任 佳，徐 菱，許孫紅，翟耀勇

[江南大學(xué)附屬醫(yī)院(無(wú)錫三院)藥學(xué)部，江蘇 無(wú)錫 214000]

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是全世界冠心病患者死亡的主要原因[1]。動(dòng)脈粥樣硬化被認(rèn)為是一種全身性、脂質(zhì)驅(qū)動(dòng)的大中型動(dòng)脈硬化性疾病，導(dǎo)致多灶性斑塊的形成[2]。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展涉及異常的炎癥細(xì)胞募集、泡沫細(xì)胞形成、平滑肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)合成、活性氧產(chǎn)生和動(dòng)脈重塑等[3, 4]。在這些變化中，炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中占據(jù)著主導(dǎo)作用。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展初期，進(jìn)入動(dòng)脈壁的低密度脂蛋白被過(guò)量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)氧化并被巨噬細(xì)胞吞噬后在巨噬細(xì)胞內(nèi)形成脂滴進(jìn)而誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成[2, 5]。大量研究證據(jù)表明，動(dòng)脈粥樣硬化病灶處有大量炎癥因子釋放，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展和進(jìn)展[6-7]，但炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)展的機(jī)制尚未完全確定，而且也缺乏治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物。

五味子丙素(五味子醇C，schisandrin C，Sch C)是五味子的一種二苯并環(huán)辛二烯衍生物，被證明能夠緩解脂磷壁酸刺激小膠質(zhì)細(xì)胞和痤瘡丙酸桿菌引起巨噬細(xì)胞的細(xì)胞炎癥[8-9]。盡管尚不清楚Sch C的這些抗炎活性的機(jī)制，但這些抗炎活性的機(jī)制可能通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB驅(qū)動(dòng)的炎癥反應(yīng)來(lái)介導(dǎo)的[8]。因此，通過(guò)Sch C改善動(dòng)脈炎癥可能成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的潛在策略。為了研究五味子丙素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的可能作用與機(jī)制，本項(xiàng)目擬觀察Sch C干預(yù)治療高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠12周后，檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和動(dòng)脈炎癥，以及炎癥信號(hào)通路相關(guān)蛋白。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ApoE-/-小鼠購(gòu)自某大學(xué)模式動(dòng)物研究所(生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0008)。

1.2 藥物與試劑五味子丙素購(gòu)自美國(guó)selleck公司；油紅O染色試劑盒(批號(hào)：MKCG9293)購(gòu)自美國(guó)sigma公司；高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein，HDL) 檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20190809)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein，LDL) 檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20190813)、總膽固醇(total cholesterol，TCH) 檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20190814)和甘油三酯(triglyceride, TG)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20190813)購(gòu)自南京建成生物工程研究院；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：H6906340)和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(批號(hào)：H7825250)購(gòu)自上海Yeasen公司；TRIzol(批號(hào)：AI61056A)購(gòu)自大連TaKaRa公司。

1.3 主要儀器正置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 公司；SpectraMaxM2型酶標(biāo)儀購(gòu)自Molecular Devices 生物科技公司；蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜與曝光系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇8周齡的雄性ApoE-/-小鼠，SPF級(jí)。在本研究中， 16只C57BL/6J背景的ApoE-/-小鼠被安置在一12 ∶12 h的光-暗循環(huán)中，在恒定的室溫下，用標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，并給予水。實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物至少在實(shí)驗(yàn)室馴化2周。所有動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)程序均按照《實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南》(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)中概述的指令執(zhí)行。通過(guò)醫(yī)院動(dòng)物倫理審查委員會(huì)的同意，所有小鼠均置于標(biāo)準(zhǔn)條件下，符合國(guó)家制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型建立將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為兩組：(i)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠(HFD組，n=8)；(ii)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，從高脂飲食喂養(yǎng)的d 1開(kāi)始口服五味子丙素(1%CMC-Na溶液)，劑量為5 mg·kg-1·d-1，持續(xù)12周(HFD+Sch C組，n=8)。HFD組小鼠單獨(dú)接受1%的CMC-NA溶液，時(shí)間與Sch C治療組相同。動(dòng)物在戊巴比妥鈉麻醉下被處死。小鼠死亡后，解剖動(dòng)脈并拍照，將動(dòng)脈組織置于液氮中快速冷凍，進(jìn)行基因和蛋白質(zhì)表達(dá)分析和/或放入4%多聚甲醛中進(jìn)行病理分析。此外，在死亡時(shí)，用含肝素的針注射器從右心室采集血液。

