李敏奇, 謝凌志, 陳永正, 袁偉成*

(1. 遵義醫(yī)科大學(xué) a. 藥學(xué)院； b. 貴州省生物催化與手性藥物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c. 貴州省教育廳綠色制藥工程研究中心，貴州 遵義 563000 )

細(xì)胞色素P450單加氧酶是來(lái)源最廣泛的酶家族之一，普遍存在于原核生物和真核生物，并參與生物體內(nèi)眾多代謝反應(yīng)，如甾醇和萜類(lèi)化合物合成與修飾[1]。P450單加氧酶具有催化活性混雜性的特點(diǎn)，可催化羥化反應(yīng)，環(huán)氧化反應(yīng)和脫烷基化反應(yīng)等許多氧化反應(yīng)(Scheme 1)，因而在生物催化和合成生物學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出極具吸引力的應(yīng)用前景。然而，目前P450單加氧酶在生物催化方面仍然面臨著許多瓶頸問(wèn)題，例如：反應(yīng)活性低、選擇性不高以及催化穩(wěn)定性差[2]。20世紀(jì)90年代Arnold等開(kāi)發(fā)了酶體外定向進(jìn)化技術(shù)，并廣泛應(yīng)用于許多生物酶催化性能的提升。通過(guò)定向進(jìn)化可實(shí)現(xiàn)P450單加氧酶的催化活性、區(qū)域選擇性和立體選擇性等催化性能的改善，甚至可以改變P450單加氧酶的催化機(jī)制，實(shí)現(xiàn)更多非天然的生物催化反應(yīng)[3]。

Scheme 1

在酶的定向進(jìn)化過(guò)程中往往需要尋找一種有效的基因突變策略來(lái)建立一個(gè)豐富的突變體文庫(kù)，常用引入突變基因的方法有易錯(cuò)PCR、定點(diǎn)飽和突變、DNA重組和DNA交錯(cuò)延伸等。除此之外，由于突變體文庫(kù)樣本量巨大，針對(duì)特定酶催化反應(yīng)的定向進(jìn)化還需建立一個(gè)與之對(duì)應(yīng)的高通量篩選策略，用于從龐大的突變文庫(kù)中快速和準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)優(yōu)良突變體。傳統(tǒng)的GC和HPLC分析方法雖然準(zhǔn)確性高，但其篩選效率低，成本高。P450單加氧酶催化的反應(yīng)類(lèi)型多、底物譜廣泛，導(dǎo)致了高通量篩選策略的差異性較大，如何建立一種高效的篩選策略是P450單加氧酶成功定向進(jìn)化的關(guān)鍵。本文綜述了P450單加氧酶在定向進(jìn)化過(guò)程中高通量篩選策略的最新進(jìn)展。

1 比色法篩選策略

1.1 NAD(P)H比色法

目前已知的絕大多數(shù)P450單加氧酶是NAD(P)H依賴(lài)型，還原態(tài)的NAD(P)H在340 nm處有最大吸收峰，當(dāng)其參與P450單加氧酶催化氧化反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化為氧化態(tài)的NAD(P)+，后者在340 nm有較弱的吸收值。因而，通過(guò)在340 nm處定量檢測(cè)NAD(P)H消耗量，即可反應(yīng)出P450單加氧酶的催化反應(yīng)活性(Scheme 2)[4]。2002年，Gianfranco等通過(guò)P450BM3催化不同類(lèi)型的底物證實(shí)了這一策略可被用于高通量篩選[5]。同年，Arnold等運(yùn)用此高通量方法對(duì)P450BM3催化的烷基羥基化活性進(jìn)行定向進(jìn)化，成功獲得了突變體P450BM3 139-3，其與野生型相比己烷羥基化的活性提高了35倍以上。作者以P450BM3 139-3為親本進(jìn)一步進(jìn)行定向進(jìn)化，成功獲得了另一突變體P450BM3 1-12G，其對(duì)丙烷的周轉(zhuǎn)率相較于親本提高了12倍(Scheme 2a)。

P450單加氧酶在催化過(guò)程中存在解耦合反應(yīng)，生成副產(chǎn)物過(guò)氧化氫，使得NAD(P)H的消耗沒(méi)有全部用于底物轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致該高通量篩選策略會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性[8]。為了解決這一問(wèn)題，Bornscheuer等使用AmplifluidRed為指示劑，通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)催化生成熒光素試鹵靈來(lái)定量過(guò)氧化氫的生成量，用于計(jì)算耦合效率，來(lái)提高篩選的準(zhǔn)確性[9]。

