蘇永少,廖英勤,鐘小藝,馬智超,劉培慶,路 靜,臧林泉,周四桂
(1. 廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)系,2.中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510006)
心力衰竭是指心臟舒縮功能障礙,無(wú)法滿足機(jī)體生命活動(dòng)需要時(shí)產(chǎn)生的疾病[1-2]。心力衰竭機(jī)制包括心肌肥厚、心肌纖維化、氧化應(yīng)激、能量代謝、神經(jīng)體液因素等[3-5]。得益于日益改善的心血管疾病治療策略的運(yùn)用,心力衰竭的病死率明顯下降。但心力衰竭的發(fā)病機(jī)制與年齡密切相關(guān),隨著人口老齡化的進(jìn)程,心力衰竭的發(fā)病率正不斷增長(zhǎng),每年因此死亡的人數(shù)并沒(méi)有明顯減少。因此,尋找新的心力衰竭治療方法,顯得尤為重要。
短鏈酰基輔酶A脫氫酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase, SCAD)是?;o酶A脫氫酶家族的一員,能特異性地分解短鏈酰基輔酶A底物,是線粒體脂肪酸β氧化的第一個(gè)限速酶[6]。我們首次發(fā)現(xiàn)了SCAD在自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚中的表達(dá)明顯下調(diào)[7]。進(jìn)一步研究顯示,在慢性心力衰竭大鼠、心肌梗死后心力衰竭大鼠以及心肌細(xì)胞凋亡模型中,SCAD的表達(dá)均出現(xiàn)了顯著下調(diào)[8-10]。以上研究表明,SCAD對(duì)心力衰竭具有負(fù)性調(diào)控作用。然而SCAD重組腺病毒對(duì)心力衰竭大鼠是否具有保護(hù)作用,尚不清楚。
本研究以大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)(left anterior descending coronary artery, LAD)構(gòu)建大鼠心肌梗死后心力衰竭模型,將SCAD重組腺病毒注射到心尖室壁方向,使SCAD蛋白特異性過(guò)表達(dá)。探討在急性病理應(yīng)激情況下,SCAD重組腺病毒對(duì)心力衰竭大鼠心臟功能和線粒體能量代謝的影響。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑SD大鼠,♂,體質(zhì)量(210±20)g,購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。許可證號(hào):SCXK(粵)2017-0041。SCAD重組腺病毒、GFP空載體腺病毒(漢恒生物),SYBR(DRR420S)(大連TaKaRa,批號(hào):AJ12457A)、SCAD酶活性試劑盒(上海杰美生物,批號(hào):1-2018412-10),單克隆兔抗SCAD(Abcam,批號(hào):GR117677-4),單克隆鼠抗GAPDH(ProteinTech,批號(hào):60004-1-1g)。
1.2 儀器血壓計(jì)(美國(guó)KENT),化學(xué)發(fā)光儀(上海勤翔),冷凍離心機(jī)(廣州湘儀),-80 ℃超低溫冰箱(中科都菱),酶標(biāo)儀(Thermo),熒光定量PCR儀(Bio-Rad)。
2.1 大鼠心肌梗死后心力衰竭模型的構(gòu)建大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,禁食12 h,采用LAD術(shù)構(gòu)建急性心力衰竭大鼠模型將大鼠麻醉后,通過(guò)喉嚨進(jìn)行氣管插管術(shù),連接小動(dòng)物呼吸機(jī)維持呼吸。于大鼠胸部沿左側(cè)第三、第四肋間隙打開(kāi)并結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈,結(jié)扎完成后迅速分層縫合胸壁。Sham組方法同上,但開(kāi)胸穿線后扎松結(jié)。
2.2 重組腺病毒介導(dǎo)的SCAD在大鼠心臟特異性過(guò)表達(dá)模型的構(gòu)建按隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物分組為:Sham+NS組、LAD+NS組、Sham+Ad-GFP組、Sham+Ad-SCAD組、LAD+Ad-GFP組、LAD+Ad-SCAD組,共6組。對(duì)大鼠心臟開(kāi)胸進(jìn)行LAD術(shù)的同時(shí),采用1-guage針頭注射器,吸取純化后的重組腺病毒顆粒(Ad-SCAD:5.596×1011Viral particles, Ad-GFP:5.596×1011Viral particles),在結(jié)扎部位往下(心尖方向)心室壁多點(diǎn)注射重組腺病毒顆粒(100 μL,3~5處)。各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)6周。
