梁子聰王 恒?胡建山胡先運(yùn)

（1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，貴州 都勻 558000；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，貴州都勻 558000；3.貴州醫(yī)科大學(xué)天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 510014）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種累及膝關(guān)節(jié)滑膜、軟骨、軟骨下骨及關(guān)節(jié)周?chē)M織的慢性退行性病變，引起老年人膝關(guān)節(jié)疼痛、畸形及功能障礙的常見(jiàn)疾?。?］。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）與KOA發(fā)病關(guān)系密切，能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的NO，抑制軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)和合成Ⅱ型膠原（CollagenⅡ），加速了膝關(guān)節(jié)的破壞，最終導(dǎo)致KOA 的發(fā)生［2-3］。前期研究［4］顯示，鹿角壯骨膠囊能改善KOA 患者的臨床癥狀，獲得較好的效果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立木瓜蛋白酶誘導(dǎo)兔KOA 模型，觀(guān)察鹿角壯骨膠囊對(duì)關(guān)節(jié)軟骨中iNOS 和CollagenⅡ表達(dá)的影響，進(jìn)一步了解其對(duì)KOA 的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 儀器 JA10002 型電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；DDIL-5 型恒溫箱（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；ASP300S 型全封閉式組織脫水機(jī)、RM2265 型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、HI1210 型攤片機(jī)、DM750 型光學(xué)顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）。

1.2 藥物與試劑 鹿角壯骨膠囊由黔南州中醫(yī)醫(yī)院制劑科提供（批號(hào)黔藥制2013003，規(guī)格0.45 g/粒）、木瓜蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司，G8430）；甲苯胺藍(lán)染液（北京雷根生物科技有限公司，DA0059）；封閉液（武漢博士德生物工程有限公司）；iNOS、CollagenⅡ多克隆抗體（北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司，MD4695、MD4781）。通用型SP 試劑盒、DAB 顯色盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SP-9000，ZLI-9017）；4%多聚甲醛、二甲苯、乙醇、乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）脫鈣液由黔南州人民醫(yī)院病理科提供，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 動(dòng)物 普通級(jí)四月齡日本長(zhǎng)耳白兔24 只，雌性，體質(zhì)量（2.0±0.5）kg，由長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2014-0010。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，分籠飼養(yǎng)，不限制飲食。

2 方法

2.1 造模 24 只兔隨機(jī)分為正常組、模型組、給藥組（鹿角壯骨膠囊），每組8 只。按3.5 mL/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，待完全麻醉后，剪刀于右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)附近備皮，顯露皮膚，碘伏、75%酒精棉簽反復(fù)消毒。1 mL 注射器抽取提前配制的4%木瓜蛋白酶溶液0.5 mL，微微彎曲膝關(guān)節(jié)，針尖分別在模型組與給藥組兔內(nèi)側(cè)膝眼進(jìn)針，回抽確定進(jìn)入關(guān)節(jié)腔后，緩慢注射，棉簽輕壓針眼，避免溶液溢出。正常組同法注射等體積滅菌注射用水。各組被動(dòng)屈伸右側(cè)膝關(guān)節(jié)20 次，促進(jìn)溶液在關(guān)節(jié)腔內(nèi)均勻擴(kuò)散。間隔3 d 重復(fù)1次，共注射3 次。末次注射后，各組兔每天驅(qū)趕運(yùn)動(dòng)30 min，其余時(shí)間籠內(nèi)自由活動(dòng)。

2.2 給藥 首次注射后第2 周，給藥組給予鹿角壯骨膠囊藥粉0.3 g/kg（參照成人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等效劑量［5］換算而得），稱(chēng)取體質(zhì)量的相應(yīng)劑量，用蒸餾水稀釋成10 mL 后灌胃，1 次/d，連續(xù)給藥4周。其他組給予10 mL 蒸餾水灌胃。

2.3 動(dòng)物取材 末次給藥第2 天，麻醉處死所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。切開(kāi)關(guān)節(jié)囊，取下膝關(guān)節(jié)及滑膜組織標(biāo)本，置于4%多聚甲醛中固定。

2.4 兔膝關(guān)節(jié)軟骨甲苯胺藍(lán)染色 甲苯胺藍(lán)染色，將石蠟切片入二甲苯2 次，15 min/次，梯度酒精（100% 1 min，90% 1 min，85% 1 min，75%1 min），自來(lái)水沖洗2 min，甲苯胺藍(lán)染料浸染15 min，自來(lái)水再次沖洗2 min，丙酮分化至軟骨細(xì)胞清晰可見(jiàn)，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