1.2 對(duì)硝基苯酚比色法

對(duì)硝基苯酚比色法原理是基于末端羥基化產(chǎn)物為不穩(wěn)定半縮醛，在室溫下發(fā)生氧化反應(yīng)，生成黃色對(duì)硝基苯氧基離子，后者在410 nm處具有特征吸收峰(Scheme 3)。 Schmid等利用P450單加氧酶可催化脂肪酸替代底物對(duì)硝基苯氧基羧酸鹽(pNCA)末端羥基化生成半縮醛的反應(yīng)，建立高通量篩選方法，通過(guò)比較P450BM3 F87A與野生型的催化活性，驗(yàn)證其在篩選過(guò)程中的靈敏度與可行性?；谠摳咄亢Y選策略，Schmid等對(duì)P450BM3 F87A催化8-pNCA(辛酸的替代底物)羥基化反應(yīng)進(jìn)行定向進(jìn)化，成功篩選到突變體P450BM3 F87A/L188K/A74G/R47F，其催化效率從不可檢測(cè)提高至8.8 s-1(Scheme 3a)[11]。隨后，對(duì)硝基苯氧基離子的篩選方法還被應(yīng)用于其他P450單加氧酶的定向進(jìn)化，改善P450單加氧酶對(duì)天然底物的催化活性、熱穩(wěn)定性[12]、過(guò)氧化氫耐受性[13]、共溶劑耐受性，以及電子轉(zhuǎn)移效率[15]。

此外，F(xiàn)arinas等采用新型替代底物對(duì)硝基苯基醚(8-pNPE)建立高通量篩選方法，用于P450BM3催化直鏈烷烴羥基化的定向進(jìn)化，作者運(yùn)用此高通量篩選方法經(jīng)過(guò)兩輪篩選，成功獲得突變體P450BM3 VIII2C9，其催化末端羥基化的活性相較于野生型提高了5倍(Scheme 4)[16]。

Scheme 2

Scheme 3

Scheme 4

Scheme 5

1.3 對(duì)硝基苯硫酚比色法

對(duì)硝基苯硫酚(pNTP)是一種黃色化合物，在450 nm處有特征吸收峰。pNTP可自發(fā)進(jìn)攻環(huán)氧發(fā)生開(kāi)環(huán)反應(yīng)，形成無(wú)色的開(kāi)環(huán)產(chǎn)物(Scheme 5)。Schwaneberg等首次利用pNTP建立高通量篩選策略，完成了對(duì)P450BM3催化苯乙烯環(huán)氧化活性的定向進(jìn)化，成功篩選獲得突變體P450BM3 5F5184K，其相較于親本P450BM3 5F5不對(duì)稱(chēng)環(huán)氧化活性提高2倍(Scheme 5a)[17]。

1.4 副玫瑰紅比色法

副玫瑰紅是一種紅色試劑，可與亞硫酸發(fā)生脫水縮合反應(yīng)生成席夫堿，后者可與甲醛反應(yīng)生成紫色的副玫瑰紅衍生物，該衍生物在540 nm處具有特征吸收峰(Scheme 6)。CYP102D1催化大豆黃酮鄰位羥基化與其催化的O-脫羰基化的反應(yīng)活性存在線性關(guān)系(Scheme 6a)，從而可通過(guò)烷基化反應(yīng)活性反映其雙羥基化活性。Kim等利用了這種特性建立了一種基于副玫瑰紅的固相高通量篩選策略，用于CYP102D1催化大豆黃酮鄰位特異性雙羥基化反應(yīng)的定向進(jìn)化，篩選獲得突變體CYP102D1 F96V/M246I，與野生型P450酶相比，突變體對(duì)大豆黃酮羥基化的反應(yīng)產(chǎn)率從無(wú)法檢測(cè)提升到5.4%的產(chǎn)率。進(jìn)一步的突變篩選獲得了突變體CYP102D1 G1，其可催化3-位羥基化反應(yīng)，并表現(xiàn)92%區(qū)域選擇性，但是羥基化的活性仍然不高[18]。作者在突變體CYP102D1 F96V/M246I的基礎(chǔ)上進(jìn)一步定向進(jìn)化，最終篩選得到突變體P450102D1 M8，其羥基化活性相較于親本提升了23倍，區(qū)域選擇性大于80%(Scheme 6b)。

