俞 婷劉新娟劉 力高 崎

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021；3.上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司，上海 201703）

荊銀顆粒是由荊芥、金銀花、四季青、魚腥草、大青葉、蒲公英、牛蒡子、防風(fēng)、甘草9 味藥組成，多為解表藥，具有解毒、鎮(zhèn)痛、抗炎的作用［1-5］。研究［6］表明，該處方體內(nèi)外均具有良好的抗病毒作用，如RSV（RNA 病毒）、ADV3（DNA 病毒）。方中荊芥、金銀花為君藥；四季青、魚腥草、大青葉為臣藥；蒲公英、牛蒡子、防風(fēng)為佐藥；甘草為使藥，調(diào)和諸藥。荊芥為唇形科荊芥屬植物荊芥Schizonepeta tenuifolia Briq 的干燥地上部分，又稱假蘇，始記于《神農(nóng)本草經(jīng)》 被列為中品［7］。該藥物中含有多種揮發(fā)油成分及黃酮類成分，主要具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗過敏的藥理作用［8］。金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬Lonicera japonica Thunb 的干燥花蕾或初開的花。金銀花一名出自《本草綱目》，其富含揮發(fā)油、黃酮和有機酸類成分［9-10］，自古具有清熱解毒作用，在荊銀顆粒中與荊芥同為君藥，增強抗病毒作用［11-12］。

冠狀病毒感染引起的肺炎是由病毒感染引起，與流感的起因及癥狀極其相似。荊銀顆粒作為抗非典型性肺炎的處方，方中藥物較多，成分復(fù)雜，而現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)適用于多成分多靶點的中藥、方劑機制研究，如杜葉青等［13］應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理的方法對金銀花的抗炎作用機制進行預(yù)測研究；袁岸等［14］采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測荊芥的抗炎作用；朱梓銘等［15］通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探究了苓桂術(shù)甘湯治療慢性心力衰竭的作用機制。荊銀顆粒具有較強的抗病毒作用，但其作用機制尚不明確，因此本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究荊銀顆?？共《镜闹饕饔脵C制，為今后荊銀顆粒用于臨床預(yù)防治療冠狀病毒感染引起的肺炎提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 荊銀顆?；钚猿煞趾统煞职悬c的收集 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和中藥分子機制生物信息學(xué)分析工具BATMANTCM 數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）搜索荊銀顆粒9 味藥的所有化學(xué)成分，以吸收、分布、代謝、排泄（ADME）參數(shù)中的口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和藥物相似性（Drug-likeness，DL）≥0.18 為篩選條件，得到荊銀顆粒的活性成分。同時在TCMSP 和BATMAN-TCM 中查詢得到活性成分所對應(yīng)靶點，并在UniProt 數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的基因名（Gene names）。

1.2 流感疾病靶點獲取 應(yīng)用 Drugbank 數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/ ）和 DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/），輸入關(guān)鍵詞“Influenza”查詢得到流感相關(guān)靶點。將活性成分作用靶點與流感相關(guān)靶點取交集，得到荊銀顆?；钚猿煞挚共《镜年P(guān)鍵靶點。

1.3 “活性成分-關(guān)鍵靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 活性成分與關(guān)鍵靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0 軟件，構(gòu)建“活性成分-關(guān)鍵靶點”網(wǎng)絡(luò)，并應(yīng)用Cytoscape 中“Network Analyzer”功能進行網(wǎng)絡(luò)分析，根據(jù)Degree 值篩選荊銀顆?？共《镜闹匾煞帧?/p>

1.4 關(guān)鍵靶點蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將關(guān)鍵靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，設(shè)定置信度≥0.9，得到的文本數(shù)據(jù)，整理后導(dǎo)入Cytoscape3.6.0 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，并應(yīng)用“Network Analyzer”功能進行網(wǎng)絡(luò)拓撲指標(biāo)分析，篩選Degree 值高于平均值的重要靶點。

1.5 生物功能和通路分析 應(yīng)用Cytoscape 3.6.0 軟件中的ClueGO 插件對關(guān)鍵靶點進行GO 生物功能注釋和KEGG 通路分析，設(shè)置P≤0.05。

1.6 分子對接驗證 Swiss Dock 在線分子對接軟件，可以用來預(yù)測一個目標(biāo)蛋白和一個小分子之間可能發(fā)生的分子相互作用。根據(jù)“活性成分-關(guān)鍵靶點”網(wǎng)絡(luò)中重要的成分和PPI 網(wǎng)絡(luò)中重要的靶蛋白，應(yīng)用Swiss Dock 進行分子對接驗證，用以評價活性成分與關(guān)鍵靶點之間的對接效果。

