左亞奇，高志紅，龐 策，劉賽娜，張曉麗，孫轉(zhuǎn)友，甄 攀

（河北北方學院，河北 張家口 075000）

桑皮素，又名桑根皮素、桑白皮素，是一種異戊二烯基取代的黃酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)桑皮素為桑白皮的主要藥用成分，常被用作對照品對桑白皮進行質(zhì)量監(jiān)測，具有抗 菌［1］、抗氧化［2］、降 血糖［3］及抗腫瘤［4］等多種生物活性，尤其是在抗腫瘤方面。鄧潔等［5］將桑皮素作用于STAT3 磷酸化下的卵巢癌SKOV3 細胞后，發(fā)現(xiàn)桑皮素顯著抑制SKOV3 細胞的增殖，并降低Cyclin D1 蛋白的表達；Dat 等［6］通過MTT 實驗發(fā)現(xiàn)桑葉中提取的桑皮素對多種腫瘤細胞均有較好的抑制作用；有研究發(fā)現(xiàn)桑皮素是STAT3 通路中的一個有效的抑制劑，對肝癌和胰腺癌細胞具有抑制作用，另有體內(nèi)外實驗研究表明桑皮素對多種腫瘤細胞具有抑制作用并且對正常細胞的生長幾乎沒有影響［7-9］。本實驗主要研究桑皮素抑制人宮頸癌Hela 細胞的增殖作用，以及初步探討其促進Hela 細胞凋亡的作用機制。

1 材料

1.1 藥物 桑皮素分離自川桑枝（采集于中國云南金平縣，由中國醫(yī)學科學院藥物研究所馬林副研究員鑒定為Morus notabilis），結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。川桑樹枝20 kg，粉碎，用95%乙醇浸泡，回流提取3 次，提取液合并，減壓濃縮得浸膏。將浸膏溶解后以硅膠（100～200 目）拌樣并干燥，分別用石油醚（PE，60～90 ℃）、二氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮依次洗脫。二氯甲烷部分濃縮得浸膏200 g，浸膏以D101 大孔吸附樹脂拌樣并干燥，用乙醇水梯度洗脫（30%、80%、90%乙醇），80%乙醇部分得浸膏29 g，然后依次用硅膠（200～300 目）柱色譜（丙酮-石油醚梯度洗脫）、反相C18柱色譜（甲醇-水梯度洗脫）、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 柱色譜（乙醇洗脫）、制備型RP-HPLC（甲醇-水或乙腈-水洗脫）等分離純制，得到化合物桑皮素，且含有量為1.07 mg/g，純度為99.6%。

圖1 桑皮素結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of morusin

1.2 細胞株 Hela 細胞取自河北北方學院生命科學中心科技樓三樓307 室細胞庫。

1.3 試劑 胎牛血清（美國Gibco 公司，批號1616496）；RPMI 1640 培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司，批號20180511）；Bax 抗體（英國Abcam公司，批號 GR239643-1）；Bcl-2 抗體（英 國Abcam 公司，批號GR25072-1）；Hoechst33258 染色試劑盒（北京碧云天生物技術(shù)研究所，批號102017180427）；抗熒光淬滅劑（北京碧云天生物技術(shù)研究所，批號010518180509）；β-actin 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號AG05127919S）；MTT 試劑（北京索萊寶科技有限公司，批號20180428）；SDS-PAGE 凝膠試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20171113）；5-氟尿嘧啶（5-FU，海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號H31020593）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) Hela 細胞采用含10%胎牛血清、100 μg/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液及傳代培養(yǎng)，正常情況下細胞貼壁生長。

2.2 藥物配制 精密稱取桑皮素2.10 mg，加入0.05 mL 二甲基亞砜混勻震蕩，使藥物全部溶解，然后用RPMI 1640 培養(yǎng)基稀釋成各用藥濃度，放置于4 ℃冰箱保存，保質(zhì)期10 d。實驗前取1 支5-FU（10 mL/支，0.25 g），用RPMI 1640 培養(yǎng)基稀釋配制陽性藥（192 μmol/L），放置于4 ℃冰箱保存。

