鄭銀彬 吳國俊 羅 暉 汪 華 杜宗漢

作者單位：637000 南充 南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院1胸心外科，2消化內(nèi)科

食管癌是發(fā)生于食管上皮組織的惡性腫瘤，在我國發(fā)生率約占所有惡性腫瘤的3.2%［1］。目前臨床上超過90%的食管癌患者確診時已進展至中晚期，傳統(tǒng)的治療手段如手術、放化療等綜合治療手段不斷進步，但患者預后仍較差，5年生存率低于20%［2］。近年來分子靶向治療取得一定成效，而探索有效的治療靶點成為研究的熱點之一。NKX6.3是NKX6家族蛋白一類進化上保守的轉(zhuǎn)錄因子，位于人體染色體4q21.2-q22上，其編碼的蛋白是細胞受應激原刺激后誘導產(chǎn)生的一種應激蛋白，與腫瘤發(fā)生、增殖及分化有關［3］。在胃癌細胞研究中發(fā)現(xiàn)，NKX6.3基因可抑制細胞周期進程并通過死亡受體和線粒體途徑誘導細胞凋亡，從而明顯阻止細胞增殖［4］。而NKX6.3在食管癌細胞中是否也發(fā)揮同樣作用尚未知。本研究在食管癌EC9706細胞中轉(zhuǎn)染NKX6.3后觀察其對細胞增殖、凋亡及侵襲的影響以及對活性氧的調(diào)節(jié)作用，并探討其作用機制，以期為食管癌治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

食管癌EC9706細胞購自中國科學院細胞庫；TRAIL 購自英國 Pepro Tech 公司；Caspase-3、Bcl-2、Bax抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；E-cadherin、N-cadherin、NKX6.3抗體購自Santa Cruze Biotechnology公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自杭州四季青生物工程材料有限公司；CCK-8試劑盒購自默沙克有限公司；Lip2000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒購自金克?。ū本┥锛夹g有限公司。酶聯(lián)免疫檢測儀購自北京諾亞威儀器儀表有限公司；熒光分光光度計購自上海儀電分析儀器有限公司；全自動生化分析儀購自日本日立公司；流式細胞儀購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

食管癌EC9706細胞培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素RPMI 1640培養(yǎng)基的37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，細胞匯合率達85%以上進行傳代培養(yǎng)。根據(jù)LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染細胞。食管癌EC9706細胞傳三代培養(yǎng)于6孔板中，24 h后分別轉(zhuǎn)染NKX6.3（NKX6.3組）和空白質(zhì)粒（miR-NC組），并設空白對照組（Control組）。載體為pcDNA3.1-3xflag，嚴格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書方法操作。用不含抗生素的培養(yǎng)基接種細胞，接種量（0.5～2.0）×105個，24 h 后待細胞生長至 80%左右匯合，按照說明書配置方法制成DNA和Lip2000稀釋液，將DNA-Lip2000復合物加入接種細胞，培養(yǎng)48 h后收集并篩選細胞，進行Western blot檢測。

1.3 RT-PCR檢測食管癌EC9706細胞NKX6.3的表達

轉(zhuǎn)染后收集各組細胞，用TRIzol試劑提取細胞總RNA，測定RNA濃度和純度后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進行PCR反應。PCR引物序列：NKX6.3的上游引物 5′-GCGAATTCATGGACGTTAATATCGCCC-3′，下游引物 5′-CGTCTAGATTCCTTCACTTGCTGATATAG-3′；以 β-actin 為參照，上游引物 5′-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3′，下游引物 5′-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3′。PCR 反應條件：95 ℃、15 min；95 ℃ 15s，55 ℃ 30s，72 ℃ 1s，共 40 個循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。實驗重復3次。

1.4 CCK-8法檢測食管癌EC9706細胞增殖情況

取各組對數(shù)生長期細胞，接種于96個孔板中（100 μL／孔），于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。分別于培養(yǎng) 0 h、12 h、24 h、48 h 后加入 10 μL CCK-8溶液并培養(yǎng)2 h，用酶標儀測定450 nm處各孔吸光度（OD）值，計算細胞增長率。細胞增長率（%）=［（對照組OD值-實驗組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）］×100%。實驗重復3次。

1.5 流式細胞儀檢測食管癌EC9706細胞凋亡、活性氧及線粒體膜電位情況

收集各組待測EC9706細胞，加入100 μL Binding Buffer重懸，然后加入5 μL Annexin V-FITC和 5 μL PI，室溫避光孵育 15 min后加入 400 μL Binding Buffer，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

