陳 霞，劉 丹，段娟娟，李晉生，張曉笛，何麗娟，黃 倩，張瀚濤，顧海鷗

［1.北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司，北京 100079；2.北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，北京 100079；3.中國北京同仁堂（集團(tuán)） 有限責(zé)任公司，北京 100079］

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）在我國總?cè)巳喊l(fā)病率為8.6%，其中40 歲以上人群中發(fā)病率高達(dá)13.7%［1］，已成為我國嚴(yán)重威脅人民群眾健康的重大慢性疾病。因此，探索有效的治療藥物及方案已成為研究的焦點。COPD 的發(fā)病機(jī)制是多因素參與的結(jié)果，至今尚未完全闡明。西醫(yī)在控制COPD 急性發(fā)作及感染方面，目前優(yōu)勢突出，但治療上仍局限于對癥處理。中醫(yī)藥在治療該病有其獨特的辨證優(yōu)勢，擅長多靶點多層次整體調(diào)節(jié)，具有治則治法豐富，療效穩(wěn)定，不良反應(yīng)少等獨特優(yōu)勢。所以研究挖掘治療該病確切有效的中成藥已經(jīng)成為COPD 防治研究的重要策略。利肺片具有驅(qū)癆補(bǔ)肺、鎮(zhèn)咳化痰之功效，用于肺癆咳嗽、咯痰、咯血、氣虛哮喘、慢性支氣管炎等。有文獻(xiàn)報道和臨床實際應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)利肺片對COPD 具有一定的治療作用。因此本研究開展了相應(yīng)的藥效學(xué)研究，以期進(jìn)一步明確藥物治療COPD 的效應(yīng)機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 Wistar 大鼠，SPF 級，雄性，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2012-0001。

1.2 試劑與藥物 利肺片（北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號15122182）。氨茶堿（石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號040150304）；固本咳喘片（精華制藥集團(tuán)股份有限公司，批號23151102）；脂多糖（美國Sigma 公司，批號064M4125V）；SOD（批號20160902）、MDA（批號20160901）、NO 試劑盒（批號20160820）購自南京建成生物工程研究所；MMP-9 ELISA 試劑盒（美國Cusabio 公司，批號C07031593）。

1.3 儀器 AniRes 動物肺功能儀（北京貝蘭博科技有限公司）；Epoch2 酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）。ADVIA2120i血液分析儀（德國Siemens 公司）。自制煙熏箱（60 cm×60 cm×70 cm），由有機(jī)玻璃制成。

2 方法

2.1 造模、分組、給藥 Wistar 大鼠，雄性，105 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)9 d，隨機(jī)分為空白組、模型組、氨茶堿組（0.06 g/kg）、固本咳喘片組（0.36 g/kg）及利肺片高、中、低劑量組（0.3、0.15、0.075 g/kg）。造模方法參照文獻(xiàn)［2］略加改動，造模組大鼠在第1 天和第14 天用50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，快速向氣管內(nèi)注入1 mg/mL的脂多糖溶液，每只0.2 mL，然后將大鼠固定板豎立旋轉(zhuǎn)，左右搖晃約30 次，使脂多糖溶液能夠均勻分布于兩肺，空白組大鼠注入生理鹽水。煙熏（插管日不煙熏），實驗第2～13 天及第15～60 天將造模組大鼠放入自制煙熏箱內(nèi)給予煙熏，每次15 只大鼠，10 支香煙/次，2 次/d，30 min/次。空白組大鼠不煙熏。在模型復(fù)制過程中，有20只造模大鼠死亡，模型制備的成功率為77.8%。各給藥組分別灌胃給予相應(yīng)的藥物，1 次/d，連續(xù)給藥4 周；空白組和模型組灌胃給予同體積蒸餾水。

2.2 測定大鼠肺功能 末次給藥后用AniRes 動物肺功能分析系統(tǒng)檢測大鼠肺功能（FEV0.3、FEV0.3/FVC%、MMF、PEF）。

2.3 檢測血清NO、MDA、SOD 水平 腹主動脈取血，離心取血清，按照試劑盒說明書測定血清中NO、MDA、SOD水平。

2.4 檢測炎癥細(xì)胞分類計數(shù) 對大鼠左側(cè)肺葉用冰生理鹽水2 mL 進(jìn)行灌洗，用ADVIA2120i 血液分析儀進(jìn)行炎癥細(xì)胞分類計數(shù)。