2.3 鼠尾動(dòng)脈收縮壓測(cè)定采用無(wú)創(chuàng)血壓儀(CADA Monitor,美國(guó)KENT公司)測(cè)定各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓(systolic blood pressure, SBP),LAD術(shù)前測(cè)量1次,術(shù)后每2周測(cè)量1次,直至第6周結(jié)束。
2.4 超聲心動(dòng)圖檢查重組腺病毒注射6周后,采用戊巴比妥鈉麻醉大鼠,采用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心功能的變化,取M超曲線,分別測(cè)量大鼠的心臟博出量 (cardiac output, CO)、心臟每博輸出量 (stroke volume, SV)、收縮末期左心室內(nèi)徑 (left ventricular dimensions at end systole, LVIDs)、舒張末期左心室內(nèi)徑 (left ventricular dimensions at end diastole, LVIDd)、收縮末期左心室容積 (left ventricular end systolic volume, LVESV)、舒張末期左心室容積 (left ventricular end diastole volume, LVEDV)、心臟射血分?jǐn)?shù) (ejection fraction, EF)和心臟的縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening, FS)。
2.5 動(dòng)物取材各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)6周后,禁食12 h,3%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉,經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,靜置后分離血清,液氮速凍置于-80 ℃保存。取血后取出心臟。部分心臟組織經(jīng)液氮速凍后-80 ℃保存進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),部分心臟經(jīng)4%多聚甲醛固定進(jìn)行石蠟包埋切片,剩余部分心臟組織進(jìn)行冰凍切片。
2.6 活性氧含量測(cè)定部分心臟組織進(jìn)行冰凍切片,二氫乙啶(dihydroethidium, DHE)染色使活性氧(reactive oxygen species, ROS)呈紅色熒光,觀察產(chǎn)生的紅色熒光,分析ROS在心臟的產(chǎn)生情況。
2.7 心肌組織形態(tài)學(xué)檢查心臟組織多聚甲醛固定,進(jìn)行石蠟包埋切片,進(jìn)行Masson染色及TUNEL染色。Masson染色后心肌纖維呈紅色,膠原纖維呈藍(lán)色,借此得出大鼠心臟是否出現(xiàn)心肌纖維化以及纖維化的嚴(yán)重程度。采用TUNEL染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算凋亡指數(shù)。
2.8 線粒體膜腫脹程度檢測(cè)采用組織線粒體純化試劑盒提取大鼠心肌組織線粒體。采用酶標(biāo)儀測(cè)定鈣誘導(dǎo)的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore,mPTP)的開(kāi)放程度。應(yīng)用BCA試劑盒測(cè)定線粒體蛋白含量。線粒體反應(yīng)緩沖液組分為150 mmol·L-1KCl、10 mmol·L-1Tris、20 mmol·L-1MOPS、5 mmol·L-1KH2PO4(pH 7.4)),以線粒體在540 nm波長(zhǎng)處A值的下降幅度(A值變化的量ΔA與初始A值之比,即ΔA/A)表示大鼠心肌組織線粒體膜腫脹程度,結(jié)果用百分?jǐn)?shù)表示來(lái)評(píng)價(jià)。