將2×105個對數(shù)生長期的EC9706細胞接種于6孔培養(yǎng)板，細胞生長至90%融合時加入DDP培養(yǎng)2 h，胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，過濾后加入終濃度為5 μmol/L的 DCFH-DA，37 ℃孵育 30 min，于激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長530 nm處用流式細胞儀檢測細胞熒光強度。檢測細胞內(nèi)線粒體熒光強度時細胞生長至90%融合時加入DDP后培養(yǎng)12 h，胰蛋白酶消化后加入100 μmol/L的熒光染料DiOC6（3），其余步驟同上。

1.6 Transwell法檢測食管癌EC9706細胞侵襲能力

取對數(shù)生長期的EC9706細胞，調(diào)節(jié)細胞密度為1×105/mL，將 Transwell小室放入 24 孔板，4°C 預冷，上室加入1∶4稀釋的Matrigel基質(zhì)膠，待凝固后上室加入RPMI1640培養(yǎng)基400 μL，下室加入正常培養(yǎng)液。細胞沉降后培養(yǎng)24 h，用無菌棉簽擦去小室內(nèi)細胞，用結(jié)晶紫對侵襲至小室下層的細胞進行染色，拍照、計數(shù)穿膜細胞，每組3個復孔，實驗至少重復3次。

1.7 Western blot檢測食管癌EC9706細胞蛋白表達水平

收集對數(shù)生長期的EC9706細胞，用含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液裂解，提取蛋白并取15～20 μL，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，室溫下靜置 30～60 min。一抗（稀釋比例1∶1 000）4°C孵育過夜，二抗（稀釋比例1∶3 000）室溫孵育l h。顯色，然后用凝膠成像系統(tǒng)曝光，以Actin為內(nèi)參蛋白，相對蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計學意義，采用SNK法進一步行多重比較。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌EC9706細胞中NKX6.3的表達

Western blot和RT-PCR檢測顯示，轉(zhuǎn)染后Control組、miR-NC組、NKX6.3組NKX6.3蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義（F=8.987，P=0.001），NKX6.3 mRNA 表達差異亦有統(tǒng)計學意義（F=12.396，P＜0.001），其中NKX6.3組蛋白和mRNA表達量均高于miR-NC組（均P＜0.01）。見圖 1。

2.2 NKX6.3對食管癌EC9706細胞增殖的影響

Western blot實驗顯示，Control組、miR-NC 組、NKX6.3組Ki67蛋白表達組間差異有統(tǒng)計學意義（F=7.018，P=0.001），CCK-8 法檢測亦顯示 3 組細胞增殖率差異有統(tǒng)計學意義（F=6.378，P=0.003），其中NKX6.3組Ki67蛋白表達量和細胞增殖率均低于miR-NC 組（均 P＜0.01）。見圖 2。

圖1 轉(zhuǎn)染后食管癌EC9706細胞中NKX6.3的表達情況Fig.1 Expression of NKX6.3 in esophageal cancer EC9706 cells after transfection

圖2 NKX6.3對食管癌EC9706細胞增殖的影響Fig.2 Effect of NKX6.3 on the proliferation of esophageal cancer EC9706 cells

2.3 NKX6.3對食管癌EC9706細胞內(nèi)活性氧、線粒體膜電位的影響

流式細胞儀檢測活性氧、線粒體膜電位，結(jié)果顯示，Control組、miR-NC 組、NKX6.3組細胞活性氧、線粒體膜電位組間差異有統(tǒng)計學意義（F=22.369，P＜0.001），其中NKX6.3組細胞活性氧高于miR-NC組，而線粒體膜電位低于miR-NC組（P＜0.001）。見圖3。

圖3 NKX6.3對食管癌EC9706細胞活性氧和線粒體膜電位的影響Fig.3 Effects of NKX6.3 on reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential of esophageal cancer EC9706 cells

2.4 NKX6.3對食管癌EC9706細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測檢細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，Control組、miR-NC組、NKX6.3組細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（F=18.076，P＜0.001），其中 NKX6.3 組細胞凋亡率高于miR-NC組（P＜0.001）。見圖4A。Western blot檢測結(jié)果顯示，3組細胞中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達水平差異亦有統(tǒng)計學意義（F=22.369，P＜0.001），其中NKX6.3組Bcl-2蛋白表達水平較miR-NC組降低（P＜0.001），而Bax及Caspase-3蛋白表達水平升高（P＜0.001）。見圖 4B。

圖4 NKX6.3對食管癌EC9706細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of NKX6.3 on apoptosis of esophageal cancer EC9706 cells

2.5 NKX6.3對食管癌EC9706細胞侵襲的影響

Transwell小室實驗結(jié)果顯示，Control組、miR-NC組、NKX6.3組細胞侵襲數(shù)目差異有統(tǒng)計學意義（F=10.972，P＜0.001），其中NKX6.3組細胞侵襲數(shù)目較miR-NC組降低（P＜0.001）。見圖5A。Western blot檢測結(jié)果顯示，3 組細胞 Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達水平差異亦有統(tǒng)計學意義（F=16.789，P＜0.001），其中與miR-NC組相比，NKX6.3組N-cadherin蛋白表達水平降低（P＜0.001），而 Vimentin、E-cadherin 蛋白表達水平升高（P＜0.001）。見圖 5B。

