曹春芽龔 明?仇成鳳王 安關(guān) 嵐劉新民

（1.湖南醫(yī)藥學(xué)院，湖南 懷化 418000；2.懷化市第一人民醫(yī)院，湖南 懷化 418000；3.中南大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙 410208；4.侗醫(yī)藥研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化 418000）

鉛污染已成為世界當(dāng)今普遍存在現(xiàn)象之一，隨著國(guó)家工業(yè)化水平不斷提高，推動(dòng)經(jīng)濟(jì)迅猛發(fā)展的同時(shí)，也加大了鉛污染的范圍，增加慢性鉛中毒的可能性。鉛對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有強(qiáng)親和力，尤其對(duì)兒童的神經(jīng)系統(tǒng)及智力發(fā)育有嚴(yán)重的毒害作用［1］。世界衛(wèi)生組織把鉛確認(rèn)為對(duì)兒童影響最嚴(yán)重的有毒化學(xué)物質(zhì)，能影響兒童生長(zhǎng)發(fā)育，降低免疫力。慢性鉛中毒對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)等可產(chǎn)生終身性的傷害，鉛中毒臨床表現(xiàn)常會(huì)出現(xiàn)頭痛、頭暈、失眠，甚至煩躁、昏迷、貧血、肝腎損害等癥狀。目前治療的方法可分為西醫(yī)治療與中醫(yī)治療。西醫(yī)臨床上主要是通過螯合鉛，促進(jìn)鉛的排泄。其分為兩類，一類是以依地酸二鈉鈣為代表藥物的羧基螯合鉛；另一類是以二巰丁二酸鈉為代表藥的巰基螯合鉛。但是螯合劑治療易造成人體基本元素的缺失，易引起電解質(zhì)的紊亂，其不良反應(yīng)限制了廣泛應(yīng)用。中醫(yī)認(rèn)為鉛中毒的病機(jī)為肝失疏泄、肝膽郁滯、氣化失常，可運(yùn)用解毒清熱、化瘀、疏肝利濕藥物治療［2］。張喜蓮等［3］應(yīng)用疏肝利膽法可降低血鉛含有量，避免必需微量元素鈣、鋅的流失。中藥處方多組分、多部位、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的整體治療特點(diǎn)，適合于癥狀體征復(fù)雜的慢性鉛中毒的治療，因而從天然產(chǎn)物中尋找預(yù)防、治療慢性鉛中毒的安全藥物具有重要的意義。

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止血、清心除煩、涼血消癰等功效［4］，是丹桃金活血方中的主要藥味之一?，F(xiàn)代藥理研究表明丹參可改善微循環(huán)，對(duì)中樞神經(jīng)有調(diào)節(jié)作用，可減輕鉛中毒煩躁、多動(dòng)癥狀，有利鉛中毒患者神經(jīng)衰弱、失眠多夢(mèng)癥狀的調(diào)節(jié)［5］。因此，本研究探討丹參提取物對(duì)鉛中毒小鼠腎臟氧化應(yīng)激保護(hù)的作用機(jī)制，以期為丹參提取物治療慢性鉛中毒提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性昆明小鼠60 只，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK（粵）2017-0015。

1.2 試藥 丹參購(gòu)自龍?jiān)创笏幏?，?jīng)湖南醫(yī)藥學(xué)院王鼎老師鑒定為正品。丹參提取物本實(shí)驗(yàn)室自制［6］，即取丹參飲片適量，加9 倍量的60%乙醇提取1.5 h，濃縮成生藥材質(zhì)量濃度分別為2、4、6 g/mL。醋酸鉛對(duì)照溶液（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）；二巰基丁二酸（DMSA，美國(guó)Sigma 公司）；血清尿素氮（BUN，批號(hào)20170812）、血 清肌酐（CR，批號(hào)20170520）、丙二醛（MDA，批號(hào)20170514）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，批號(hào)20170815）、超氧化物歧化酶（SOD，批號(hào)20170720）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Trizol 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司，批號(hào)15596-026），其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 造模、分組 取60 只清潔級(jí)雄性昆明小鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組、丹參提取物低、中、高劑量組。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，稱定質(zhì)量。除正常對(duì)照組外，每組小鼠均按體質(zhì)量進(jìn)行腹腔注射醋酸鉛20 mg/kg，正常對(duì)照組注射相同劑量的生理鹽水，每隔1 天注射1 次，自由采食、飲水，連續(xù)20 d。造模完成后對(duì)小鼠灌胃給藥，正常對(duì)照組、模型組每天灌胃給予純化水，陽(yáng)性藥組按體質(zhì)量灌胃DMSA 混懸液70 mg/kg，丹參提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組按質(zhì)量分別灌胃丹參提取物（20、40、60 g/kg），1 次/d，連續(xù)給藥10 d。