2.3 Hela 細胞的形態(tài)學變化觀察 ①倒置顯微鏡觀察Hela 細胞的形態(tài)，用10、15、20 μmol/L桑皮素作用Hela 細胞24 h 后，鏡下觀察細胞形態(tài)變化。②透射電鏡觀察Hela 細胞的超微結(jié)構(gòu)，選取對數(shù)期生長的 Hela 細胞，經(jīng)不同濃度（0、15 μmol/L）桑皮素作用24 h 后，胰酶消化2 min，離心（1 500 r/min，5 min），置于1.5 mL離心管內(nèi)；2.5% 的戊二醛固定細胞，PBS 清洗3次；1%鋨酸對Hela 細胞進行固定，PBS 清洗細胞3 次；丙酮梯度脫水；浸透在丙酮和包埋液（1∶1）的混合液中，于37 ℃溫箱中過夜；包埋，修塊，切片，電子染色，鏡下觀察。③掃描電鏡觀察Hela 細胞的超微結(jié)構(gòu)，選取對數(shù)期生長的Hela 細胞，經(jīng)不同濃度（0、15 μmol/L）桑皮素作用24 h后，經(jīng)胰酶消化2 min，計數(shù)后進行鋪板，待細胞融合度為80%～90%時，PBS 清洗3 次，5 min/次，2.5%的戊二醛固定1 h，PBS 清洗3 次，5 min/次，采用酒精梯度脫水，叔丁醇浸泡30 min，置于-20 ℃冰箱里變?yōu)楣腆w，冷凍干燥儀進行干燥，噴金，鏡下觀察。

2.4 MTT 法檢測桑皮素對Hela 細胞增殖抑制作用取處于對數(shù)期并生長良好的Hela 細胞，胰酶消化后，加入培養(yǎng)基輕輕吹打混勻單細胞懸液，均勻加入96 孔板內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后，加入桑皮素（2.5、5、7.5、10、15、20、25 μmol/L），作用24、48 h 后，終止培養(yǎng)。同時設(shè)置正常組、DMSO組（含0.1% DMSO 的等量培養(yǎng)基）及陽性對照組（5-FU，192 μmol/L），并分別設(shè)置6 個復(fù)孔。于每孔中加入10 μL MTT 試劑，培養(yǎng)箱中靜置4 h 后用酶標儀測定 490 nm 處吸光度值 ［OD（490 nm）］，并計算IC50。

2.5 Hoechst 染色法觀察Hela 細胞的凋亡 取處于對數(shù)期并生長良好的Hela 細胞，胰酶消化后，用細胞計數(shù)板將細胞濃度調(diào)整為5×105/mL，將蓋玻片放置于6 孔板中，并每孔加入2 mL 單細胞懸液，培養(yǎng)24 h。次日加入桑皮素（0、10、15、20 μmol/L）作用24 h 后，終止培養(yǎng)。爬片完成后用PBS 清洗爬片3 次，3 min/次，丙酮室溫固定20 min，PBS 清洗。暗室內(nèi)滴加Hoechst 33258 染液對細胞進行染色，PBS 清洗?？篃晒獯銣鐒┓馄?，鏡下觀察并拍照。