Scheme 6

1.5 4-硝基苯乙腈比色法

4-硝基苯乙腈(NpCN)是一類(lèi)醌類(lèi)、苯二酚(HQ)類(lèi)和鄰苯二酚類(lèi)化合物檢測(cè)劑，NpCN在氧氣與堿性條件下可與以上化合物發(fā)生加成反應(yīng)生成有色產(chǎn)物，后者可在特定的波長(zhǎng)下被定量檢測(cè)(Scheme 7)。 Schwaneberg等報(bào)道了基于NpCN的高通量篩選方法對(duì)P450BM3催化苯環(huán)原位雙羥基化反應(yīng)的定向進(jìn)化，成功篩選獲得了突變體P450BM3 AW2，其催化假枯烯二羥基化的活性相較野生型提升了70倍(Scheme 7a)[20]。

1.6 靛藍(lán)比色檢測(cè)

有些P450單加氧酶可催化吲哚發(fā)生3-羥基化反應(yīng)，生成3-羥基吲哚，后者在氧氣條件下自發(fā)氧化二聚形成水不溶的藍(lán)色沉淀物靛藍(lán)，其在600～675 nm處具有特征吸收峰(Scheme 8)。 WU等基于細(xì)胞色素P450 2A6可催化吲哚羥基化形成靛藍(lán)的特性，以吲哚衍生物4-氯吲哚建立高通量篩選方法。經(jīng)兩輪固相篩選，作者成功篩選獲得突變體P450 2A6 St9與野生型相比kcat/Km值提升了5倍，kcat提升了2倍(Scheme 8a)。 Turner等使用靛藍(lán)預(yù)篩P450cam飽和突變文庫(kù)，并成功獲得了突變體P450cam Y96M，實(shí)現(xiàn)了P450cam催化非吲哚類(lèi)似物二苯甲烷的羥基化(Scheme 8b)[22]。

Scheme 7

Scheme 8

1.7 Purpald比色法

4-氨基-3-肼基-5-巰基-1,2,4-三氮唑(Purpald)是一種無(wú)色試劑，在氧氣存在時(shí)其可與甲醛發(fā)生成環(huán)反應(yīng)，生成紫色的Purpald衍生物，后者在550 nm處具有特征吸收峰(Scheme 9)。 Arnold等利用P450可催化二甲醚脫甲基生成甲醛可進(jìn)一步與Purpald發(fā)生顯色反應(yīng)建立高通量篩選方法。基于該高通量篩選策略，作者先后分別對(duì)P450BM3催化丙烷羥基化和正辛烷羥基化反應(yīng)的定向進(jìn)化，成功篩選獲得活性改良的突變體P450BM3 9-10A；進(jìn)一步篩選獲得突變體P450BM3 35-E11，其相較于P450 BM3 9-10A周轉(zhuǎn)率提高了6倍(Scheme 9a)[23]。隨后，作者進(jìn)一步對(duì)P450 BM3 9-10A進(jìn)行定向進(jìn)化，成功獲得了突變體P450BM3 77-9H，對(duì)辛烷末端羥基化表現(xiàn)52%的區(qū)域選擇性(Scheme 9b)[24]。此外，Purpald分析法被運(yùn)用于P450單加氧酶催化短鏈醇羥基化[25]和棕櫚酸末端羥基化的定向進(jìn)化[26]。

Fasan等運(yùn)用Purpald比色法發(fā)展了一種指紋圖譜分析策略，通過(guò)檢測(cè)甲醛的生成來(lái)報(bào)告反應(yīng)的活性，結(jié)合底物與活性部位構(gòu)象，建立反應(yīng)性能、底物骨架和蛋白結(jié)構(gòu)三者之間的指紋圖譜(Scheme 10)。作者利用P450BM3及其突變體催化甲氧基化探針驗(yàn)證指紋圖譜策略可行性，并且發(fā)現(xiàn)突變體P450BM3 FL#62在催化5種非甲基化底物時(shí)均表現(xiàn)出了優(yōu)異的催化活性和區(qū)域選擇性(Scheme 10a)[27]。在隨后對(duì)P450BM3催化不對(duì)稱(chēng)氨基化活性進(jìn)行分析時(shí)，進(jìn)一步證實(shí)了突變體P450BM3 FL#62對(duì)于分子骨架較大的底物也表現(xiàn)出較高的氧化活性(Scheme 10b)[28]。