2 結(jié)果

2.1 荊銀顆粒藥物與疾病相關(guān)基因 從TCMSP 中獲取荊銀顆粒8 味藥（除蒲公英）174 種活性成分，在BATMANTCM 獲取蒲公英的8 種活性成分（表1），刪去重復(fù)共得到荊銀顆粒9 味藥160 種活性成分，并且獲得活性成分324個作用靶點。獲得流感相關(guān)靶點621 個，通過Venn 圖刪去重復(fù)項得到73 個關(guān)鍵靶點（圖1）。

表1 荊銀顆粒9 味藥160 種活性成分

圖1 活性成分-關(guān)鍵靶點和流感靶點Venn 圖

2.2 “活性成分-關(guān)鍵靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將9 味中藥對應(yīng)的160 種活性成分與73 個靶點在Cytoscape 3.6.0 軟件中構(gòu)建荊銀顆?？共《镜摹盎钚猿煞?關(guān)鍵靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。網(wǎng)絡(luò)中共涉及176 個節(jié)點和422 條邊，其中圓形代表活性成分，菱形代表關(guān)鍵靶點。成分進行度值（Degree）評價，篩選重要成分共17 種，分別是槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、山柰酚、柚皮素等，Degree 值較高的成分可能是荊銀顆?？共《镜年P(guān)鍵成分（表2）。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將73 個關(guān)鍵靶蛋白導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，設(shè)定置信度≥0.9，在Cytoscape軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖3），該網(wǎng)絡(luò)共涉及61 個節(jié)點和237條邊，節(jié)點表示靶點，邊表示蛋白與蛋白之間相互作用，節(jié)點大小與顏色表示Degree 值大小，Degree 值由小到大，則節(jié)點從小到大。共有27 個靶蛋白Degree 值高于平均值（表3），其中RELA、JUN、IL6、MAPK1、MAPK3 等靶點蛋白Degree 值較大，表明與其他蛋白相互作用較強，因此這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用。

圖2 活性成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表2 荊銀顆?？共《局?7 種活性成分

圖3 73 個關(guān)鍵靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4 生物功能和通路分析 在Cytoscape 3.6.0 軟件中應(yīng)用ClueGO 插件對73 個關(guān)鍵靶點進行GO 生物功能注釋和KEGG 通路分析，設(shè)置P≤0.05，得到可視化分析餅狀圖（圖4～5），73 個靶點主要富集在脂多糖反應(yīng)（response to lipapolysaccharide）、趨向化正向調(diào)節(jié)（positive regulation of chemotaxis）、對紫外線的反應(yīng)（response to UV）、單核細胞遷移調(diào) 節(jié)（regulation of mononuclear cell migration）、JAK-STAT級聯(lián)反應(yīng)（JAK-STAT cascade）等生物過程。

KEGG 通路圖表明荊銀顆?？共《镜淖钪饕饔猛肥前准毎樗?17 信號通路（IL-17 signaling pathway），同時還包括甲狀腺激素合成（thyroid homone synthesis）、肌萎縮側(cè)索硬化癥［amyotrophic lateral sclerosis（ALS）］、細胞凋亡（apoptosis）、B 細胞受體信號通路（B cell receptor signaling pathway）等。

表3 Degree 值高于平均值的27 個靶蛋白

2.5 分子對接驗證 選擇荊銀顆粒成分中含有量較高的木犀草素和靛玉紅，以及指標(biāo)性測定成分原兒茶醛，與PPI網(wǎng)絡(luò)中的前2 個關(guān)鍵靶點RELA 和JUN，在PDB 數(shù)據(jù)庫下載靶點晶體結(jié)構(gòu)文件，用Pymol 軟件移去水分子和配體分子。在Swiss Dock 在線軟件分別上傳靶蛋白和木犀草素、靛玉紅以及原兒茶醛的結(jié)構(gòu)文件。分子對接結(jié)果見表4，蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合越緊密，F(xiàn)ull Fitness 值越低。結(jié)果表明3個成分與兩個靶蛋白都可對接（圖6～11），其中RELA 與木犀草素、JUN 與靛玉紅、JUN 與原兒茶醛對接效果最好。

表4 分子對接結(jié)果

3 討論

荊銀顆粒作為治療感冒和急性肺炎、支氣管周圍炎（屬風(fēng)熱犯肺證）的常規(guī)制劑，藥理研究已證明在抗病毒方面有顯著的作用，因此利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究荊銀顆?？共《咀饔脵C制具有重要意義。