2.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)根據(jù)說(shuō)明書(shū)，動(dòng)脈組織由TRIzol提取RNA。跟據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明利用轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)cDNA的IL-6、TNF-α、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的mRNA表達(dá)水平，引物序列見(jiàn)Tab 1。

2.4 生化指標(biāo)測(cè)定用相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)血液中的TG、TC、LDL、HDL水平。

Tab 1 Primer sequence of real-time quantitative PCR

2.5 蛋白免疫印跡利用蛋白裂解液裂解組織提取組織總蛋白，通過(guò)BCA測(cè)蛋白濃度并將每個(gè)樣本的上樣總蛋白量保持一致。利用10%SDS膠將所有樣本的蛋白進(jìn)行分級(jí)分離，隨后將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上(0.2 μm孔徑的膜用于小分子量蛋白， 0.45 μm孔徑的膜用于分子量大的蛋白)。濕轉(zhuǎn)達(dá)90 min 5%脫脂牛奶孵育2 h起封閉，TBST洗滌,加入一抗IκB-α (inhibitor of nuclear factor-κB, IκB-α)兔多克隆抗體、p-IκB-α鼠單克隆抗體和抗GAPDH兔單克隆抗體，均為1 ∶1 000稀釋孵育，于搖床室溫孵育2 h后放至4 ℃過(guò)夜處理。次日TBST洗滌后，用HRP結(jié)合的二抗(均為1 ∶5 000稀釋)孵育1 h，二抗孵育結(jié)束后用TBST洗滌3次，ECL液曝光，曝光儀成像并處理結(jié)果。

2.6 油紅O染色收集動(dòng)物心臟，于4%多聚甲醛中固定過(guò)夜，次日用20%蔗糖脫水12 h后利用冰凍包埋劑將心臟做出冰凍切片樣本，切至主動(dòng)脈根部收取主動(dòng)脈三尖瓣切片(8 μm)。利用油紅O工作液染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察標(biāo)本并獲取圖片。

3 結(jié)果

3.1 五味子丙素不影響高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的血脂我們首先研究了Sch C對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠血脂的影響。所有ApoE-/-小鼠通過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)12周后處死小鼠，我們檢測(cè)了血清的血脂水平。如Fig 1所示，與HFD組相比，五味子丙素處理的ApoE-/-小鼠血清的血脂水平(TG/TC/LDL/HDL)無(wú)顯著性變化，表明，五味子丙素不影響高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的血脂水平。

Fig 1 Sch C does not affect the changes of blood lipid levels (serum HDL-c/LDL-c/ TCH/TG level) induced by high fat diet in ApoE-/- mice n=8 )

3.2 五味子丙素緩解高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展隨后，我們探究了五味子丙素對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響。Fig 2A顯示五味子丙素處理組小鼠主動(dòng)脈弓及分叉處動(dòng)脈粥樣硬化病變面積減少。此外，相比HFD組，五味子丙素處理后主動(dòng)脈根部的斑塊面積亦有顯著減少(Fig 2B～D)。以上結(jié)果表明，在高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的ApoE-/-小鼠模型中，五味子丙素能有效緩解動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

