任雨賀田 靜劉淑瑩萬茜淋

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130112；3.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林長春 130022；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118）

乳腺癌是影響婦女健康的主要惡性腫瘤，發(fā)病率位居女性惡性腫瘤之首［1］。近年來隨著社會的進(jìn)步，生活方式和生殖觀念的改變以及人群期望壽命延長等諸多因素的影響，我國乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢［2］。MCF-7 是世界上研究最多的人乳腺癌細(xì)胞系，該細(xì)胞系的研究對乳腺癌的研究和患者的預(yù)后極具影響意義［3-4］。人參為五加科植物人參的干燥根，作為我國最常用、最珍貴的傳統(tǒng)中藥材之一，其含有人參皂苷、人參多糖、人參蛋白、揮發(fā)油等多種生物活性成分，在抗腫瘤、抗衰老、抗心律失常、提高免疫力等方面均有很好的功效［5-7］。但目前對人參蛋白質(zhì)的研究多集中在提取和純化上，對其生物活性的研究較少。

已有研究表明，人參蛋白質(zhì)具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抗腫瘤、抗病毒等作用［8］。本實(shí)驗以人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞為研究對象，考察人參總蛋白對MCF-7 細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響，以期為進(jìn)一步研究人參蛋白質(zhì)抗腫瘤的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 倒置熒光顯微鏡（日本Nikon Ri2 公司）；FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；酶標(biāo)儀（德國Tecan公司）；MCO-18AC 二氧化碳培養(yǎng)箱（日本松下公司）；SWCJ-1C 雙人單面超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；ST8R 臺式離心機(jī)（美國Thermo 公司）；真空冷凍干燥機(jī)（日本Eyela 公司）；SC-242D 四度醫(yī)用冷藏箱（青島海爾股份有限公司）；GR60DA 自動立式高壓滅菌鍋（美國Zealway公司）；DK-S26 電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司）；層析柜（北京亞華順達(dá)科技有限公 司）；GZX-9070MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試劑和藥物 人參（吉林省撫松縣3 年生生曬參）經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定符合藥典標(biāo)準(zhǔn)；DMEM 培養(yǎng)基（德國Sigma 公司，批號SLBT5547）；Annexin V/FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，批號20171026）；DAPI 染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C1005）；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C1052）；超級新生牛血清（NBS，中國四季青生物工程材料有限公司，批號20170824）；CCK-8 試劑盒（美國Med chem express 公司，批號06070117）。

1.3 細(xì)胞株 人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞系，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，由本實(shí)驗室傳代凍存。

2 方法

2.1 人參蛋白質(zhì)提取 取3 年生生曬參粗粉15 g，加入Tris-HCl 緩沖液攪拌浸提18 h。離心，取上清液另存。沉淀中繼續(xù)加入Tris-HCl 緩沖液攪拌浸提18 h。離心，取上清液，與第1 次上清液合并，混勻。加入丙酮，-20 ℃下靜止過夜。離心，棄去上清液，下層沉淀揮干丙酮，凍干，即得人參蛋白質(zhì)干粉，其提取率質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.29%。

2.2 細(xì)胞增殖檢測 采用CCK-8 法檢測人參蛋白質(zhì)對MCF-7 細(xì)胞增殖的影響［9］。取對數(shù)生長期的MCF-7 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×104/mL，每孔100 μL 接種于96 孔板內(nèi)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。棄舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 含藥培養(yǎng)基，使藥物質(zhì)量濃度分別為0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL［10-11］，每個質(zhì)量濃度設(shè)5 個復(fù)孔。繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8 溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于酶標(biāo)儀450 nm 波長處測定吸光度，并以下列公式計算人參蛋白質(zhì)對MCF-7 細(xì)胞的抑制率，平行3 次實(shí)驗。抑制率=［（OD不含藥組-OD含藥組）/（OD不含藥組-OD空白組）］×100%。