Scheme 9

Scheme 10

Scheme 11

Scheme 12

1.8 硝基藍(lán)四唑-吩嗪硫酸甲酯比色法

在吩嗪硫酸甲酯(PMS)存在下，硝基藍(lán)四唑(NBT)可與NAD(P)H發(fā)生反應(yīng)生成不溶的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲瓚(Formazan)，后者在580 nm處具有特征吸收峰(Scheme 11)[29]。Li等運(yùn)用此篩選策略實(shí)現(xiàn)了對(duì)P450pyr不對(duì)稱(chēng)羥化對(duì)映體選擇性和區(qū)域選擇性的高通量分析。作者利用脫氫酶將P450單加氧酶不對(duì)稱(chēng)羥化的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為酮化合物，同時(shí)生成NADH，再利用NBT-PMS分析法間接測(cè)量NADH，進(jìn)而可對(duì)羥基化產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。作者運(yùn)用此篩選策略對(duì)P450pyr進(jìn)行定向進(jìn)化，成功篩選獲得了突變體P450pyr 11BB12，催化1-芐基吡咯烷不對(duì)稱(chēng)羥化 (S)-立體選擇性從43%提升到65%，另一突變體P450pyr 1AF4A表現(xiàn)83%(R)-立體選擇性(Scheme 11a)[30]。

此外，Li等還利用NBT-PMS高通量篩選策略，成功獲得高立體選擇(98%)且高區(qū)域選擇性(99%)催化正辛烷次末端羥化的突變體P450pyr SM1。同時(shí)，作者也獲得了可催化苯丙烷次末端羥基化的突變體P450pyr SM2，其表現(xiàn)95% (S)-立體選擇性和98%區(qū)域選擇性(Scheme 12)[31]。

1.9 4-氨酰安替比林比色法

4-氨酰安替比林(4-AAP)是一種酚類(lèi)檢測(cè)試劑，在過(guò)硫酸鹽存在時(shí)可與苯酚發(fā)生氧化反應(yīng)，生成紅色的4-AAP類(lèi)似物，后者在509 nm處具有特征吸收峰(Scheme 13)。Schwaneberg等將P450BM3催化苯氧基脂肪酸末端羥基化釋放苯酚的特性，與4-AAP比色法相結(jié)合建立了高通量篩選方法(Scheme 13a)?；诖烁咄亢Y選方法，作者成功篩選得到突變體P450BM3 1E7，其對(duì)3-甲基二苯醚的羥基化活性較于野生型提高8.2倍(Scheme 13b)。除此之外，Schwaneberg等發(fā)現(xiàn)4-AAP篩選策略同樣適用于在苯環(huán)上原位羥基化而產(chǎn)生酚類(lèi)化合物的高通量分析。

Scheme 14

Scheme 15

1.10 4-(4-硝基芐基)吡啶比色法

4-(4-硝基芐基)吡啶(NBP)是一種親核試劑，在堿性條件下自發(fā)進(jìn)攻環(huán)氧發(fā)生開(kāi)環(huán)反應(yīng)，生成紫色NBP衍生物，后者在600 nm處具有特征吸收峰(Scheme 14)， Arnold等基于此反應(yīng)建立了高通量篩選方法。作者通過(guò)比較突變體P450BM3 139-3與野生型P450BM3催化苯乙烯環(huán)氧化活性與其在600 nm處吸光值的關(guān)系，驗(yàn)證該方法的靈敏度及可行性，證明了該方法可用于篩選高環(huán)氧化活性的P450單加氧酶突變體(Scheme 14a)[34]。

Scheme 16

Scheme 17

1.11 苦味酸比色法

苦味酸是一種親核試劑，可選擇性進(jìn)攻16,17-環(huán)氧甾醇環(huán)氧部位發(fā)生開(kāi)環(huán)反應(yīng)，生成橙色苦味酸衍生物，后者在490 nm處具有特征吸收峰(Scheme 15)。Wang等基于此反應(yīng)建立高通量篩選方法，用于對(duì)P450BM3催化的黃體酮環(huán)氧化反應(yīng)進(jìn)行定向進(jìn)化，成功篩選獲得可催化黃體酮生成16,17-環(huán)氧甾醇的突變體P450BM3 5-B10(Scheme 15a)[35]。