2.6 Western blot 檢測Hela 細胞Bax、Bcl-2 蛋白表達 收集經(jīng)濃度為0、10、15、20 μmol/L 桑皮素處理24 h 及經(jīng)15 μmol/L 桑皮素分別處理0、24、48 h 后的Hela 細胞，PBS 清洗，1 700 r/min離心收集細胞。加入0.5 mL 蛋白裂解液，混勻靜置5 min，加1 mL 蛋白抽 提試劑，混勻靜 置10 min，10 000 r/min、4 ℃高速離心15 min，保留中間蛋白膜，加1 mL 無水乙醇洗滌沉淀，10 000g、4 ℃離心3 min，去掉無水乙醇室溫干燥蛋白。加入100 μL 2% SDS 溶解總蛋白，測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液蛋白煮沸，冷卻后置于4 ℃冰箱保存，配制SDS 聚丙烯酰胺凝膠。每孔分別加5 μL Maker，正常組蛋白，樣品蛋白，電泳1 h，轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，PBST 洗膜3 次，10 min/次，加入一抗（1∶1 000）覆蓋，4 ℃過夜；次日，PBST 清洗3 次，加入二抗（1∶5 000）覆蓋，室溫孵育1 h，PBST 洗膜3 次，10 min/次，滴加發(fā)光液拍照，用Quantity one 測定條帶灰度值。

2.7 qRT-PCR 檢測Bax、Bcl-2 mRNA 表達 消化洗滌對數(shù)期正常組和加藥組細胞，2 500g離心收集細胞，PBS 清洗3 次，去上清，加1 mL RNA 抽提試劑靜置5 min，加入氯仿0.2 mL，上下顛倒，室溫靜置2 min，于4 ℃下12 000 r/min 離心15 min，吸取上清至無酶離心管內(nèi)，加等體積異丙醇，混勻后室溫靜置10 min，于4 ℃下10 000 r/min離心10 min，保留沉淀，加1 mL 75% 滅酶乙醇，于4 ℃下7 500 r/min 離心5 min，保留沉淀并室溫干燥，加20 μL 無酶水溶解，取1 μL RNA 于NanoDrop2000 超微量分光光度計檢測總RNA 濃度及純度。根據(jù)試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄，Bax、Bcl-2 及內(nèi)參引物β-actin的引物序列及長度，見表1。對僅轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增，反應(yīng)體系參照Yu 等［10］方法。采用2-ΔΔCt方法對mRNA 的相對轉(zhuǎn)錄水平進行統(tǒng)計分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（）表示，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 桑皮素對Hela 細胞形態(tài)學的影響

3.1.1 倒置顯微鏡觀察 桑皮素（0、10、15、20 μmol/L）處理Hela 細胞24 h，倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞狀態(tài)由正常的六棱形逐漸皺縮變圓，細胞貼壁率降低，且有細胞穿孔現(xiàn)象，并且隨著桑皮素濃度的增高，該現(xiàn)象越明顯，見圖2。

3.1.2 透射電鏡觀察 用透射電鏡觀察0、15 μmol/L桑皮素組細胞超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)15 μmol/L桑皮素組細胞膜不完整，染色質(zhì)高度盤繞，細胞器結(jié)構(gòu)不完整，形成許多氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)，見圖3。

3.1.3 掃描電鏡觀察 用掃描電鏡觀察0、15 μmol/L桑皮素組細胞超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)15 μmol/L桑皮素組細胞膜皺縮，細絲狀突起斷裂，表面呈不規(guī)則的塊狀，見圖4。

3.2 MTT 法檢測Hela 細胞增殖 與DMSO 對照組比較，不同濃度桑皮素（2.5、5、7.5、10、15、20、25 μmol/L）處理Hela 細胞24、48 h，均能抑制Hela 細胞增殖（P＜0.05），且呈濃度依賴性；其中桑皮素處理Hela 細胞24 h，IC50=17.2 μmol/L，見表2。

圖2 不同濃度桑皮素對Hela 細胞形態(tài)的影響（×200）Fig.2 Effects of different concentrations of morusin on the morphology of Hela cells（×200）

圖3 桑皮素對Hela 細胞超微結(jié)構(gòu)的影響（透射電鏡）Fig.3 Effect of morusin on the microstructure of Hela cells（TEM）

圖4 桑皮素對Hela 細胞顯微結(jié)構(gòu)的影響（掃描電鏡）Fig.4 Effect of morusin on the microstructure of Hela cells（SEM）