2.9 ATP含量測(cè)定根據(jù)熒光素酶需要消耗ATP催化產(chǎn)生螢光素的原理,檢測(cè)心肌組織勻漿中的ATP濃度。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。
2.10 SCAD酶活性檢測(cè)采用分光光度法檢測(cè)SCAD酶活性。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照SCAD酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。
2.11 游離脂肪酸含量檢測(cè)采用ELISA法測(cè)定大鼠心肌和血清游離脂肪酸含量。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。
2.12 Western blot分析提取心臟組織總蛋白后,采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處的OD值,代入標(biāo)曲進(jìn)行蛋白定量。配制SDS-PAGE凝膠,上樣,電泳,條件為:濃縮膠70 V, 30 min,分離膠110 V,60 min。按照典型的“三明治”法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜條件:230 mA恒流,90 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后洗膜并封閉,條件為:5% BSA溶液,1 h。一抗:SCAD抗體(1 ∶1 000)、GAPDH抗體(1 ∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜。二抗:兔抗(1 ∶10 000)、鼠抗(1 ∶10 000)室溫孵育1 h,TBST洗膜。采用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行顯影。
2.13Real-timePCR采用TRIzol裂解法提取心肌中總RNA,通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA樣品純度并計(jì)算出RNA濃度。采用RT-PCR試劑盒(TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄后合成cDNA。按照 SYBR Green試劑盒說(shuō)明書配制Real-time PCR 反應(yīng)體系。引物由上海生工合成,具體引物序列見(jiàn)Tab 1。
Tab 1 Sequences of primers for Real-time PCR
3.1 各組大鼠血壓比較由Fig 1所示,與Sham+NS組相比,LAD+NS大鼠呈持續(xù)性低血壓狀態(tài);與LAD+NS組相比,LAD+Ad-SCAD組術(shù)后第2周SBP明顯上升(P<0.05),第4周和第6周的SBP同樣明顯上升(均P<0.05),但較第2周有所降低,可能與術(shù)后心力衰竭的時(shí)間進(jìn)程有關(guān)。表明SCAD重組腺病毒心肌過(guò)表達(dá)能改善心力衰竭大鼠持續(xù)低血壓狀態(tài)。
Fig 1 Comparison of systolic blood pressure(SBP) of rats in each *P<0.05 vs Sham+NS group;#P<0.05 vs LAD+NS group
3.2 各組大鼠超聲心動(dòng)圖由Fig 2A所示,Sham+NS組、Sham+Ad-GFP組、Sham+Ad-SCAD組左室前、后壁的舒縮功能正常,組間差異無(wú)顯著性;LAD+NS組和LAD+Ad-GFP組左心室前壁的舒縮功能基本喪失,心室腔明顯增大;而LAD+Ad-SCAD組,左心室前壁舒縮功能同樣受損嚴(yán)重,但尚有微弱的舒縮功能,心室腔增大,但較LAD+NS組有所改善。由Fig 2B所示,與Sham組比較,LAD+NS組CO、SV、LVEF和FS均明顯減小(P<0.05),LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV明顯增大,表明LAD術(shù)后6周大鼠心臟的收縮/舒張功能嚴(yán)重受損,心臟泵血功能嚴(yán)重障礙,心功能明顯下降,發(fā)展為嚴(yán)重的心力衰竭;而與LAD+NS組相比,LAD+Ad-SCAD組CO、SV、LVEF和FS明顯升高(均P<0.05),LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV明顯降低。以上結(jié)果表明, SCAD重組腺病毒過(guò)表達(dá)能明顯延緩LAD術(shù)后心力衰竭的進(jìn)程,大鼠的心功能得到很大提升,心臟收縮功能得到明顯改善。