1.12 底物/產(chǎn)物比色法

底物/產(chǎn)物比色法篩選策略是基于底物/產(chǎn)物之間存在明顯的紅移或者藍(lán)移現(xiàn)象而建立的一種篩選策略(Scheme 16)， Arnold等基于此特性建立了高通量篩選方法。基于該高通量篩選策略，作者對(duì)P450BM3突變體P411催化的1-甲基吲哚卡賓插入反應(yīng)進(jìn)行定向進(jìn)化，成功篩選得到了一個(gè)含有11個(gè)突變位點(diǎn)的突變體，其催化生成N-甲基-3-吲哚乙酸乙酯的轉(zhuǎn)換頻率和總轉(zhuǎn)換數(shù)分別為470 min-1和18000次[36]。

2 基于熒光分析篩選策略

2.1 試鹵靈熒光法

試鹵靈是一種熒光劑，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為530 nm和580 nm(Scheme 17)。Commandeur等利用P450BM3可催化7-烷氧基試鹵靈O-脫烷基化生成試鹵靈建立高通量篩選方法，對(duì)P450BM3的有機(jī)溶劑耐受性進(jìn)行定向進(jìn)化，成功篩選獲得了對(duì)甲醇、乙腈和異丙醇三種溶劑耐受性增強(qiáng)的突變體P450BM3 MT111和MT112(Scheme 17a)[37]。

2.2 2-乙?；讲⑦秽?Peroxyfluor-1熒光法

2-乙?；讲⑦秽?2-ABF)可與NAD(P)+發(fā)生環(huán)化反應(yīng)生成強(qiáng)熒光產(chǎn)物，后者的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為421 nm和480 nm (Scheme 18)[38]。但此分析方法同樣存在因解耦合產(chǎn)生假陽(yáng)性的問(wèn)題，Takahashi等將2-ABF熒光法與Peroxyfluor-1分析方法(H2O2熒光檢測(cè)試劑)相結(jié)合建立高通量篩選方法。作者將該高通量策略用于對(duì)P450BM3催化的甾體羥基化反應(yīng)進(jìn)行定向進(jìn)化，成功篩選獲得突變體P450BM3 F87A/A330W，實(shí)現(xiàn)了P450BM3對(duì)非天然底物甾體的高區(qū)域和立體選擇性羥基化(Scheme 18a)[39]。

2.3 ABTS熒光法

2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)是一種介體物質(zhì)，在辣根過(guò)氧化物酶(HRP)催化下與H2O2發(fā)生反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物ABTS2+，后者的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為340 nm和414 nm (Scheme 19)。Hauer等采用雙酶級(jí)聯(lián)的篩選思路，利用P450單加氧酶催化脂肪酸末端羥基化得到的氧化產(chǎn)物與半乳糖氧化酶進(jìn)一步發(fā)生氧化反應(yīng)生成醛酸和H2O2的反應(yīng)特性建立高通量篩選方法?；诖朔椒?，作者成功篩選獲得突變體P450 153A S453A相較于親本P450 153A G307A催化脂肪酸末端羥基化活性提升了0.16倍(Scheme 19a)[40]。

2.4 香豆素?zé)晒夥?/h3>

香豆素?zé)晒夥ㄊ峭ㄟ^(guò)P450單加氧酶催化脫烷基化反應(yīng)釋放熒光產(chǎn)物7-羥基香豆素，后者的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為405 nm和460 nm (Scheme 20)。Vlada等運(yùn)用此篩選策略建立高通量分析方法用于對(duì)CYP116B3的進(jìn)行定向進(jìn)化，成功篩選得到突變體CYP116B3 74H10，其催化7-乙氧基香豆素O-脫乙基化活性增加240倍，另一突變體CYP116B3 70A0對(duì)7-甲氧基香豆素的O-脫甲基化活性增加13倍[41]。此外，Akira等基于此高通量篩選策略對(duì)P450moxA催化O-脫乙基化活性進(jìn)行定向進(jìn)化，成功獲得活性提升20倍的突變體P450moxA-Q37W/T115A/H132L/R191W/G294D，同時(shí)發(fā)現(xiàn)此突變體對(duì)催化與香豆素構(gòu)象差異較大的底物(雙氯芬酸和柚皮苷)的活性也有明顯的提升(Scheme 20a)[42]。