2.2 樣本采集與制備 給藥10 d 后，禁食不禁水24 h 后，眼眶取血，處死小鼠后迅速摘取小鼠的左右腎，生理鹽水洗凈，吸干水分，稱定質(zhì)量。取左腎組織用10%福爾馬林固定，用于組織病理學(xué)觀察，右腎低溫冷凍保存。

2.3 測(cè)定腎臟系數(shù) 處死前測(cè)定小鼠體質(zhì)量，處死后迅速摘取腎臟，洗凈、吸干水分、稱定腎臟質(zhì)量，腎臟系數(shù)=（腎臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量）×100%。

2.4 測(cè)定血清生化指標(biāo) 眼眶取血，離心，取上清液，采用全自動(dòng)生化學(xué)檢測(cè)儀（HTTACHI）測(cè)定小鼠BUN、CR水平。

2.5 觀察腎組織病理學(xué)變化 10%福爾馬林固定腎組織，酒精脫水，石蠟包埋，切片，二甲苯溶液脫蠟，HE 染色，脫水，封片，光學(xué)鏡觀察組織病理學(xué)變化。

2.6 測(cè)定氧化應(yīng)激指標(biāo) 嚴(yán)格按照各試劑盒的說明書測(cè)定腎臟組織中的GSH-Px、SOD 及MDA 水平。

2.7 檢測(cè)Bcl-2、BaxmRNA 表達(dá) 按TRIzol 試劑盒說明書提取腎組織勻漿的總mRNA，采用qRT-PCR 檢測(cè)腎臟組織中Bcl-2、BaxmRNA 表達(dá)，所用引物見表1。

表1 引物序列

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以（）表示，多組間采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 丹參提取物對(duì)體重及腎臟系數(shù)的影響 如表2 所示，與正常對(duì)照組比較，鉛處理的小鼠的生長(zhǎng)受到影響。與模型組比較，丹參提取物組（低、中、高劑量）與陽(yáng)性藥組小鼠的體質(zhì)量增加（P＜0.05），其腎臟系數(shù)減?。≒＜0.05）。

3.2 丹參提取物對(duì)BUN、Cr 水平的影響 如圖1 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠 BUN、Cr 的水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹參提取物組降低小鼠BUN、Cr 水平（P＜0.05），且具有劑量依賴性。

表2 丹參提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量及腎臟系數(shù)的影響（，n＝10）

表2 丹參提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量及腎臟系數(shù)的影響（，n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

圖1 丹參提取物對(duì)小鼠BUN、Cr 水平的影響（n＝10）

3.3 丹參提取物對(duì)組織切片病理學(xué)的影響 如圖2 所示，正常對(duì)照組腎組織結(jié)構(gòu)完整、無(wú)組織病理改變，模型組則有模糊的組織結(jié)構(gòu)、腎小球、腎小管上皮細(xì)胞萎縮。丹參提取物組（低、中、高劑量）不同程度改善了腎組織的病理學(xué)變化，其中丹參提取物高劑量組的腎組織損傷改善程度最高。

圖2 光鏡下觀察小鼠腎組織病理學(xué)改變（HE，× 400）

3.4 丹參提取物對(duì)SOD、GSH-Px、DMA 水平的影響 如圖3 所示，與正常對(duì)照組比較，鉛處理后小鼠SOD、GSHPx 水平降低，MDA 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹參提取物組SOD、GSH-Px 水平升高（P＜0.05），MDA水平降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）。