3.3 各組大鼠心臟形態(tài)學(xué)檢查由Fig 3 Masson染色所示,心肌纖維呈紅色,膠原纖維呈藍(lán)色。Sham+NS組、Sham+Ad-GFP組、Sham+Ad-SCAD組均無(wú)明顯心肌纖維化;LAD+NS組和LAD+Ad-GFP組左心室前壁結(jié)扎位置以下心尖部位出現(xiàn)明顯的心肌纖維化,室壁變薄,室壁組成只有少量紅色的心肌細(xì)胞,基本由藍(lán)色的心肌纖維構(gòu)成。而LAD+Ad-SCAD組,左心室前壁結(jié)扎位置以下心尖部位出現(xiàn)部分心肌纖維化現(xiàn)象,梗死區(qū)域膠原沉積明顯減少,心肌纖維化明顯改善。
Fig 2 Echocardiographic detection B: Changes of echocardiographic parameters.*P<0.05 vs Sham+NS group;#P<0.05 vs LAD+NS group
Fig 3 Masson staining analysisA:Sham+NS group; B: LAD+NS group; C: Sham+Ad-GFP group;D:Sham+Ad-SCAD group;E:LAD+Ad-GFP group;F:LAD+Ad-SCAD group
3.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡比較由Fig 4 TUNEL染色結(jié)果顯示,凋亡細(xì)胞呈棕褐色。其中Sham+NS組、Sham+Ad-GFP組有部分凋亡細(xì)胞,屬正?,F(xiàn)象;Sham+Ad-SCAD組心肌細(xì)胞凋亡有所減少;LAD+NS組和LAD+Ad-GFP組左心室前壁結(jié)扎位置以下心尖部位出現(xiàn)大量的心肌細(xì)胞凋亡,凋亡指數(shù)明顯高于Sham組(均P<0.05)。與LAD+NS組相比,LAD+Ad-SCAD組左心室前壁結(jié)扎部位以下心尖部位出現(xiàn)部分的心肌細(xì)胞凋亡情況得到明顯的改善,心肌細(xì)胞凋亡明顯減少,凋亡指數(shù)明顯下降(P<0.05)。
3.5 各組大鼠心肌ROS含量的變化由Fig 5 DHE染色結(jié)果顯示,與Sham+NS組相比,LAD+NS、LAD+Ad-GFP組ROS含量出現(xiàn)明顯增高(均P<0.05);與LAD+NS組相比,LAD+Ad-SCAD組心肌ROS含量明顯降低(P<0.05)。
3.6 各組大鼠線粒體膜腫脹變化由Fig 6所示,與Sham+NS組相比,LAD+NS組、LAD+Ad-GFP組線粒體膜腫脹明顯上升(P<0.05),表明心力衰竭大鼠的線粒體結(jié)構(gòu)受到明顯的損傷。與Sham+NS組相比,Sham+Ad-SCAD組線粒體膜腫脹程度下降(P<0.05)。與LAD+NS組相比,LAD+Ad-SCAD組線粒體膜腫脹程度明顯下降(P<0.05),表明SCAD重組腺病毒過(guò)表達(dá)對(duì)心肌線粒體具有明顯的保護(hù)作用。
3.7 各組大鼠術(shù)后6周SCAD mRNA和蛋白表達(dá)在心肌中的變化情況由Fig 7所示,與Sham+NS組相比,LAD+NS組心肌SCAD mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)。與LAD+NS組相比,LAD+Ad-SCAD組SCAD mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)。表明LAD術(shù)后6周,重組腺病毒介導(dǎo)的SCAD在心肌中存在過(guò)表達(dá)。
3.8 各組大鼠SCAD 酶活性、ATP含量、游離脂肪酸含量的變化由Fig 8所示,與Sham+NS組相比,LAD+NS組大鼠SCAD酶活性和ATP含量明顯降低、心肌和血清游離脂肪酸含量均明顯升高(均P<0.05)。與LAD+NS組相比,LAD+Ad-SCAD組大鼠SCAD酶活性和ATP含量明顯升高,游離脂肪酸含量均明顯降低(均P<0.05)。表明術(shù)后6周重組腺病毒介導(dǎo)的SCAD過(guò)表達(dá),引起SCAD酶活性增高,增強(qiáng)了心肌線粒體脂肪酸氧化能力,生成更多的ATP,游離脂肪酸明顯減少。
Fig 4 Light microscopic observation of myocardial cell apoptosis in rat TUNEL Sham+NS; B: LAD+NS; C: Sham+Ad-GFP;D: Sham+Ad-SCAD; E: LAD+Ad-GFP; F: LAD+Ad-SCAD.*P<0.05 vs Sham+NS group;#P<0.05 vs LAD+NS group
