林 雄，嚴(yán)國鴻，潘旭東，黃 燕，鐘樹仁

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004）

芩黃凝膠劑是在福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院蛇傷救治中心特色制劑“三黃散”（批準(zhǔn)文號閩藥制字Z06106062）的基礎(chǔ)上改進(jìn)而成的水性外用凝膠劑，具有清熱解毒、消炎鎮(zhèn)痛的功效，臨床上用于治療毒蛇咬傷，相較于原藥調(diào)配繁瑣、使用不便、易導(dǎo)致患者疼痛難忍、出現(xiàn)過敏癥狀等弊端，它具有使用舒適方便、藥物作用時間長、對皮膚無刺激作用等優(yōu)點。該方由黃芩、大黃組成，兩者共為君藥，其中前者具有清熱燥濕、涼血安胎、瀉火解毒等功效，主要成分黃芩苷具有抗炎抗菌、抗過敏等作用［1］；后者具有瀉下攻積、清熱瀉火、止血解毒、活血祛瘀等功效，主要成分大黃蒽醌具有解熱鎮(zhèn)痛、抗菌消炎等作用［2］。本實驗在前期研究確定的最佳提取工藝基礎(chǔ)上，采用正交試驗結(jié)合多指標(biāo)綜合評分優(yōu)化芩黃凝膠劑精制工藝，為該制劑最佳制備工藝的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

Dionex Ultimate 3000 高效液相色譜儀（美國戴安公司）；CPA225D 電子天平（十萬分之一，德國賽多利斯公司）；KQ-500DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZT-5 L 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海增森儀器科技有限公司）。

大黃素、大黃酸、大黃酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為 110756-201512、110757-201607、110796-201621）；蘆薈大黃素、大黃素甲醚、黃芩苷對照品（美國CATO 標(biāo)準(zhǔn)品，批號分別為CE-11-16、CE-11-17、CE-11-15）。大黃（安徽協(xié)和成藥業(yè)飲品有限公司，產(chǎn)地甘肅，批號17113015）、黃芩（亳州市瀘譙藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地山西，批號1709100132）經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院鄢英慧副主任中藥師鑒定為正品，符合2015 版《中國藥典》 一部項下要求。殼聚糖（黏度200～400 mPa·s，上海麥克林生化科技有限公司）。甲醇為色譜純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其余試劑均為分析純；水為經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾的純化水。

2 方法與結(jié)果

依據(jù)前期實驗結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)［3-10］確定藥液醇沉和殼聚糖澄清正交試驗設(shè)計方案，以黃芩中黃芩苷和大黃中蒽醌類成分（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚）轉(zhuǎn)移率為評價指標(biāo)，采用多指標(biāo)綜合評分進(jìn)行考察，確定黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的權(quán)重系數(shù)分別為0.5、0.1、0.1、0.1、0.1、0.1。

2.1 正交試驗

2.1.1 提取液制備 稱取處方量藥材，加6 倍量水浸泡0.5 h后回流提取2 次，每次1.5 h，濾過，合并濾液，即得，減壓濃縮備用。

2.1.2 醇沉工藝設(shè)計 選用L9（34）正交表，以醇沉體積分?jǐn)?shù)、藥液質(zhì)量濃度、靜置時間、攪拌速度為影響因素，每個因素3 個水平，見表1。

2.1.3 澄清工藝設(shè)計 選用L9（34）正交表，以藥液質(zhì)量濃度、1%殼聚糖加入量、沉淀溫度、靜置時間為影響因素，每個因素3 個水平，見表2。

表1 醇沉工藝因素水平

表2 澄清工藝因素水平

2.2 黃芩苷含有量測定

2.2.1 色譜條件 Amethyst C18-H 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.1%磷酸（57∶43）；檢測波長280 nm；柱溫50 ℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密稱取黃芩苷對照品適量，置于100 mL 量瓶中，甲醇定容至1.064 mg/mL，精密吸取5 mL置于25 mL 量瓶中，甲醇定容至212.80 μg/mL，精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 mL 置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，在“2.2.1”項色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定。以黃芩苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y=0.629 1X-2.378（r=0.999 8），在10.64～212.80 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 供試品溶液制備 分別按醇沉、澄清工藝制得藥液后各精密吸取1.0 mL，稀釋至100 mL，再精密吸取1.0 mL，甲醇定容至10 mL，超聲30 min，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液制備 取缺黃芩處方量藥材，按“2.2.3”項下方法制備，即得。

2.2.5 重復(fù)性試驗 精密吸取同一精制藥液1 mL，平行6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣各10 μL 測定，測得黃芩苷峰面積RSD為2.45%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗 精密吸取含有量已知的精制藥液0.5 mL，精密加入10.0 mL 貯備液，按“2.2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，黃芩苷平均加樣回收率為101.2%，RSD 為1.97%。

2.2.7 專屬性考察 精密吸取供試品溶液10 μL，在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1，可知陰性無干擾，方法專屬性良好。

2.3 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含有量測定

2.3.1 色譜條件 Amethyst C18-H 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.1%磷酸（85∶15）；檢測波長430 nm；柱溫40 ℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

圖1 黃芩苷HPLC 色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，置于50 mL 棕色量瓶中，甲醇定容，制得質(zhì)量濃度分別為202.20、204.00、211.20、395.20、201.00 μg/mL 的貯備液，精密吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、5.0 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容，在“2.3.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程分別為蘆薈大黃素Y=0.475 1X-0.046 7（r=0.999 9），線性范圍2.022～101.1 μg/mL；大黃酸Y=0.470 2X-1.188 4（r=0.999 4），線性范 圍2.040～102.0 μg/mL；大黃素Y=0.435 2X-0.014 1（r=0.999 9），線性范圍2.112～105.6 μg/mL；大黃酚Y=0.491 1X+0.006 6（r=0.999 9），線性范圍3.952～197.6 μg/mL；大黃素甲醚Y=0.411 9X+0.288 9（r=0.999 4），線性范圍2.010～100.5 μg/mL。

