/ 上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院

0 引言

液相色譜儀具有快速、靈敏、高選擇、高分離效率及適用范圍廣等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品藥品的定性與定量檢測(cè)等領(lǐng)域，是分析實(shí)驗(yàn)室必備的理化分析測(cè)試儀器。隨著液相色譜技術(shù)的不斷發(fā)展，儀器的更新?lián)Q代，液相色譜儀第一版檢定規(guī)程自1991年01月01日發(fā)布實(shí)施已經(jīng)經(jīng)過(guò)兩輪修訂，能夠較好與儀器的發(fā)展水平相適應(yīng)。但是，由于儀器應(yīng)用面較廣，各行業(yè)對(duì)儀器的性能要求的側(cè)重也不同，本文根據(jù)檢定實(shí)踐積累，對(duì)規(guī)程中泵流量測(cè)定、波長(zhǎng)示值誤差與重復(fù)性、線性范圍等內(nèi)容提出方法改進(jìn)和優(yōu)化的建議，為規(guī)程的修訂提供參考。

1 輸液系統(tǒng)泵流量實(shí)測(cè)值的影響因素及其控制

泵流量決定了樣品的出峰時(shí)間，其設(shè)定值誤差與穩(wěn)定性直接影響到樣品的定性結(jié)果，是儀器檢定過(guò)程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。規(guī)程中泵流量實(shí)測(cè)值根據(jù)收集的流動(dòng)相的密度、質(zhì)量以及收集時(shí)間由式（1）得到[1]。

式中：Fm—— 流量實(shí)測(cè)值，mL/min；

W2—— 容量瓶+流動(dòng)相的質(zhì)量，g；

W1—— 容量瓶的質(zhì)量，g；

ρt—— 實(shí)驗(yàn)室溫度下流動(dòng)相密度，g/cm3；

t—— 收集流動(dòng)相的時(shí)間，min

實(shí)際檢定時(shí)，通過(guò)稱重法測(cè)量泵流量主要存在以下問(wèn)題。

1.1 泵流量實(shí)測(cè)值的影響因素

根據(jù)規(guī)程，在流動(dòng)相出口處用事先稱重過(guò)的潔凈容量瓶收集流動(dòng)相，該出口通常指的是廢液端流出口。此時(shí)，流動(dòng)相已經(jīng)流經(jīng)整個(gè)系統(tǒng)，這不僅是對(duì)泵流量的測(cè)定，更是對(duì)整機(jī)流量的測(cè)定。其設(shè)定值誤差與穩(wěn)定性不僅取決于泵，還會(huì)受到其他因素的影響：

1）在常規(guī)檢定過(guò)程中，通常柱溫箱為室溫狀態(tài)，但是當(dāng)檢測(cè)器為示差折光率檢測(cè)器時(shí)，其柱溫須與檢測(cè)器溫度保持一致，為排除室溫波動(dòng)的干擾，通常設(shè)定值為35 ℃及以上。此時(shí)，以甲醇作為流動(dòng)相，當(dāng)甲醇以較高溫度的狀態(tài)流經(jīng)整個(gè)系統(tǒng)后，其揮發(fā)速度明顯高于室溫狀態(tài)，使得泵流量設(shè)定值小于實(shí)際值，溫度越高，偏離越大。

2）蒸發(fā)光檢測(cè)器是通過(guò)洗脫液霧化成氣溶膠在漂移管中蒸發(fā)，檢測(cè)蒸汽中樣品顆粒的散射光產(chǎn)生的電信號(hào)，從而進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。根據(jù)其原理可知，當(dāng)流動(dòng)相流經(jīng)蒸發(fā)光檢測(cè)器后，會(huì)產(chǎn)生一定的損耗，并且其廢液流出口的管路過(guò)粗，可能有部分霧化，呈氣霧狀，導(dǎo)致從廢液端進(jìn)行流動(dòng)相收集的結(jié)果不準(zhǔn)確。在以上情況下，可從檢測(cè)器入口處采集流動(dòng)相。但是部分超高效液相色譜儀，其管路粒徑小，壓力大，流動(dòng)相會(huì)以噴射狀流出，若難以準(zhǔn)確進(jìn)行流動(dòng)相采集，可更換粗粒徑管路后進(jìn)行測(cè)量。

3）實(shí)驗(yàn)室條件也會(huì)對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生影響，例如部分生產(chǎn)車間不具備最小分度值在1 mg內(nèi)的天平，或天平不在同層或同樓，或其提供的天平不具有溯源性，均導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果出現(xiàn)偏差。