2.3 細(xì)胞周期檢測 取對數(shù)生長期的MCF-7 細(xì)胞，每孔4×105個細(xì)胞接種于6 孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。棄舊培養(yǎng)基，每孔加入2 mL 含藥培養(yǎng)基，使藥物質(zhì)量濃度分別為0、2.60 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液，胰酶消化，收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS 洗滌，加入預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃固定24 h，預(yù)冷的PBS 洗滌，加入PI 染色液，混勻，37 ℃避光溫浴30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞周期。平行3 次實(shí)驗，計算各周期抑制比率。

2.4 DAPI 染色觀察細(xì)胞形態(tài) 取對數(shù)生長期的MCF-7 細(xì)胞，每孔4×105個接種于6 孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。棄舊培養(yǎng)基，每孔加入2 mL 含藥培養(yǎng)基，使藥物質(zhì)量 濃度分別為 0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PBS 洗滌，加入甲醇-乙酸（甲醇-乙酸=1∶1）固定液固定15 min，棄固定液，加入含0.5% Triton-100 的PBS 打孔15 min，棄PBS，加入DAPI染色液室溫避光染色5 min，PBS 洗滌，于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照。

2.5 細(xì)胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期的MCF-7 細(xì)胞，每孔4×105個接種于6 孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。棄舊培養(yǎng)基，每孔加入2 mL 含藥培養(yǎng)基，使藥物濃度分別為0、2.60 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液，不含EDTA 的胰酶消化，收集細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，并分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光培養(yǎng)15 min，用流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞凋亡情況。平行3 次試驗，計算細(xì)胞凋亡率。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計學(xué)分析取3 次重復(fù)，采用Microsoft Excel 2007 和SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以（）表示，以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 人參蛋白質(zhì)對MCF-7 細(xì)胞增殖的影響 如圖1 所示，人參蛋白質(zhì)對MCF-7 細(xì)胞增殖抑制作用呈時間和濃度依賴性。當(dāng)使用4 mg/mL 人參蛋白質(zhì)處理72 h，抑制率為79.77%。人參蛋白質(zhì)作用MCF-7 細(xì)胞24、48、72 h 的IC50值分別為5.21、2.60、1.11 mg/mL。因?qū)嶒炞畲筚|(zhì)量濃度為4.00 mg/mL，而24 h 的最大抑制率未達(dá)到50%，24 h 的IC50值推斷 為無效。因 此，選用作 用48 h 的IC50值2.60 mg/mL進(jìn)行周期及凋亡實(shí)驗。

圖1 人參蛋白質(zhì)對MCF-7 細(xì)胞增殖的影響（n＝3）

3.2 人參蛋白質(zhì)對MCF-7 細(xì)胞周期的影響 如圖2 所示，與0 mg/mL 人參蛋白質(zhì)組相比，2.60 mg/mL 人參蛋白質(zhì)作用MCF-7 細(xì)胞48 h 后，G1 期細(xì)胞升高（P＜0.05），S 期比例無變化，而G2 期細(xì)胞下降（P＜0.01）。結(jié)果表明，人參蛋白質(zhì)能夠抑制細(xì)胞從G1 期向S 及G2 期轉(zhuǎn)變，將細(xì)胞周期阻滯在G1 期，從而抑制MCF-7 細(xì)胞的增殖。

3.3 人參蛋白質(zhì)對MCF-7 細(xì)胞形態(tài)的影響

3.3.1 常光下觀察MCF-7 細(xì)胞形態(tài) 如圖3 所示，人參蛋白質(zhì)處理MCF-7 細(xì)胞48 h 后，0 mg/mL 人參蛋白質(zhì)組的細(xì)胞生長狀態(tài)良好，形態(tài)完整，大小均一，連接緊密，且密集成片生長；隨著人參蛋白質(zhì)濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量顯著減少，形態(tài)發(fā)生變異，且懸浮細(xì)胞逐漸增多。

