宋黃戎，馬思飛，惲 琪，郭美娜，胡沿每，翟鴻儒， 薛欽洋，蘇令通，王 琪，張維寧， 王 佳,2

(1. 江蘇大學 醫(yī)學院，生物化學檢驗教研室，鎮(zhèn)江 212013; 2. 江蘇大學第四人民醫(yī)院，神經疼痛、介入科，鎮(zhèn)江 212001)

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)作為一種中樞神經系統(tǒng)退行性病變，常發(fā)生于老年前期或老年期，主要以進行性的記憶認知功能障礙、人格性格改變?yōu)樘卣?，其主要病理特征為老年斑形成、神經原纖維纏結沉積、海馬錐體細胞顆?？张葑冃我约吧窠浽笔У萚1]。隨著社會老齡化的發(fā)展，AD的發(fā)病率逐年升高，當前已經成為嚴重的社會問題。然而，迄今為止，AD的發(fā)病原因及其發(fā)病機制尚不明確。

越來越多的證據表明，轉錄調控異常與AD發(fā)生密切相關[2]。無論在AD細胞模型、轉基因小鼠模型還是AD患者腦組織研究結果均證實mRNA轉錄水平的異常[3]。研究表明，F(xiàn)oxG1突變與許多神經發(fā)育障礙如Rett syndrome及小頭癥密切相關[4]。FoxG1作為叉頭轉錄因子Fox 家族中的一個成員，執(zhí)行著轉錄抑制功能[5]。作為端腦特異性的轉錄抑制因子，在胚胎期主要調控小鼠端腦的形成。FoxG1不僅表達于胚胎時期的腦，也在整個成年期高度表達于哺乳動物的腦[6]，在腦發(fā)育早期，F(xiàn)oxG1主要選擇性表達于端腦形成的增殖細胞群，F(xiàn)oxG1使細胞持續(xù)維持在增殖狀態(tài)，并阻止其分化為神經元，參與神經可塑性的調控[7]；出生后FoxG1繼續(xù)表達于海馬齒狀回和室管膜下區(qū)，調節(jié)出生后海馬的神經形成[8]。FoxG1促進視網膜軸突的生長以及內耳[9]和嗅覺系統(tǒng)[10]的形成。然而轉錄調控因子FoxG1與AD的關系卻鮮見報道。

本研究中的AD病變腦區(qū)FoxG1過表達小鼠擬通過Cre/loxp介導的基因重組方案構建(圖1)：loxp是一段長34 bp的DNA序列，是Cre重組酶識別的位點，被稱為loxp位點。在興趣基因FoxG1上游的一側(通常稱為"loxp-stop-loxp"或"LSL"盒)放置一個帶loxp位點的終止密碼子，可以抑制Cre缺失時的基因表達，在Cre存在的情況下，終止密碼子被切除，基因表達繼續(xù)進行。我們通過雜交CreERT2工具小鼠(B6;129-5-HT1Btm1(CreERT)5-HT1B)和FoxG1條件性過表達小鼠(CAG-loxp-stop-loxp-FoxG1-IRES-EGFP)，獲得CreERT2重組酶/FoxG1轉基因子代小鼠[11]。CreERT2工具小鼠(B6;129-5-HT1Btm1(CreERT)5-HT1B)的啟動子為5-HT1Btm1，可以介導Cre重組酶在小鼠海馬、皮層、紋狀體腦區(qū)特異性表達；而ERT2是一個改造過的雌激素受體，可以被他莫昔芬活化，他莫昔芬的代謝產物4-OHT(雌激素類似物)與ERT2結合后誘導CreERT2入核發(fā)揮其重組酶活性[12]，進一步激活Cre重組酶識別loxp位點，基于以上方案，我們可以獲得FoxG1條件性過表達小鼠。若在AD病模型小鼠基因背景的基礎上構建FoxG1條件性過表達小鼠，可通過啟動子5-HT1B誘導FoxG1過表達于AD的病變腦區(qū)(海馬、皮層、紋狀體)，也可基于AD特征性標記物(β-Amyloid)出現(xiàn)明顯病理學改變的時間，進而選擇他莫昔芬腹腔誘導的時間，通過cre/loxp介導的重組技術獲得AD病變腦區(qū)FoxG1條件性過表達小鼠后，在該小鼠生長至6個月(β-Amyloid出現(xiàn))后腹腔注射他莫昔芬誘導FoxG1過表達，獲得最理性的構建方案。此外，當前的研究將就AD病變腦區(qū)FoxG1過表達小鼠鑒定、繁殖進行探討，通過PCR，IHC及IF技術驗證該模型小鼠的建立及FoxG1的蛋白表達，為FoxG1相關的AD的機制研究提供一個可信的動物模型。