2.5 國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(huì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織病理學(xué)評(píng)估系統(tǒng)（Osteoarthritis Research Society International Osteoarthritis Cartilage Histopathology Assessment System，OOCHAS）評(píng)分 參考文獻(xiàn)［6］方法，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)切片進(jìn)行OOCHAS 評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1～3。每個(gè)樣本取3 次評(píng)分的平均值。

2.6 檢測(cè)兔膝關(guān)節(jié)iNOS 和CollagenⅡ表達(dá) 采用免疫組化檢測(cè)。石蠟切片經(jīng)60 ℃烘片1 h，入二甲苯脫蠟2 次，10 min/次、梯度酒精（100% 3 min，90% 3 min，85% 3 min，75% 3 min，蒸餾水3 min，PBS 3 min）。將切片置于 pH=6.0，0.1 mol/L枸櫞酸液修復(fù)液中，用微波爐100 火力3 min至微微沸騰，再用50 火力維持7 min，停止加熱后自然冷卻20～30 min。用PBS 漂洗3 次，5 min/次。3% H2O2孵育10 min 以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。PBS 沖洗3 次，5 min/次。滴加封閉液（5% BSA），在濕盒中室溫30 min。用濾紙擦去封閉液，滴加適宜濃度的一抗置濕盒中4 ℃孵膠封片。光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察并攝片保存，每張組織切片在相同部位攝取3 個(gè)視野（×400）。運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0 專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析，計(jì)算相同面積內(nèi)相關(guān)指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值（平均光密度值=光密度值/測(cè)量面積）。

表1 OOCHAS-分級(jí)Tab.1 OOCHAS-grading

表2 OOCHAS-分期Tab.2 OOCHAS-staging

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Shapiro-Wilk 法作正態(tài)檢測(cè)，Levene 法作方差檢測(cè)。計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。等級(jí)資料比較采用Ridit 分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。育過(guò)夜（iNOS 為1∶200，CollagenⅡ?yàn)?∶150），再用PBS 沖洗3 次，5 min/次，洗去一抗，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS。滴加生物素化二抗工作液，室溫置濕盒中孵育20 min，用PBS 沖洗3 次，5 min/次，洗去二抗，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫置濕盒中孵育20 min，用PBS 沖洗3 次，5 min/次，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS。DAB 顯色劑顯色，自來(lái)水充分沖洗。再進(jìn)行蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)

表3 OOCHAS-評(píng)分（分）Tab.3 OOCHAS-scoring（scores）

3 結(jié)果

3.1 各組兔膝關(guān)節(jié)鏡下病理觀(guān)察及OOCHAS 評(píng)分 正常組兔膝關(guān)節(jié)面完整，軟骨不受累，軟骨基質(zhì)未見(jiàn)腫脹及纖維化，軟骨細(xì)胞正常，排列整齊（圖1A～1B）；模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨表面糜爛、缺損，病損廣泛，關(guān)節(jié)面邊緣見(jiàn)骨贅形成，關(guān)節(jié)面缺損處見(jiàn)纖維組織修復(fù)、骨質(zhì)重建，軟骨細(xì)胞、纖維細(xì)胞增生（圖1C～1D）；給藥組兔膝關(guān)節(jié)軟骨表面不連續(xù)，部分關(guān)節(jié)面軟骨出現(xiàn)垂直裂隙，較嚴(yán)重者可見(jiàn)糜爛，病損范圍較模型組輕，下2/3 軟骨基質(zhì)染色變淺，部分見(jiàn)軟骨基質(zhì)內(nèi)見(jiàn)囊腫形成，軟骨細(xì)胞腫脹、壞死（圖1E～1F）。與正常組比較，模型組OOCHAS 分級(jí)和分期的R值、評(píng)分總分升高（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組OOCHAS 評(píng)分總分降低（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組兔膝關(guān)節(jié)OOCHAS 評(píng)分（，n＝8）Tab.4 Rabbit knee joint OOCHAS scores in various groups（，n＝8）

表4 各組兔膝關(guān)節(jié)OOCHAS 評(píng)分（，n＝8）Tab.4 Rabbit knee joint OOCHAS scores in various groups（，n＝8）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

圖1 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨鏡下病理形態(tài)觀(guān)察（甲苯胺藍(lán)染色）Fig.1 Pathological changes of rabbit knee articular cartilage in various groups（toluidine blue staining）

3.2 各組兔膝關(guān)節(jié)iNOS 和CollagenⅡ表達(dá) 與正常組比較，模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨iNOS 的表達(dá)升高，而CollagenⅡ的表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組iNOS 的表達(dá)降低，而CollagenⅡ的表達(dá)升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表5。