圖5 NKX6.3對食管癌EC9706細胞侵襲的影響Fig.5 Effect of NKX6.3 on the invasion of esophageal cancer EC9706 cells

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學特征，也是臨床上絕大多數(shù)腫瘤患者的致死因素，因此阻止腫瘤表達的轉(zhuǎn)移相關因子可能有助于抑制惡性腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。目前研究發(fā)現(xiàn)NKX6.3可調(diào)控癌細胞的生物學特性。Ki67是細胞核內(nèi)與細胞分裂增殖相關的蛋白抗原，在維持DNA結(jié)構穩(wěn)定及細胞有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用，也是反映細胞增殖的敏感指標［5-6］。本研究構建過表達NKX6.3的食管癌細胞后，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染NKX6.3后Ki67蛋白降低，細胞增殖亦明顯受抑制，說明NKX6.3可抑制食管癌細胞增殖，而這可能通過抑制Ki67表達而阻礙食管癌細胞有絲分裂過程實現(xiàn)。

線粒體是調(diào)控細胞凋亡的核心，當線粒體通透性改變其膜電位也會隨之改變［7］。劉亮等［8］通過降低食管癌EC9706細胞線粒體膜電位，啟動內(nèi)源性線粒體凋亡途徑，從而促進細胞凋亡。除了線粒體膜電位，細胞內(nèi)的活性氧水平也是細胞凋亡的關鍵因素之一，可作用于線粒體而促使線粒體膜通透性改變、膜電位下降、釋放色素C等［9］。本研究中的流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NKX6.3后細胞凋亡水平明顯增強，細胞活性氧水平升高，而線粒體膜電位降低，說明NKX6.3可促進細胞凋亡。而除了線粒體凋亡途徑，基因也是調(diào)控細胞凋亡的主要途徑之一。Caspase是一種具有特異天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶，是一組在細胞凋亡過程中起著關鍵作用的酶，其中Caspase-9基因處于Caspase家族激活基因的頂端，是Caspase家族中最常見的凋亡啟動子，通過自身裂解可使pro-Caspase-3產(chǎn)生有活性的Caspase-3，然后通過剪切另外的Caspase底物引起級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡［10］。Bcl-2家族也是常見的凋亡控制基因，當Bcl-2表達下降，Bax表達上升時，可促進細胞凋亡；而當Bcl-2表達升高，Bax表達降低時，則抑制細胞凋亡［11-12］。本研究進一步檢測凋亡相關蛋白（Bcl-2、Bax及Caspase-3）的表達情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染NKX6.3后細胞中Bcl-2蛋白表達水平降低，而Bax及Caspase-3蛋白表達水平升高，由此可見，NKX6.3基因既可通過提高癌細胞的氧化應激反應而促進細胞凋亡，也可以通過影響凋亡相關基因表達而抑制細胞凋亡。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchyml transition，EMT）使腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的早期事件，腫瘤細胞可通過細胞極性喪失，改變自身細胞形態(tài)而與其他細胞分離［13-14］。EMT過程通常伴隨著相關蛋白的表達變化，例如E-cadherin、N-cadherin及Vimentin等。其中E-cadherin和N-Cadherin是鈣依賴性的跨膜蛋白，參與細胞與細胞間黏附，其含量改變會影響細胞間的黏附作用，當N-cadherin蛋白含量降低、E-cadherin蛋白含量升高時，細胞間的黏附能力增強，可抑制癌細胞侵襲和遷移［15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染NKX6.3后細胞侵襲和遷移能力減弱，N-cadherin蛋白表達水平降低，而Vimentin、E-cadherin蛋白表達水平升高，說明過表達NKX6.3可能通過抑制EMT過程，增強細胞間的黏附能力，從而降低食管癌細胞的侵襲及遷移能力，抑制腫瘤擴散和轉(zhuǎn)移。

本研究發(fā)現(xiàn)，NKX6.3可通過提高食管癌細胞中的活性氧成分，破壞其線粒體膜結(jié)構，降低膜電位，以及調(diào)控凋亡相關基因表達而促進細胞凋亡，通過抑制增殖相關蛋白表達及EMT過程而降低細胞增殖和侵襲能力，因此NKX6.3可能是阻斷食管癌轉(zhuǎn)移和治療的潛在靶點。但NKX6.3對食管癌細胞的具體作用機制以及在其他食管癌細胞系及動物體內(nèi)中的作用有待進一步研究。