3.3 Hoechst 單染檢測Hela 細胞凋亡 不同濃度桑皮素（0、10、15、20 μmol/L）處理Hela 細胞24 h 后，經(jīng)Hoechst33258 染色，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常組細胞呈橢圓形和正常藍色；10 μmol/L桑皮素組細胞個別染色加深，染色質(zhì)固縮，細胞核呈致密濃染；15 μmol/L桑皮素組濃染細胞數(shù)量明顯增多，多數(shù)細胞核邊緣變鈍；20 μmol/L桑皮素組有部分細胞核出現(xiàn)破碎的現(xiàn)象，見圖5。

表2 桑皮素對Hela 細胞的抑制作用（，n＝6）Tab.2 Inhibition of Hela by morusin（，n＝6）

表2 桑皮素對Hela 細胞的抑制作用（，n＝6）Tab.2 Inhibition of Hela by morusin（，n＝6）

注：與同一時間DMSO 對照組比較，?P＜0.05。

圖5 不同濃度桑皮素對Hela 細胞早期凋亡的影響Fig.5 Effects of different concentrations of morusin on early apoptosis of Hela cells

3.4 Western blot 檢測Hela 細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達 不同濃度桑皮素（10、15、20 μmol/L）處理Hela 細胞24 h，與0 μmol/L 桑皮素比較，桑皮素（10、15、20 μmol/L）能顯著抑制Hela 細胞中Bcl-2 蛋白表達，促進Bax 蛋白表達（P＜0.05）；15 μmol/L桑皮素作用Hela 細胞24、48 h，Hela 細胞中Bcl-2 蛋白下調(diào)，Bax 蛋白表達上調(diào)（P＜0.05）。見表3～4、圖6。

圖6 Western blot 檢測桑皮素作用Hela 細胞后Bcl-2、Bax 蛋白表達Fig.6 Protein expressions of Bcl-2 and Bax in Hela cells treated with morusin by Western blot

表3 不同濃度桑皮素對Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響（，n＝3）Tab.3 Effects of different concentrations of morusin on the expressions of Bcl-2 and Bax proteins（，n＝3）

表3 不同濃度桑皮素對Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響（，n＝3）Tab.3 Effects of different concentrations of morusin on the expressions of Bcl-2 and Bax proteins（，n＝3）

注：與0 μmol/L 桑皮素組比較，?P＜0.05。

表4 15 μmol/L 桑皮素處理Hela 細胞不同時間對Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響（，n＝3）Tab.4 Effects of 15 μmol/L morusin treatment to Hela cells at different times on the expression of Bcl-2 and Bax proteins（，n＝3）

表4 15 μmol/L 桑皮素處理Hela 細胞不同時間對Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響（，n＝3）Tab.4 Effects of 15 μmol/L morusin treatment to Hela cells at different times on the expression of Bcl-2 and Bax proteins（，n＝3）

注：與0 h 比較，?P＜0.05。

3.5 qRT-PCR 檢測Hela 細胞Bcl-2、BaxmRNA 表達 不同濃度桑皮素（0、10、15、20 μmol/L）處理Hela 細胞24 h，與0 μmol/L 桑皮素比較，桑皮素（10、15、20 μmol/L）上調(diào)BaxmRNA 表達，下調(diào)Bcl-2 mRNA 表達（P＜0.05），見表5。

表5 不同濃度桑皮素對Bcl-2、 Bax mRNA 表達的影響（，n＝3）Tab.5 Effects of different concentrations of morusin on the expressions of Bcl-2 and Bax mRNA（，n＝3）

表5 不同濃度桑皮素對Bcl-2、 Bax mRNA 表達的影響（，n＝3）Tab.5 Effects of different concentrations of morusin on the expressions of Bcl-2 and Bax mRNA（，n＝3）