2.5 檢測MMP-9 水平 采用ELISA 法。取出右肺葉迅速放入液氮中，用以測定肺組織中MMP-9 水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（）表示，進(jìn)行方差齊性檢驗。方差齊采用方差分析；方差不齊采用非參數(shù)檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般生長狀態(tài) 空白組大鼠身體毛發(fā)白有光澤，無煩躁不安，呼吸平穩(wěn)均勻，鼻頭濕潤沒有喘促，食量及飲水穩(wěn)定，活動正常，排便正常，體質(zhì)量增長迅速。其余各組大鼠在整個造模過程中，動物表現(xiàn)由開始的煩躁不安轉(zhuǎn)為精神萎靡不振。隨著造模過程的推移，動物身體毛發(fā)逐漸枯槁、發(fā)黃、無光澤，呼吸急促、喘息、腹式呼吸加重，鼻頭日漸發(fā)紺、分泌物較多，飲水增加，活動減少，喜拱背蜷縮，喜扎堆聚集，體質(zhì)量明顯減輕。給藥3 周后，給藥組較模型組體質(zhì)量明顯增加，癥狀明顯改善。見表1。

表1 利肺片對COPD 模型大鼠體質(zhì)量的影響（）

表1 利肺片對COPD 模型大鼠體質(zhì)量的影響（）

注：與空白組比較，#P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.01。

3.2 大鼠肺功能 與空白組比較，模型組大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC%、MMF、PEF 降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，利肺片高、中劑量組升高FEV0.3、FEV0.3/FVC%、MMF、PEF（P＜0.05，P＜0.01）；利肺片低劑量組升高M(jìn)MF、PEF（P＜0.05）。提示利肺片能較好地改善COPD 肺功能。見表2。

表2 利肺片對COPD 模型大鼠肺功能的影響（）

表2 利肺片對COPD 模型大鼠肺功能的影響（）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.3 大鼠血清SOD、MDA、NO 水平 與空白組比較，模型組大鼠血清SOD、NO 水平降低（P＜0.01），血清MDA水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，利肺片高、中、低劑量組可 升高大 鼠血清SOD、NO 水平（P＜0.05，P＜0.01），利肺片高、中劑量組可降低大鼠血清MDA 水平（P＜0.05）。見表3。

表3 利肺片對COPD 大鼠血清SOD、MDA、NO 水平的影響（）

表3 利肺片對COPD 大鼠血清SOD、MDA、NO 水平的影響（）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.4 大鼠肺灌洗液中炎癥細(xì)胞 與空白組比較，模型組大鼠肺灌洗液中WBC 總數(shù)、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量升高（P＜0.01）；與模型組比較，利肺片高、中、低劑量組大鼠肺臟灌洗液中WBC 總數(shù)、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量降低（P＜0.01）。利肺片可改善COPD 模型大鼠肺臟組織炎性細(xì)胞浸潤，具有一定的抗炎作用。見表4。

表4 利肺片對COPD 模型大鼠肺臟灌洗液中炎癥細(xì)胞分類計數(shù)的影響（）

表4 利肺片對COPD 模型大鼠肺臟灌洗液中炎癥細(xì)胞分類計數(shù)的影響（）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.5 大鼠肺組織中MMP-9 水平 與空白組比較，模型組大鼠肺組織中MMP-9 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，利肺片高、中、低劑量組可降低大鼠肺組織MMP-9 水平（P＜0.01）。由此可見利肺片具有明顯緩解COPD 大鼠蛋白酶/抗蛋白酶失衡的作用。見表5。

表5 利肺片對COPD 大鼠肺組織中MMP-9 水平的影響（）

表5 利肺片對COPD 大鼠肺組織中MMP-9 水平的影響（）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01。