Fig 1 Schematic diagram for conditional overexpression of FoxG1 mediated by cre/loxp strategy with genetic recombination

1 材料與方法

1.1 材料實驗所需的抗體如下：兔源GFP抗體(Bioss catalog # bs-0844R)。 鼠源β-淀粉樣蛋白抗體 (Cell Signaling Technology, catalog # 15126)。山羊抗兔IgG二抗(碧云天，catalog # p0186-1)。山羊抗鼠IgG二抗(澳泉醫(yī)療科技有限公司，catalog # RQ7025)。

1.2 實驗儀器光學顯微鏡(BX41，日本Olympus公司)，凝膠成像儀(GelDoc XP+, Bio-Rad公司)、電泳儀(DYY-6C型，北京市六一儀器廠)，水浴鍋(HH-3A, 金壇市精達儀器制造有限公司)。

1.3 實驗動物FoxG1條件性過表達(CAG-loxp-stop-loxp-FoxG1-IRES-EGFP)小鼠，品系B6/FVB，由東南大學趙春杰教授惠贈，雌雄各2只。B6; 129-5-HT1Btm1(CreERT)/Nju小鼠從南京模式動物研究中心引進[許可證編號：SCXK(蘇)2018-0008]，♀♂各2只。APP/PS1雙轉基因小鼠B6C3-Tg(APPswePSEN1dE9)/Nju由南京模式動物研究中心引進，品系名稱B6C3-Tg(APPswePSEN1dE9)/Nju，♂2只，♀6只。SPF級C57BL/6J小鼠購于江蘇大學實驗動物中心[許可證編號：SCxk(蘇)2015-0001]。

1.4 小鼠的飼養(yǎng)小鼠的飼養(yǎng)按照SPF動物飼養(yǎng)標準執(zhí)行，經隔離觀察未見異常后進入飼養(yǎng)區(qū)，嚴格按照SPF動物管理相關規(guī)定進行實驗操作。

1.5 小鼠鑒定采取剪去腳趾編號方法(剪取出生后5～6 d的子鼠的腳趾)，從后肢到前肢，從右到左依次編號。剪去的腳趾組織用于提取基因組DNA?；蚪MDNA提取大致步驟如下：(1)取小鼠腳趾(按1～10的順序)放入1.5 mL EP管中，適當離心30 s使其沉于管底。(2)加入30 μL裂解液(0.5% 20% Tween-20, 1 mol·L-1KCl 50 mmol·L-1,1M MgCl215 mmol·L-1, 1 mol·L-1Tris-HCl 2.5 mmol·L-1, pH 8.0，用前加200 mg·L-1蛋白酶K 3 μL),(3)55 ℃消化3～5 h, 12 000 r·min-1離心2 min, 95 ℃,15 min，滅活蛋白酶K，12 000 r·min-1離心2 min，所獲得的上清中DNA用于PCR模板，-20 ℃保存，用于基因型鑒定。

1.5.1App/Ps1轉基因小鼠的鑒定 App/Ps1雙轉基因小鼠B6C3-Tg(APPswePSEN1dE9)/Nju基因型中，含有衰老基因序列ps1-dE9及App淀粉樣前體蛋白基因序列APPswe融合體。采用兩對引物1597/1598(App)和1644/1645(Ps1)進行小鼠基因型鑒定。引物1597和1598的序列分別為：5′-GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3′和5′-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG-3′。引物1644和1645的序列分別為5′-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3′，5′-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3′。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60-65℃ 30 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 5 min，35個循環(huán)；10 ℃保存。PCR產物行2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳完成后用Bio Rad凝膠電泳成像儀照相。