注：與0 μmol/L 桑皮素組比較，?P＜0.05。

4 討論

宮頸癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，較多發(fā)生在歐洲和非洲，臨床診治中宮頸癌的早期癥狀不甚明顯，患者多數(shù)表現(xiàn)為中晚期，而且預(yù)后效果不好［11］。目前在宮頸癌的常規(guī)治療中，常常以早中期的外科手術(shù)治療為主，同時以中晚期的放療和化療為輔助手段［12］。但是宮頸癌大都早期不易發(fā)現(xiàn)，而放化療在治療的同時對機體又有一定程度的損傷并增加了患者的痛苦。

黃酮類化合物廣泛存在于藥用植物中，不同的黃酮類化合物都表現(xiàn)出不同的抗腫瘤效果，并且有部分已被用于癌癥的治療中［13］。其中有些黃酮類化合物（如蛇葡萄素）被用于前列腺癌的防治研究并獲得不錯的效果［14］。異戊二烯基黃酮作為黃酮化合物的一種，具有抑菌、消炎、抗氧化等作用［15］。

桑皮素是從桑樹根皮或者枝皮中提取分離得到的，廣泛存在于桑樹的各個部位中，特別是在桑樹的根皮中含有量最高，枝皮中的含有量次之［16-17］。國內(nèi)外的學者對其做了大量研究，發(fā)現(xiàn)桑皮素的藥理作用十分豐富，具有抑菌、抗炎及抗病毒等作用，并且具有一定的細胞毒性，對多種癌細胞均有抑制作用［18］。

本實驗MTT 結(jié)果表明，桑皮素作用Hela 細胞24 h 后，IC50=17.2 μmol/L，且隨著桑皮素濃度的提高，效果越明顯。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常組的細胞狀態(tài)良好呈六棱形，桑皮素組細胞皺縮變圓，貼壁細胞數(shù)量相對減少，明顯可以看到細胞穿孔的現(xiàn)象，并且隨著桑皮素濃度的增高，細胞變化越明顯。透射電鏡結(jié)果顯示，15 μmol/L 桑皮素組細胞膜不完整，染色質(zhì)固縮，細胞器結(jié)構(gòu)損壞，出現(xiàn)許多氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)。掃描電鏡結(jié)果顯示，15 μmol/L桑皮素組細胞膜皺縮，細絲狀突起斷裂，表面呈不規(guī)則的塊狀。

桑皮素作用于癌細胞的重要靶點，抑制腫瘤細胞的生長并誘導其凋亡，最終使癌細胞走向死亡［19］。本實驗通過利用Hoechst 單染檢測Hela 細胞凋亡，明顯地看到隨著桑皮素作用濃度升高，核染色逐漸加深，高濃度桑皮素作用下，細胞核裂解。

細胞凋亡與相關(guān)基因的表達有關(guān)，藥物可以通過調(diào)控一個或多個基因來誘導癌細胞的凋亡或者壞死。Bcl-2 蛋白家族成員可以通過調(diào)控線粒體途徑影響細胞凋亡。Bcl-2 家族包括誘導凋亡的蛋白（Bax、Bak、Bid、Bim）以及抑 制凋亡 的蛋白（Bcl-2、Bcl-xL）。當細胞發(fā)生凋亡時，Bax 與Bak發(fā)生寡聚化，從胞質(zhì)聚集到線粒體的外膜上，與膜上電壓作用打開陰離子通路，使線粒體內(nèi)的細胞色素C 等凋亡因子等釋放到細胞質(zhì)基質(zhì)中，引起細胞死亡［20］。

為了驗證桑皮素促進Hela 細胞凋亡的分子機制，本實驗利用Western blot 和qRT-PCR 實驗觀察Hela 細胞中Bax、Bcl-2 mRNA 和蛋白的表達。結(jié)果表明，桑皮素可能通過促進Bax和抑制Bcl-2 mRNA 和蛋白的表達來誘導宮頸癌Hela 細胞的凋亡，但是其作用機理尚不清楚，仍需要做進一步的研究。綜上所述，桑皮素通過升高Bax 因子的表達和降低Bcl-2 因子的表達，從而誘導Hela 細胞發(fā)生凋亡。