圖4 關(guān)鍵靶點GO 生物功能注釋

圖5 KEGG 通路分析

圖6 RELA-木犀草素分子對接

PPI 網(wǎng)絡(luò)表明荊銀顆粒多靶點抗病毒的作用特點，網(wǎng)絡(luò)中共有73 個關(guān)鍵靶點，其中RELA、JUN、IL6、MAPK1、MAPK3 等27 個靶點作用較強。RELA 作用于NF-κB 信號通路。NF-κB 蛋白家族有5 個成員，在正常狀態(tài)下，NF-κB沒有轉(zhuǎn)錄活性，以三聚體的形式存在于細胞質(zhì)中，NF-κB p65 是NF-κB 蛋白家族的成員之一，參與機體內(nèi)炎癥反應(yīng)［16］。Li 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，1，8-Cineol 通過減弱小鼠肺部炎癥反應(yīng)來增強對IFV 感染的保護，1，8-Cineol 降低了NF-κB p65、細胞間黏附分子（ICAM）-1 和血管細胞黏附分子（VCAM）-1 在肺組織中的表達，從而預(yù)防流感病毒引起的小鼠肺炎。Yang 等［18］在研究鵝掌楸堿調(diào)節(jié)肺部炎癥的機制中，通過Western blot 檢測NF-κB p65 的磷酸化水平和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，得出鵝掌楸堿治療顯著抑制了肺中VEGF 的表達和NF-κB 的活化。這些研究結(jié)果均說明，NF-κB p65 參與肺炎發(fā)生過程。JUN 作用于AP-1（c-JUN）信號通路上［19］。2003 年一種新型冠狀病毒從非典型肺炎患者身上分離出來，被證明是現(xiàn)在稱為嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥（SARS）的病原體。利用病理檢測系統(tǒng)研究了AP-1 通路被SARS-CoV N 蛋白激活，因此SARS冠狀病毒核衣殼蛋白與AP-1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，通過激活A(yù)P-1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來調(diào)節(jié)完整的信號傳導(dǎo)［20］。SARS 冠狀病毒的8 個附屬蛋白可能參與了病毒的發(fā)病過程，其中蛋白3b 定位于細胞核，并研究了3b 對AP-1 轉(zhuǎn)錄活性的影響。研究闡明了在3b 轉(zhuǎn)染的Huh7 細胞中AP-1 依賴性基因表達的增強，報告基因和移動性轉(zhuǎn)移檢測顯示，在3b 存在的情況下，AP-1 轉(zhuǎn)錄和DNA 結(jié)合活性增加［21］。

圖7 RELA-靛玉紅分子對接

圖8 RELA-原兒茶醛分子對接

圖9 JUN-木犀草素分子對接

圖10 JUN-靛玉紅分子對接

KEGG 信號通路分析中IL-17 信號通路為主要作用的信號傳導(dǎo)通路。在對多種冠狀病毒研究中，IL-17 信號通路占據(jù)重要地位，例如SARS 病毒誘導(dǎo)了模式識別受體和IL-17通路的激活［22］。另外中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERSCoV）被認為是一種感染呼吸道的高致病性病毒，具有很高的發(fā)病率和死亡率，動物模型研究表明MERS-CoV 感染可引起強烈的炎癥反應(yīng)，藥物治療后可相對抑制TNF-α、IL-15、IL-17 等炎癥因子［23］。這些研究均與KEGG 分析結(jié)果一致。

圖11 JUN-原兒茶醛分子對接

自2019 年底，起源于武漢的新型肺炎席卷全國，大量信息表明，該肺炎是一種新型冠狀病毒感染所致。冠狀病毒在系統(tǒng)分類上屬冠狀病毒科冠狀病毒屬。冠狀病毒屬的病毒是具外套膜的正鏈單股RNA 病毒，存活力較強，在適宜環(huán)境可存活5 d，且其潛伏期最長可達14 d，該病毒主要通過口液、噴嚏、接觸傳染，并通過空氣飛沫傳播，因此其危害性和傳染性較大。已有研究發(fā)現(xiàn)新型肺炎從輕癥向重癥發(fā)展的時間比較長，因此發(fā)病早期是進行抗病毒治療的關(guān)鍵時期。雖然目前缺乏完全被證明有效的抗病毒治療手段，但針對發(fā)燒、乏力等癥狀，中藥的注射劑、解熱鎮(zhèn)痛的藥物都能發(fā)揮重要作用。

荊銀顆粒是由多種解表藥組成，且具有抗病毒、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛等臨床作用，且方中藥物藥性緩和，適用于新型肺炎輕癥時間長的特點。張霞等［24］采用MA-104 細胞感染模型，以利巴韋林為陽性對照藥，檢測到荊芥穗水溶性部位體外抗病毒活性最強。湯奇等［25］觀察并證實了荊芥揮發(fā)油對雞胚內(nèi)和小鼠體內(nèi)的流感病毒有預(yù)防和治療作用。陳智［26］實驗根據(jù)細胞病變效應(yīng)法（CPEF 法）結(jié)合CCK-8染色法檢測細胞存活率，驗證了金銀花對于用呼吸道合胞病毒（RSV），柯薩奇病毒B3、B5（COXB3、COXB5），腸道病毒71 型（EV71）4 種病毒感染的人喉癌上皮細胞（Hep2）均有抑制作用。同時本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明荊銀顆粒多種成分對多種病毒有預(yù)防或治療作用，因此荊銀顆粒對新型冠狀病毒感染的肺炎可以起到一定的預(yù)防和治療作用，對臨床給藥提供可靠性依據(jù)。