1.5.2FoxG1條件性過表達(CAG-loxp-stop-loxp-FoxG1-IRES-EGFP)小鼠的鑒定 引物GFP(up)和GFP(low)的序列分別為：5′- AAGGACGACGGCAACTACAAG-3′和5′-GGCGGTCACGAACTCCA-3′。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s,72 ℃ 5 min；35個循環(huán)；4 ℃保存。PCR產物行2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳完成后用Bio Rad凝膠電泳成像儀照相。

1.5.3B6;129-5-HT1Btm1(CreERT)小鼠的鑒定 兩對引物5-HT1B-tR1/Neo-3F和5-HT1B-tF2/Neo-3R的序列分別為：5′- AAGCTAAGTTCCTCGGGTATGGAAG-3A和5′-TCTGAGGCGGAAAGAACCAG-3′；5′-CTTCTTCATCATCTCCCTGGTGATG-3′，5′-CTGGTTCTTTCCGCCTCAGA-3′ PCR反應條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s,72 ℃ 5 min；35個循環(huán)；10 ℃保存。PCR產物行2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳完成后用Bio Rad凝膠電泳成像儀照相。

1.6 他莫昔芬給藥方式玉米油(A0395699，ACROS)配制他莫昔芬(# T5648，Sigma)終濃度為20 g·L-1，37 ℃搖床過夜混勻，分裝后-20 ℃避光保存。成年小鼠腹腔注射他莫昔芬(75 mg·kg-1)，隔天注射一次，連續(xù)2周。注射藥物后的小鼠隔離飼養(yǎng)，注意觀察。

1.7 組織準備小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定小鼠四肢，先用磷酸鹽緩沖液(PBS)快速灌注左心室，然后取腦放置冰上，4 ℃預冷的4%多聚甲醛充分灌注， 4%多聚甲醛后固定48 h。30%蔗糖脫水沉底。OCT包裹后速凍，冰凍切片機做大腦冠狀切片，片厚20 μm。

1.8 免疫組化取小鼠腦組織于4%多聚甲醛中固定48 h，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，制成6 μm厚冠狀面切片。切片常規(guī)脫蠟至水，微波爐修復抗原，冷卻后PBS洗滌，然后3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶10 min，β-Amyloid一抗(1：800)孵育4 ℃冰箱過夜，PBS洗滌后，山羊抗鼠IgG二抗(1 ∶50)孵育2 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。經DAB顯色，應用圖像分析系統(tǒng)測量每個視野內陽性細胞數(shù)。

1.9 免疫熒光取小鼠腦組織于4%多聚甲醛中固定48 h后轉移入30%的蔗糖溶液中，直至腦組織沉底，進行OCT包埋，-80 ℃冰箱速凍，冰凍切片機冠狀面切片20 μm厚。PBS沖洗30 min后，微波爐抗原修復，降至室溫后PBS洗3次，10%山羊血清封閉90 min，GFP一抗(1 ∶50)過夜。Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG二抗(1 ∶500)避光孵育2 h后，PBS清洗3次，每次3 min，甘油封片，鏡檢。

2 結果

2.1 阿爾茨海默病病變腦區(qū)FoxG1過表達小鼠的繁育方案FoxG1轉基因小鼠與海馬、皮層及紋狀體特異腦區(qū)表達Cre重組酶的B6;129-5-HT1Btm1 (CreERT) 工具小鼠交配，獲得的子代再與AD模型鼠App/ps1轉基因小鼠交配，得到在AD模型鼠病變腦區(qū)FoxG1條件性過表達小鼠。他莫昔芬注射誘導該小鼠(6月齡)海馬、皮層及紋狀體病變腦區(qū)過表達FoxG1蛋白。

Fig 2 Generation of mouse of FoxG1 overexpression in specific brain region based on App/Ps1mouse line

2.2 阿爾茨海默病模型小鼠的鑒定PCR鑒定(引物為1597和1598(App)以及1644和1645(ps1)結果見圖3A，擴增出350bp和608bp兩條條帶的為App/ps1小鼠，如泳道5、6；擴增出350bp一條條帶的為單純App基因型的小鼠，如泳道1、2、3、4、7。