圖2 人參蛋白質(zhì)對MCF-7 細(xì)胞周期的影響（n＝3）

3.3.2 DAPI 染色法觀察MCF-7 細(xì)胞凋亡形態(tài) 如圖4 所示，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的人參蛋白質(zhì)溶液處理48 h 后，0 mg/mL人參蛋白質(zhì)組細(xì)胞核比較規(guī)則，染色質(zhì)均勻，邊緣清晰，藍(lán)色熒光弱，略見細(xì)胞核邊緣不規(guī)則的凋亡細(xì)胞。隨著人參蛋白質(zhì)濃度的增加，細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞染色質(zhì)發(fā)生聚集，藍(lán)色熒光增強(qiáng)，細(xì)胞核固縮，并出現(xiàn)藍(lán)色熒光的凋亡小體。

3.4 人參蛋白質(zhì)對MCF-7 細(xì)胞凋亡的影響 如圖5 所示，流式細(xì)胞儀檢測的凋亡散點(diǎn)圖，Q1、Q2、Q3、Q4 分別代表死細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞。與0 mg/mL 人參蛋白質(zhì)組相比，2.60 mg/mL 人參蛋白質(zhì)作用MCF-7 細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞的晚期凋亡及總凋亡比例升高（P＜0.01）。表明，人參蛋白質(zhì)能夠誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞的凋亡。

4 討論

隨著中藥受到越來越多的關(guān)注，從中藥中尋找抗癌活性成分是近年來研究的熱點(diǎn)［12］。中藥治療腫瘤不僅能減輕臨床不良反應(yīng)，還對防治腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、增效減毒等有很好的效果［13］。中藥的抗腫瘤機(jī)制有許多方面，如抑制DNA合成、抑制腫瘤血管形成、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抑制蛋白酪氨酸激酶活性等［14-15］。

圖3 人參蛋白質(zhì)對MCF-7 細(xì)胞形態(tài)的影響

圖4 DAPI 染色觀察人參蛋白對MCF-7 細(xì)胞形態(tài)的影響

圖5 人參蛋白質(zhì)對MCF-7 細(xì)胞凋亡的影響（n＝3）

已有研究表明人參蛋白質(zhì)對人喉癌細(xì)胞Hep-2［16］及白血?。?7］細(xì)胞均具有良好的抑制作用，但其對人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的作用尚未見報導(dǎo)。本研究通過CCK-8 實(shí)驗證明人參蛋白質(zhì)能明顯抑制人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的增殖，且呈一定的時間和濃度依賴性。細(xì)胞周期指的是從上一次細(xì)胞有絲分裂完成至下一次有絲分裂完成的連續(xù)的全過程，調(diào)控細(xì)胞周期可阻止腫瘤細(xì)胞的異常增殖，同時保護(hù)正常細(xì)胞，是腫瘤治療的新思路［18］。本研究通過PI 染色及流式細(xì)胞儀檢測，表明人參蛋白質(zhì)能夠抑制細(xì)胞從G1 期向S 及G2 期轉(zhuǎn)變，將細(xì)胞周期阻滯在G1 期，從而使細(xì)胞停止分裂，抑制MCF-7 細(xì)胞的增殖。

抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡已成為治療腫瘤的基本思路。細(xì)胞凋亡是凋亡調(diào)控基因調(diào)控細(xì)胞主動死亡的過程，具有明顯的形態(tài)學(xué)特征變化［19］。通過DAPI 染色實(shí)驗可見，與0 mg/mL 人參蛋白質(zhì)組相比，2.60 mg/mL人參蛋白質(zhì)組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，且染色質(zhì)發(fā)生固縮，并形成凋亡小體，具有典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征，說明人參蛋白質(zhì)可以促進(jìn)MCF-7 細(xì)胞的凋亡。通過Annexin V-FITC 實(shí)驗及流式細(xì)胞儀檢測，人參蛋白質(zhì)加藥組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組，進(jìn)一步證明人參蛋白質(zhì)能夠誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗表明人參蛋白質(zhì)能夠抑制人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的增殖，將其細(xì)胞周期阻滯在G1 期，并能誘導(dǎo)其細(xì)胞的凋亡。證明人參蛋白質(zhì)對人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤作用，以期為人參蛋白質(zhì)抗腫瘤機(jī)制的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供了可靠的理論依據(jù)。