2.3.3 供試品溶液制備 精密吸取精制藥液1.0 mL，加入8%鹽酸、三氯甲烷各10 mL，回流提取1 h，放冷，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，少量三氯甲烷洗滌容器，洗滌液并入分液漏斗中，取三氯甲烷層，剩余藥液再用三氯甲烷萃取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，揮干溶劑，殘渣加適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，甲醇定容，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性對照溶液制備 稱取缺大黃處方量藥材，按“2.3.3”項下方法制備，即得。

2.3.5 重復(fù)性試驗 精密吸取同一精制藥液1.0 mL，平行6 份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積RSD 分別為1.59%、1.14%、1.93%、1.65%、1.86%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密吸取含有量已知的精制藥液1 mL，平行6 份，精密加入對照品溶液 ［蘆薈大黃素（203.50 μg/mL）0.8 mL、大黃酸（217.15 μg/mL）1.1 mL、大黃素（204.2 μg/mL）0.9 mL、大黃酚（385.56 μg/mL）0.9 mL、大黃素甲醚（200.44 μg/mL）0.4 mL］，按“2.3.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚平均加樣回收率分別為101.2%（RSD=1.95%）、100.6%（RSD=1.97%）、101.2%（RSD=2.11%）、99.9%（RSD=1.60%）、98.7%（RSD=2.37%）。

2.3.7 專屬性考察 精密吸取供試品溶液10 μL，在“2.3.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，每個樣品平行2 次，色譜圖見圖2，可知陰性無干擾，方法專屬性良好。

圖2 大黃蒽醌HPLC 色譜圖

2.4 試驗結(jié)果 通過多指標(biāo)綜合加權(quán)評分法（權(quán)重系數(shù)同上）進(jìn)行直觀分析和方差分析，綜合評分（X）［11］計算公式為X=0.5a+0.1b+0.1c+0.1d+0.1e+0.1f，其中a=黃芩苷轉(zhuǎn)移率/最大值×100、b=蘆薈大黃素轉(zhuǎn)移率/最大值×100、c=大黃酸轉(zhuǎn)移率/最大值×100、d=大黃素轉(zhuǎn)移率/最大值×100、e=大黃酚轉(zhuǎn)移率/最大值×100、f=大黃素甲醚轉(zhuǎn)移率/最大值×100。結(jié)果見表3～6。

表3 醇沉工藝正交試驗結(jié)果

表4 醇沉工藝方差分析

表5 澄清工藝正交試驗結(jié)果

表6 澄清工藝方差分析

由此可知，醇沉工藝中各因素影響程度依次為A（醇沉體積分?jǐn)?shù)）＞B（藥液質(zhì)量濃度）＞D（攪拌速度）＞C（靜置時間），其中A、B、D有顯著影響（P＜0.05），而C無顯著影響（P＞0.05），最佳條件為A1B1C2D3，即醇沉體積分?jǐn)?shù)50%，藥液質(zhì)量濃度0.8 g/mL，靜置時間48 h，攪拌速度180 r/min。澄清工藝中各因素影響程度依次為A（藥液質(zhì)量濃度）＞B（1% 殼聚糖加入量）＞C（沉淀溫度）＞D（靜置時間），其中A有顯著影響（P＜0.05），而B、C、D無顯著影響（P＞0.05），最佳條件為A1B1C1D1，即藥液質(zhì)量濃度0.25 g/mL，1%殼聚糖加入量10%，沉淀溫度40 ℃，靜置時間24 h。

2.5 驗證試驗 分別按最佳醇沉、澄清工藝進(jìn)行3 批驗證試驗，結(jié)果見表7～8，可知該方法穩(wěn)定可靠。

表7 醇沉工藝驗證試驗結(jié)果（n ＝3）

表8 澄清工藝驗證試驗結(jié)果（n＝3）

3 討論

在檢測大黃蒽醌［12］過程中發(fā)現(xiàn)，檢測波長254 nm 下采用等度梯度或梯度洗脫時，待測成分與干擾成分均無法實現(xiàn)良好分離，這是因為該類成分在254、430 nm 波長下均有最大吸收［13］。經(jīng)研究顯示，色譜條件為流動相甲醇-0.1%磷酸（85∶15）、檢測波長430 nm、柱溫40 ℃時，待測成分分離效果最理想。

芩黃凝膠劑為多種成分組成的中藥復(fù)方制劑，由黃芩、大黃組成，兩者配伍相須相使，共為君藥，故選擇其主要有效成分作為待測指標(biāo)，但若僅單獨選擇黃芩苷或大黃蒽醌作為檢測指標(biāo)，則無法全面評價工藝。因此，本實驗采用正交試驗結(jié)合多指標(biāo)綜合評分，既能更準(zhǔn)確反應(yīng)工藝優(yōu)劣，又可有效減少工作量，綜合考慮黃芩、大黃在制劑處方中的用量和作用，將黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚權(quán)重系數(shù)分別設(shè)定為0.5、0.1、0.1、0.1、0.1、0.1，更加合理可行。同時，本實驗選擇黃芩苷、大黃蒽醌轉(zhuǎn)移率而非其含有量作為評價指標(biāo)，能更客觀地體現(xiàn)精制工藝在芩黃凝膠劑制備過程中所發(fā)揮的作用，有利于該制劑內(nèi)在質(zhì)量控制。