免疫組化檢測該模型小鼠皮層A-β淀粉樣蛋白的表達，圖3B及3B'結果顯示，隨著周齡的增加，A-β淀粉樣蛋白在小鼠前額皮層表達增加(B：2月齡AD模型小鼠，B'：6月齡AD模型小鼠)。

2.3 FoxG1條件性過表達小鼠的鑒定雙重PCR鑒定FoxG1(引物為GFP(up)/GFP(low)以及鑒定Cre(5-HT1B-tR1/Neo-3F和5-HT1B-tF2//Neo-3R)，鑒定結果表明，若PCR同時擴增出FoxG1基因的目的條帶(378 bp)和Cre基因的目的條帶(364 bp)的為FoxG1條件性過表達小鼠，僅擴增出一條420 bp條帶為野生型小鼠，未擴增出FoxG1基因的目的條帶(378 b)但擴增出Cre基因的目的條帶364 bp的為Cre工具鼠。如圖4所示，編號3、4、6、7同時擴增出378bp的 FoxG1目的條帶和364bp的 Cre基因目的條帶，其中，編號3、4、7還擴增有420bp的 Cre目的條帶，可見，編號3、4、6、7的個體為FoxG1條件性過表達小鼠；編號2僅擴增出一條420 bp 的目的條帶，為野生型小鼠，編號5擴增出FoxG1基因的目的條帶378 b和420 bp目的條帶，為FoxG1轉基因小鼠。

2.4 阿爾茨海默病FoxG1條件性過表達小鼠的鑒定三重PCR鑒定FoxG1：引物為GFP(up)/GFP(low)，鑒定Cre(5-HT1B-tR1/Neo-3F和5-HT1B-tF2/Neo-3R)以及鑒定App/ps1(1597/1598及1644/1645)，結果表明，泳道5、9、10、11、12、15為AD FoxG1條件性過表達小鼠Cre-foxg1;App-ps1。

Fig 3 Genotype identification and comparison of β-amyloid protein expression for 2 and 6 months of App/ps1 mouse line A： Results of PCR； B： Expression of β-amyloid protein by immunohischemistry for 2 months. (B’) Expression of β-amyloid protein by immunohischemistry for 6 months.

Fig 4 Identification of FoxG1 conditional overexpression mouse line

Fig 5 Identification of App/ps1; Tg-FoxG1 mouse line

2.5 他莫昔芬誘導阿爾茨海默病模型鼠皮層FoxG1過表達6月齡AD FoxG1條件性過表達小鼠皮下注射他莫昔芬誘導Cre重組酶的表達，結果顯示：與野生型小鼠相比，AD FoxG1條件性過表達小鼠前額皮層FoxG1表達顯著增加。

Fig 6 Results of FoxG1 expression in the cortex in App/Ps1 mouse lineImmunofluorescence with an antibody specific to EGFP was conducted on coronal brain section. Remarkable elevation of FoxG1-EGFP protein expression was found in cortex in B6;129-5-HT1Btm1 (CreERT); CAG-loxp-FoxG1-EGFP mice compared to WT mice.

3 討論

許多神經生物學疾病，如AD、抑郁癥等都與海馬神經元變性、缺失密切相關[13]。近年來，大量實驗結果證明哺乳動物海馬齒狀回終生存在神經發(fā)生，新生的神經元成熟后參與整合到已經存在的神經環(huán)路中，可以補充和替代衰老的細胞而發(fā)揮生理功能，故此，促進海馬神經發(fā)生能夠改善動物的認知功能，這為AD的治療帶來希望[14]。

