升高(P<0.05，P<0.01)，與模型組相比，黃芪-丹參藥對組能夠抑制上述蛋白的表達(dá)(P<0.05)，黃芪-丹參藥對能夠控制炎癥，見表3。

注：A.空白組；B.黃芪-丹參藥對組；C.模型組

表3 黃芪-丹參藥對對巨噬細(xì)胞活化后TNF-/NF-κB蛋白表達(dá)量的影響

注：與空白組相比，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

4 討論

前期課題組研究加減補(bǔ)肺湯(黃芪、黨參、百部、補(bǔ)骨脂、桑白皮、丹參)能夠有效改善IPF的疾病發(fā)展進(jìn)程。其中，黃芪和丹參作為臨床常用藥物，常配伍作為藥對使用，可以擴(kuò)大藥效。黃芪具有補(bǔ)氣、利尿和排毒的功效，具有抗感染、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力的功效[5]，黃芪當(dāng)中的活性成分總黃酮和總皂苷能夠干預(yù)IPF早期肺泡炎癥，抑制纖維化的進(jìn)程[6]。丹參具有活血化瘀、通經(jīng)和除煩的作用，具有改善微循環(huán)、抗肝纖維化的功效[7-8]。丹參素可以改善大鼠早期肺泡炎癥和纖維化結(jié)節(jié)[9-10]。黃芪和丹參作為藥對合用，能夠?qū)PF疾病發(fā)揮作用，這可能與其能夠抑制早期肺泡炎癥和肺纖維化結(jié)節(jié)有關(guān)。

細(xì)胞焦亡是參與細(xì)胞感染過程中的一種炎癥細(xì)胞死亡過程。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，外界刺激物如果突破免疫屏障，會誘導(dǎo)血液中的單核細(xì)胞活化為巨噬細(xì)胞，釋放大量促炎因子，TNF-α作為巨噬細(xì)胞釋放的關(guān)鍵性促炎因子，廣泛參與了免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等病理過程[11]，TNF-α能夠刺激巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage，AM)活化，損傷毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(alveolarepithelial cell，AEC)和上皮細(xì)胞[12]，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可以激活NF-κB信號通路，使 NLRP3蛋白表達(dá)，調(diào)控 Caspase-1，并釋放炎性介質(zhì)IL-1、IL-18，引起細(xì)胞焦亡(pyroptosis)[13-14]，因此，控制巨噬細(xì)胞炎癥的發(fā)生發(fā)展與TNF-α/NF-κB信號通路引發(fā)的細(xì)胞焦亡存在可能性的機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

本研究主要在LPS干預(yù)巨噬細(xì)胞的模型中觀察藥對黃芪-丹參對焦亡的影響。實(shí)驗(yàn)研究中模型組的炎癥指標(biāo)顯著增高，TNF-α、NF-κB、IL-1呈現(xiàn)高表達(dá)，黃芪-丹參藥對可下調(diào) TNF-α、NF-κB、IL-1表達(dá)水平，降低炎癥指標(biāo)及蛋白，對炎癥反應(yīng)起到抑制作用。綜上，黃芪-丹參藥對可以抑制小鼠巨噬細(xì)胞炎癥的進(jìn)程，其機(jī)制可能與抑制TNF-α/NF-κB信號通路的焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平及炎性介質(zhì)有關(guān)。