表5 各組兔膝關(guān)節(jié)iNOS 和CollagenⅡ表達(dá)（，n＝8）Tab.5 Expressions of iNOS and CollagenⅡin rabbit knee joints of various groups（，n＝8）

表5 各組兔膝關(guān)節(jié)iNOS 和CollagenⅡ表達(dá)（，n＝8）Tab.5 Expressions of iNOS and CollagenⅡin rabbit knee joints of various groups（，n＝8）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

4 討論

KOA 發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚不清楚。但其病理改變包括滑膜細(xì)胞增生、慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，均與炎癥因子作用密切相關(guān)［7］。一氧化氮合酶分 成3 型，包 括nNOS、eNOS、iNOS，其 中iNOS 與KOA 的發(fā)病關(guān)系最密切［8］。iNOS 在IL-1等炎癥因子作用下，刺激滑膜細(xì)胞分泌PGE2和COX-2，加快關(guān)節(jié)軟骨的破壞；同時(shí)亦可加快滑膜成纖維細(xì)胞增殖，導(dǎo)致滑膜組織纖維化［9］。iNOS還可合成大量的 NO，產(chǎn)生氧自由基，促進(jìn)CollagenⅡ、Ⅲ及基質(zhì)蛋白多糖、層粘連蛋白等多種基質(zhì)蛋白的降解，抑制軟骨基質(zhì)的修復(fù)［10］。CollagenⅡ是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)膠原的主要成分（約占膠原總含有量90%以上），其主要作用是維持軟骨結(jié)構(gòu)及功能的完整性［11］。當(dāng)軟骨中CollagenⅡ表達(dá)減少或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到破壞時(shí)，可導(dǎo)致軟骨基質(zhì)分泌減少及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，從而改變了軟骨細(xì)胞生存的微環(huán)境，加速軟骨細(xì)胞的凋亡［12］。

圖2 各組兔膝關(guān)節(jié)iNOS 和CollagenⅡ表達(dá)（IHC，×100）Fig.2 Expressions of iNOS and CollagenⅡin rabbit knee joints of various groups（IHC，×100）

OA 屬中醫(yī)學(xué)中“痹癥”范疇，因此膝骨關(guān)節(jié)炎可稱(chēng)膝痹。膝骨關(guān)節(jié)炎可致膝關(guān)節(jié)腫脹、畸形，形似白鶴的膝關(guān)節(jié)，故又可稱(chēng)為鶴膝風(fēng)［13］。中醫(yī)認(rèn)為本病因年老體衰、肝腎之氣耗竭，不能濡養(yǎng)肌肉及骨髓，導(dǎo)致肌肉萎縮、關(guān)節(jié)活動(dòng)不利而發(fā)?。?4］。治則為滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋壯骨。鹿角壯骨膠囊以鹿角膠為君藥，主歸肝、腎經(jīng)，起到補(bǔ)腎強(qiáng)骨功效。臣以骨碎補(bǔ)、熟大黃、黃芪、當(dāng)歸增強(qiáng)君藥補(bǔ)益肝腎之功，佐以血竭、炒土鱉、鍛自然銅、白術(shù)、川芎等多味中藥共湊活血通經(jīng)、緩急止痛之功。鹿角膠、骨碎補(bǔ)、熟地黃等現(xiàn)代藥理學(xué)研究［15-16］顯示，鹿角膠含藥血清能顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞CollagenⅡ的表達(dá)，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)修復(fù)；而骨碎總黃酮可降低軟骨中iNOS 的表達(dá)，減輕炎癥細(xì)胞因子對(duì)膝關(guān)節(jié)的破壞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，給藥組OOCHAS 評(píng)分總分明顯降低（P＜0.05），iNOS 的表達(dá)明顯降低而CollagenⅡ的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），說(shuō)明鹿角壯骨膠囊可通過(guò)降低軟骨中iNOS 的表達(dá)，減輕對(duì)Ⅱ型膠原的降解作用，從而起到保護(hù)膝關(guān)節(jié)，延緩關(guān)節(jié)退變的治療效果。

綜上所述，KOA 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，iNOS 的高表達(dá)導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨破壞和軟骨基質(zhì)降解僅是KOA發(fā)病的機(jī)制之一。雖然鹿角壯骨膠囊在臨床上治療膝骨關(guān)節(jié)炎獲得良好的療效，但對(duì)其治療作用機(jī)制了解尚淺，今后仍需進(jìn)一步探討。