人類FOX(human forkhead-box)基因家族是一類具有W1環(huán)、W2環(huán)和3個α螺旋組成的FOX結構域的轉錄因子蛋白家族。FoxG1基因是FOX家族的重要成員之一，位于人染色體14q12其表達產物為FoxG1(又名腦因子-1, brain factor-1, BF-1)。大量研究表明FoxG1基因通過調控神經干細胞的增值和分化在胚胎腦發(fā)育的過程中起著關鍵性的作用，如果FoxG1基因表達缺陷將導致大腦皮層結構紊亂，出生后FoxG1仍持續(xù)表達于由端腦分化來的腦組織(大腦皮層、海馬及基底核)中，而AD與這些病變腦區(qū)密切相關，實驗室前期的研究結果表明AD的發(fā)生伴隨著皮層、海馬FoxG1蛋白表達的下調。2018年，東南大學趙春杰課題組發(fā)現(xiàn)FoxG1過表達于皮層邊緣區(qū)可以誘導Cajal-Retzius細胞轉化為海馬齒狀顆粒神經元。那么能否靶向調控皮層邊緣區(qū)的FoxG1促進海馬齒狀顆粒神經元的形成，進而拮抗AD引起我們的極大興趣，構建AD病變腦區(qū)FoxG1過表達小鼠將為AD的機制研究及靶向治療提供必要的模型動物。

隨著分子生物學技術的不斷進展，轉基因及基因敲除技術越來越成熟。條件性基因重組技術是將對某個基因的修飾限制于某些特定類型的細胞/組織或發(fā)育的某一特定時段，通常是在常規(guī)的基因重組基礎上，利用重組酶Cre介導的位點特異性重組技術，在某些修飾的時空范圍上設置一個可調控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾處于一種時空可控狀態(tài)[15]。

為了研究FoxG1基因對于AD的改善、調控作用，我們需要在AD小鼠病變腦區(qū)誘導FoxG1過表達。該問題解決的關鍵點是：①AD模型鼠的選擇；②如何在AD病變腦區(qū)條件性誘導FoxG1過表達；③如何確保在AD出現(xiàn)典型的病理學改變-β Amyloid蛋白時驗證FoxG1的保護、調控機制。為了解決以上問題，我們①選擇了App/Ps1雙轉基因B6C3-Tg(APPswePSEN1dE9)/Nju小鼠，該轉基因小鼠的基因型中，含有衰老基因序列ps1-dE9及App淀粉樣前體蛋白基因序列APPswe融合體，能夠保證AD典型病理學標記物β Amyloid蛋白的出現(xiàn)，而衰老基因序列ps1-dE9的轉入又符合了AD作為一種老年病的機理有效性；②為了選擇AD的病變腦區(qū)，我們應用了啟動Cre重組酶的合理的啟動子5-HT1B，5-HT1BmRNA主要存在于紋狀體，海馬(CA1區(qū)的錐體細胞層)，前扣帶皮層(第4層)、基底神經節(jié)的伏隔核，下丘腦核，選擇5-HT1B作為啟動子，進而保證FoxG1條件性過表達于AD的病變腦區(qū)；③前期實驗證明ADApp/Ps1雙轉基因小鼠6個月時β Amyloid蛋白才明顯增加，為了探索AD出現(xiàn)典型的病理學改變-β Amyloid蛋白時FoxG1的保護機制，我們選擇的Cre工具小鼠為B6;129-5-HT1Btm1(CreERT)，ERT2是一個改造過的雌激素受體，可以被他莫昔芬活化，他莫昔芬的代謝產物4-OHT(雌激素類似物)與ERT2結合后誘導CreERT2入核發(fā)揮其重組酶活性[12]，通過選擇他莫昔芬的注射時間，我們可以保證在AD出現(xiàn)典型的病理學改變-β Amyloid蛋白時研究FoxG1對AD的的保護功能及其機制。

基于以上重組策略，我們可以獲得AD病變腦區(qū)FoxG1條件性過表達小鼠，在該小鼠生長至6個月后腹腔注射他莫昔芬誘導FoxG1過表達，獲得最理性的構建方案。此外，PCR，IHC及IF實驗結果表明：與野生型小鼠相比，本研究構建的阿爾茨海默F(xiàn)oxG1過表達小鼠的大腦皮層FoxG1蛋白表達顯著增加。

綜上，應用合理的基因重組策略，成功制備了在AD病變腦區(qū)FoxG1過表達小鼠。為AD機制研究及靶向藥物的研發(fā)提供一個可信的動物模型。

(致謝：本課題是在江蘇大學醫(yī)學院行為醫(yī)學實驗室完成，感謝課題組肖栩、薛程、李曉輝、周漾同學參與了本課題的行為學實驗。)