4 討論

COPD 是以持續(xù)的氣流受限為主要特征，并呈進(jìn)行性發(fā)展的一種常見的慢性呼吸道疾病，最終發(fā)展為肺心病和呼吸衰竭慢性疾病。COPD 臨床表現(xiàn)為慢性咳嗽、咳痰、氣短或呼吸困難、喘息和胸悶等癥狀，在中醫(yī)學(xué)中其被歸屬于“喘證”“氣短”“痰飲”“咳嗽”“哮證”“肺脹”等病范疇［3］。其最根本的原因是機(jī)體虛弱、抵抗力低下，尤其是肺脾腎三臟之虛，成為COPD 反復(fù)發(fā)作的核心。利肺片由百部、百合、五味子、枇杷葉、白及、牡蠣、甘草、冬蟲夏草、蛤蚧粉配伍而成。本方為治肺腎兩虛、氣失攝納之咳嗽、咯血、哮喘等癥的常用有效成藥。方中五味子酸溫而潤、上斂肺氣、下滋腎陰，有止咳平喘之效，冬蟲夏草既補(bǔ)腎陽，又益肺陰，且可止血化痰，蛤蚧補(bǔ)肺腎，定喘止嗽，百合甘而微寒，清肺潤肺而止咳，諸藥補(bǔ)肺斂氣、益精血而止血共為主藥；枇杷葉、百部化痰止咳、祛癆殺蟲為輔藥；白及收斂止血，牡蠣收斂固澀為佐藥；甘草補(bǔ)益肺腎、調(diào)和諸藥為使。全方攻補(bǔ)兼施、扶正驅(qū)邪，具有補(bǔ)肺益腎、止咳化痰之功［4］。文獻(xiàn)報道利肺片對COPD 急性發(fā)作期和穩(wěn)定期患者均有一定的治療作用［5］。80 例COPD 急性發(fā)作住院患者口服利肺片輔助治療后，能明顯降低CAT 評分改善患者臨床癥狀、提高動脈血氧分壓和肺功能，具有治療急性發(fā)作期COPD 的作用［6］。辛大永［7］觀察利肺片治療慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期的臨床觀察80 例，治療28 d 后利肺片能明顯改善COPD 穩(wěn)定期患者的咳喘癥狀和肺功能，提高生活質(zhì)量。同時，利肺片有明顯的鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰的作用［8］。由此推測利肺片對COPD有一定的治療作用。

肺功能檢查是診斷COPD 的金指標(biāo)，也是判斷氣流受限的主要客觀指標(biāo)，1 秒用力呼氣容積與用力肺活量比值百分?jǐn)?shù)（FEV1/FVC%）是評價氣流受限和COPD 嚴(yán)重程度的最敏感指標(biāo)，因為大鼠的呼吸頻率比人快，所以本研究選擇FEV0.3/FVC% 來代表FEV1/FVC%。用力最大呼氣流速（PEF）能夠反映氣道有無阻塞。最大呼氣中期流速（MMF）主要取決于用力肺活量非用力部分，該指標(biāo)反應(yīng)小氣道阻塞情況。研究發(fā)現(xiàn)COPD 模型大鼠FEV0.3/FVC%、MMF、PEF 顯著降低，表明該模型大鼠氣道阻力明顯增高，氣流受限，存在阻塞性通氣障礙，而利肺片可顯著升高COPD 模型大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC%、PEF、MMF，使其氣流受限得到改善，具有顯著改善肺功能的作用。

無論在COPD 的發(fā)病起始還是在COPD 的整個病程中，炎癥一直被認(rèn)為是最重要的機(jī)制。有害顆粒物（包括煙霧、細(xì)菌等微生物）進(jìn)入肺內(nèi)激活體內(nèi)的炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，從而釋放出多種炎性介質(zhì)、蛋白酶類（如MMP-9 等）和大量氧自由基和氧化產(chǎn)物（如MDA 等），造成體內(nèi)蛋白酶/抗蛋白酶失衡和氧化/抗氧化失衡，使肺細(xì)胞外基質(zhì)過多破壞降解，彈性纖維斷裂，促進(jìn)肺組織破壞以及氣道的重塑導(dǎo)致氣流受限［9］，從而促進(jìn)COPD 的發(fā)生和發(fā)展［10-11］。本研究中COPD 模型大鼠肺臟灌洗液中炎性細(xì)胞明顯增加，而利肺片能顯著降低COPD 模型大鼠肺臟灌洗液中白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量，具有改善肺組織炎性細(xì)胞浸潤的作用。MDA 是脂質(zhì)過氧化代表產(chǎn)物之一，可反映氧化應(yīng)激的嚴(yán)重程度。SOD 是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑，其氧化活性代表了體內(nèi)抗氧化能力的高低［11-12］。COPD 模型大鼠血清中MDA 水平明顯升高，SOD 活性和NO 水平顯著降低，體內(nèi)氧化/抗氧化明顯失衡，利肺片可顯著升高COPD模型大鼠血清SOD 活性、NO 水平，并下調(diào)模型大鼠血清中MDA 水平，具有明顯的抗氧化作用，對抗COPD 模型大鼠體內(nèi)的氧化/抗氧化失衡。MMP-9 是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類，可增加氣道高反應(yīng)性和組織損傷，促進(jìn)氣道重塑，導(dǎo)致氣流阻塞［13］，利肺片能明顯降低COPD 模型大鼠肺組織中MMP-9 含有量，從而對抗蛋白酶/抗蛋白酶失衡，發(fā)揮治療的作用。

由此可見，利肺片具有較好的改善COPD 肺功能的主要藥效學(xué)作用，其中抗炎、抗氧化、下調(diào)肺組織中MMP-9含量可能是藥物治療COPD 效應(yīng)機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。