3.3 五味子丙素緩解高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈炎癥炎癥反應(yīng)貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的整個(gè)過(guò)程中[10]。我們進(jìn)一步研究了五味子丙素對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈炎癥的影響。RT-qPCR分析顯示，與HFD組相比，五味子丙素處理后，炎癥因子和粘附分子包括TNF-α，IL-6和ICAM- 1在動(dòng)脈中的表達(dá)顯著降低(Fig 3)，表明五味子丙素顯著抑制高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈炎癥，且這可能與其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用有關(guān)。

3.4 五味子丙素抑制高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈中IκB-α的磷酸化和降解為進(jìn)一步研究五味子丙素的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了炎癥信號(hào)通路IκB-α的磷酸化和降解。如Fig 4所示，與HFD組相比，五味子丙素處理可抑制ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈中的IκB-α的磷酸化和降解，表明其抗炎作用可能是通過(guò)抑制IκB-α的磷酸化和降解所實(shí)現(xiàn)的。

4 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，涉及斑塊形成不同階段的多種細(xì)胞類型，包括淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞[11]。Moore等[2]和Libby等[2，12]的研究表明，免疫介質(zhì)和炎性巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過(guò)程中有著舉足輕重的作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明動(dòng)脈粥樣硬化斑塊逐步發(fā)展導(dǎo)致的動(dòng)脈狹窄和病灶處斑塊破裂形成的血栓是動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致心血管臨床危險(xiǎn)事件發(fā)生的重要原因[7,13]。

在本研究中，我們探索Sch C對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響。正如在本研究中觀察到的，高脂飲食喂養(yǎng)持續(xù)12周，我們觀察到ApoE-/-小鼠出現(xiàn)了動(dòng)脈粥樣硬化病變，其特征是脂質(zhì)堆積形成斑塊。有趣的是，口服給予Sch C顯著改善了HFD誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，減少了脂質(zhì)在病灶中的積累，卻對(duì)ApoE-/-小鼠的血清TCH、TG、HDL-C和LDL-C水平?jīng)]有影響。以上結(jié)果提示了Sch C具有抗動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用。

Fig 2 Oral administration of Sch C can significantly alleviate the development of atherosclerosis in ApoE-/- mice.A. Representative pictures of the aortic arch; B. Oil red O staining of aortic root. C. Oil red O staining area analysis of aortic root. D. Percentage analysis of oil red O staining area in the aortic root.*P<0.05 vs HFD group.

Fig 3 Sch C can significantly reduce the arterial inflammation induced by high fat diet in ApoE-/- n=8)mRNA expression of inflammatory factors (ICAM-1, TNF-α and IL-6) in the arteries of ApoE-/- mice.*P<0.05,**P<0.01 vs HFD group.

炎癥微環(huán)境在多種慢性疾病中均有著介導(dǎo)作用，例如腦卒中、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化[14]。而在動(dòng)脈粥樣硬化中，炎癥貫穿于整個(gè)發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，起著至關(guān)重要的作用[10]。從早期病變到斑塊破裂，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中存在著許多類型的細(xì)胞，包括T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和肥大細(xì)胞，且伴隨著許多炎癥因子的分泌[8]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)口服給予Sch C明顯降低了高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈中粘附分子和炎癥因子的mRNA表達(dá)。這些結(jié)果表明，Sch C通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)緩解動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展。為了進(jìn)一步探討Sch C緩解動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的分子機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)與HFD組相比，Sch C減少了IκB-α的磷酸化并抑制IκB-α的降解。這些結(jié)果表明Sch C可能通過(guò)抑制IκB-α的磷酸化與降解緩解動(dòng)脈炎癥。

Fig 4 Sch C inhibits the phosphorylation and degradation of IκB-α in the arteries of ApoE-/- mice A: Phosphorylation and degradation of IκB-α; B: Relative quantitative analysis. *P<0.05, **P<0.01 vs HFD group.

因此，我們推測(cè)Sch C可能通過(guò)抑制IκB-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)緩解動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。但本研究中，并未進(jìn)一步在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中深入探索Sch C的抗炎作用是否依賴其IκB-α的抑制作用。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Sch C可能是一個(gè)治療動(dòng)脈粥樣硬化的有效單體。