圖3 丹參提取物對(duì)SOD、GSH-Px、DMA 水平的影響（n＝10）

3.5 丹參提取物對(duì)Bax、Bcl-2 mRNA 表達(dá)的影響 如圖4所示。與正常對(duì)照組比較，模型組Bcl-2 mRNA 表達(dá)降低，BaxmRNA 的表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹參提取物組Bcl-2 mRNA 的表達(dá)增加，BaxmRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）。

4 討論

腎臟是對(duì)鉛敏感的靶器官。鉛在腎臟積累嚴(yán)重影響身體發(fā)育，造成一系列生理、生化指標(biāo)的變化，影響中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)的功能［7-8］。鉛處理的小鼠體質(zhì)量顯著減輕，組織病理學(xué)變化明顯，BUN、Cr 的水平顯著升高，表明醋酸鉛致小鼠中毒模型已成功建立。

BUN、Cr 分別為含氮有機(jī)物和蛋白代謝的終產(chǎn)物，作為腎小球?yàn)V過功能的診斷和過篩指標(biāo)，當(dāng)腎小球?yàn)V過功能減低時(shí)，血肌酐和尿素氮因潴留而增高。現(xiàn)代藥理研究表明天然的抗氧化劑能保護(hù)鉛中毒引起的腎細(xì)胞的損傷，改善腎功能［2，9］。組織病理學(xué)顯示，改善腎組織結(jié)構(gòu)損傷程度與丹參提取物劑量呈正比。與模型組相比，丹參提取物各組小鼠的BUN、Cr 的水平顯著降低。這可能是由于丹參提取物中含有以丹酚酸為代表的大量酚酸類化合物，而大量的酚羥基結(jié)構(gòu)的物質(zhì)具有良好的抗氧化作用［10］，從而起到修復(fù)腎組織結(jié)構(gòu)損傷作用。

圖4 丹參提取物對(duì)小鼠Bcl-2 及Bax mRNA 水平的影響（n＝10）

研究表明氧化應(yīng)激在鉛誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中扮演重要角色［11］。GSH-Px 可以保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)［12］，SOD 是機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基因子［13］，MDA 作為脂質(zhì)過氧化的分解產(chǎn)物［14］，這3 個(gè)指標(biāo)的水平變化反映機(jī)體內(nèi)氧化程度，可作為細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)。與模型組對(duì)比，陽(yáng)性藥組、丹參提取物組的GSH-Px 和SOD 水平顯著提高；MDA 水平顯著降低。這表明丹參提取物能夠消除活性氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)，改善腎組織損傷。

Bax 和Bcl-2 作為重要的細(xì)胞蛋白來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，同時(shí)也是2 種對(duì)立的蛋白質(zhì)，其之間的比值暗示了細(xì)胞發(fā)展的方向。Bax 過度表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2 的作用與其相反［15-16］。正常對(duì)照組BaxmRNA 表達(dá)顯著低于模型組；與模型組對(duì)比，丹參提取物各組BaxmRNA 表達(dá)均顯著性降低，Bcl-2 mRNA 表達(dá)的變化趨勢(shì)與之相反。這表明丹參提取物可通過調(diào)節(jié)Bax與Bcl-2 mRNA 的表達(dá)，抑制鉛誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究闡明丹參提取物對(duì)鉛中毒小鼠腎氧化應(yīng)激保護(hù)的作用機(jī)制。通過加強(qiáng)抗氧化防御、抑制腎細(xì)胞凋亡、改善腎組織損傷，這可能與丹參提取物中酚酸類結(jié)構(gòu)物質(zhì)抗氧化與抑制細(xì)胞凋亡的功能相關(guān)，這為丹參減輕鉛中毒煩躁、多動(dòng)癥狀，改善鉛中毒患者神經(jīng)衰弱、失眠多夢(mèng)癥狀的調(diào)節(jié)作用提供理論依據(jù)。我國(guó)的鉛污染范圍廣，以丹參為原料，研制出平緩排鉛、副作用小的保健食品或藥品，預(yù)防鉛中毒，特別是防止兒童鉛中毒，具有重要意義。