Fig 5 Detection of ROS by DHE staining in myocardial tissues of rats in each Sham+NS; B: LAD+NS; C: Sham+Ad-GFP;D: Sham+Ad-SCAD; E: LAD+Ad-GFP; F: LAD+Ad-SCAD.*P<0.05 vs Sham+NS group;#P<0.05 vs LAD+NS group
Fig 6 Swelling changes of mitochondrial in *P<0.05 vs Sham+NS group;#P<0.05 vs LAD+NS group
Fig 7 Expression SCAD protein and A: Sham+NS; B: LAD+NS; C: Sham+Ad-GFP;D: Sham+Ad-SCAD; E: LAD+Ad-GFP; F: LAD+Ad-SCAD.*P<0.05 vs Sham+NS group;#P<0.05 vs LAD+NS group
Fig 8 Comparison of SCAD activity, ATP and free fatty acid content in myocardium of rats in each A: Sham+NS; B: LAD+NS; C: Sham+Ad-GFP;D: Sham+Ad-SCAD; E: LAD+Ad-GFP; F: LAD+Ad-SCAD.*P<0.05 vs Sham+NS group;#P<0.05 vs LAD+NS group
心力衰竭發(fā)病機(jī)制尤為復(fù)雜,至今尚未完全闡明。目前公認(rèn)的導(dǎo)致心力衰竭基本機(jī)制是心臟舒縮功能障礙,導(dǎo)致供血不能滿足機(jī)體活動(dòng)需要,能量代謝改變是心臟舒縮功能障礙的關(guān)鍵因素[11]。正常狀態(tài)下,約70%的心肌能量來(lái)源于心肌線粒體脂肪酸β氧化。然而,心力衰竭時(shí)代謝底物由脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?,脂肪酸氧化能力顯著減弱,導(dǎo)致心肌供能不足,葡萄糖氧化無(wú)法代償性增加,進(jìn)一步加強(qiáng)了心力衰竭的能量生成障礙[12-14]。
我們前期研究顯示,SCAD的表達(dá)下調(diào)與心力衰竭的發(fā)展密切相關(guān)[8]。為了進(jìn)一步明確SCAD在心力衰竭中的作用,利用SCAD重組腺病毒對(duì)心力衰竭大鼠進(jìn)行心臟多點(diǎn)注射,研究SCAD過(guò)表達(dá)對(duì)心臟舒縮功能以及心肌線粒體能量代謝的影響。
本研究發(fā)現(xiàn),在LAD術(shù)應(yīng)激下,同時(shí)進(jìn)行SCAD重組腺病毒過(guò)表達(dá),能改善大鼠由LAD術(shù)后引起的持續(xù)性低血壓。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)SCAD能改善心肌梗死導(dǎo)致的心臟舒縮功能障礙,各項(xiàng)超聲心動(dòng)圖指標(biāo)得到明顯改善。同時(shí),過(guò)表達(dá)SCAD能明顯改善LAD術(shù)后引起的心肌纖維化和心肌細(xì)胞的大量喪失,減少心肌膠原沉積,改善心肌細(xì)胞的凋亡,降低ROS含量和線粒體膜腫脹程度,保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu),有效延緩了心力衰竭的病理性重構(gòu)。
LAD+Ad-SCAD組大鼠SCAD酶活性提高,ATP含量增高,游離脂肪酸含量減少,表明SCAD促進(jìn)了線粒體脂肪酸β氧化反應(yīng),改善了LAD手術(shù)導(dǎo)致心肌缺血缺氧引起的心肌能量代謝障礙。以上結(jié)果提示,SCAD重組腺病毒過(guò)表達(dá)可以減緩心肌梗死大鼠向心力衰竭發(fā)展的進(jìn)程,可能與SCAD對(duì)心臟能量代謝的正性調(diào)節(jié)作用和抑制線粒體凋亡途徑,從而保護(hù)心肌細(xì)胞的作用密切相關(guān)。
綜上所述,SCAD重組腺病毒在心力衰竭治療中可能發(fā)揮了至關(guān)重要的作用,這為心力衰竭的防治提供了一個(gè)新靶點(diǎn)和新思路,為進(jìn)一步研究SCAD在心力衰竭中的作用奠定了基礎(chǔ)。然而,SCAD過(guò)表達(dá)改善心力衰竭的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。