Scheme 18

Scheme 19

Scheme 20

Scheme 21

Scheme 22

Scheme 23

Scheme 24

P450BM3可催化7-苯并氧-3-羧香豆素乙酯(BCCE)發(fā)生O-脫烷基反應(yīng)生成熒光香豆素衍生物，后者的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為400 nm和440 nm (Scheme 21)。Schwaneberg等以此反應(yīng)為基礎(chǔ)首次建立了基于流式細(xì)胞術(shù)的P450單氧化酶高通量活性分析平臺(tái)。經(jīng)過(guò)一輪定向進(jìn)化，作者篩選得到突變體P450BM3 DM-1，其較親本P450BM3 DM的催化活性增加7倍[43]。

2.5 吉布斯分析法

吉布斯分析法是一種通過(guò)酚類(lèi)化合物自身偶聯(lián)或者與吉布斯試劑發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生熒光或紫外可見(jiàn)吸收的分析法(Scheme 22)。Arnold等基于此建立高通量分析方法并用于對(duì)P450cam的定向進(jìn)化，成功篩選獲得突變體P450cam M7-8H，催化萘羥基化活性相較于親本提升了20倍(Scheme 22a)[44]。

2019年，Schwaneberg等首次將多路毛細(xì)管分析法運(yùn)用于P450單加氧酶催化異佛爾酮羥化活性的高通量分析(Scheme 23)。通過(guò)將該分析方法與NAD(P)H比色檢測(cè)法相比較，作者發(fā)現(xiàn)該高通量方法較NAD(P)H篩選法的篩選時(shí)間延長(zhǎng)了4～6倍，但準(zhǔn)確性得到了很大改善[45]。

質(zhì)譜法是一類(lèi)基于分子量測(cè)定的分析技術(shù)，Keasling等通過(guò)底物探針類(lèi)似物的巧妙設(shè)計(jì)，成功將納米結(jié)構(gòu)-引發(fā)劑質(zhì)譜運(yùn)用于P450單加氧酶催化活性的高通量分析。作者將該高通量篩選方法用于對(duì)P450BM3催化朱欒倍半萜羥基化反應(yīng)的定向進(jìn)化，成功篩選獲得了可催化朱欒倍半萜羥基化反應(yīng)的P450BM3突變體F87A, F87G, F87I, F87P 和 F87G/A238G(Scheme 24)[46]。

Li等以底物的同位素標(biāo)記探針設(shè)計(jì)為基礎(chǔ)，建立了高通量質(zhì)譜分析方法，并用于P450pyr催化1-芐基吡咯烷不對(duì)稱(chēng)羥基化的對(duì)映選擇性高通量分析(Scheme 25)。作者運(yùn)用此篩選策略成功得到突變體P450pyrTM，與野生型P450相比，其對(duì)此底物不對(duì)稱(chēng)羥化的(S)-立體選擇性從53%提升到98%，區(qū)域選擇性由90%提升到100%[47]。

P450單加氧酶的高通量篩選方法以紫外-可見(jiàn)比色法為主，NAD(P)H比色法盡管存在解耦合等問(wèn)題，但仍然是應(yīng)用最廣泛的高通量篩選方法。此外，通過(guò)反應(yīng)設(shè)計(jì)，引入或消耗生色基團(tuán)的高通量篩選策略也常用于P450單加氧酶的定向進(jìn)化，但這些分析方法僅限用于末端羥基化反應(yīng)或者廣義上針對(duì)生色基團(tuán)鄰位C—H鍵的羥基化反應(yīng)，如pNCA、pNPE、Purpald等。除此之外，熒光分析篩選策略在提升催化活性領(lǐng)域也有許多運(yùn)用，如針對(duì)氫過(guò)氧化物的檢測(cè)以及熒光產(chǎn)物的檢測(cè)等。其他高通量篩選方法，如多路毛細(xì)管篩選策略和高通量質(zhì)譜法，雖然準(zhǔn)確性較高，但對(duì)分析設(shè)備具有較高的要求。然而，目前針對(duì)區(qū)域選擇性和立體選擇性的高通量篩選方法較少，而且這些高通量篩選方法的特異性強(qiáng)，通用性差。隨著對(duì)P450單加氧酶定向進(jìn)化的不斷研究，將會(huì)產(chǎn)生更多的高通量篩選方法，總結(jié)和歸納這些策略有利于加快P450單加氧酶定向進(jìn)化的深入發(fā)展，從而促進(jìn)P450單加氧酶在生物催化領(lǐng)域更廣泛的應(yīng)用。

Scheme 25