1.2 泵流量實(shí)測(cè)值的控制

根據(jù)規(guī)程，在稱重法測(cè)量過(guò)程中，流動(dòng)相的采集、稱重、計(jì)時(shí)均是由檢定人員手動(dòng)操作完成，其中不可避免地會(huì)引入人為影響因素。同一臺(tái)液相色譜儀的穩(wěn)定性由不同的檢定人員測(cè)量，或者由同一個(gè)檢定人員先后兩次測(cè)量，其結(jié)果均可能出現(xiàn)較大差異。

為避免人為因素引入的誤差，方便用戶對(duì)液相色譜儀流動(dòng)相流速的檢測(cè)，建議可采用商品化液相流量計(jì)，直接測(cè)量得出泵流量的實(shí)測(cè)值。該類流量計(jì)又稱容積式流量計(jì)、定排量流量計(jì)，屬于高精度流量計(jì)。其原理是根據(jù)收集固定體積流動(dòng)相所需要的時(shí)間，即式（2）計(jì)算泵流量。

式中：Fm——流量實(shí)測(cè)值，mL/min；

V—— 液相流量計(jì)的固定體積，mL；

t—— 收集流動(dòng)相的時(shí)間，min

相對(duì)而言，液相流量計(jì)直接連接于泵端，不受柱溫及檢測(cè)器影響，直接對(duì)泵性能進(jìn)行檢測(cè)，能更好地減少人為、環(huán)境、實(shí)驗(yàn)室條件等因素引入的誤差，并且在測(cè)量過(guò)程中操作簡(jiǎn)便，更具有實(shí)用性。對(duì)于同一臺(tái)液相色譜儀，采用液相流量計(jì)法和稱重法得到的測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)表中數(shù)據(jù)可知，液相流量計(jì)所測(cè)定的泵流量穩(wěn)定性值優(yōu)于稱重法所得結(jié)果，并且由于在后續(xù)檢定中流量穩(wěn)定性為必檢項(xiàng)目，建議可以在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境因素影響較大的情況下，使用液相流量計(jì)測(cè)量的方法進(jìn)行泵流量穩(wěn)定性的測(cè)量。

表1 不同方法測(cè)定液相色譜儀泵流量設(shè)定值誤差和穩(wěn)定性（室溫）

2 進(jìn)樣系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響及檢定建議

2.1 樣品交叉污染

液相色譜儀在使用過(guò)程中進(jìn)樣量小，且樣品成分復(fù)雜。若進(jìn)樣后殘留過(guò)高，則會(huì)導(dǎo)致樣品間的交叉污染，致使數(shù)據(jù)呈現(xiàn)假陽(yáng)性，或出現(xiàn)雜峰或干擾峰，影響結(jié)果的可信度。而液相色譜儀檢定規(guī)程中并沒(méi)有要求對(duì)該項(xiàng)目進(jìn)行檢定，無(wú)法判斷儀器是否對(duì)樣品引入交叉污染。因此，建議檢定規(guī)程中增加相應(yīng)檢定項(xiàng)目，具體操作過(guò)程可參照2020年2月1日起實(shí)施的GB/T 38125-2019《液相色譜儀用自動(dòng)進(jìn)樣器》。其中在自動(dòng)進(jìn)樣器樣品殘留技術(shù)指標(biāo)中，要求空白樣與標(biāo)樣的峰面積的比值應(yīng)不大于0.01%。此外，在該項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中提出的自動(dòng)進(jìn)樣器的取樣體積誤差、進(jìn)樣重復(fù)性、線性等技術(shù)指標(biāo)都具有極高的參考價(jià)值[2]。

2.2 樣品室溫度

液相色譜儀在理化分析的應(yīng)用過(guò)程中，常用于有機(jī)物及生物樣品的分析，該類樣品對(duì)溫度較為敏感，在一定溫度下可能會(huì)引起量變或質(zhì)變。為了解決這一問(wèn)題，液相色譜儀在樣品室中安裝了控溫模塊，可使樣品在進(jìn)樣等待過(guò)程中處于低溫的狀態(tài)，得到更好的保存。而液相色譜儀檢定規(guī)程中并未要求對(duì)控溫裝置的溫度準(zhǔn)確度進(jìn)行考核，無(wú)法判斷樣品室溫度是否滿足需求。鑒于樣品室的控溫模塊并非液相色譜儀必備模塊，建議檢定規(guī)程中根據(jù)客戶需求，可作為選擇項(xiàng)目增加。在具體操作的實(shí)施過(guò)程中，對(duì)不同的指定位置下，樣品進(jìn)樣器中恒溫器的溫度準(zhǔn)確性進(jìn)行考察，其技術(shù)指標(biāo)可參照柱箱溫度。

3 檢測(cè)系統(tǒng)檢定結(jié)果影響因素及控制

3.1 波長(zhǎng)示值誤差與重復(fù)性

波長(zhǎng)示值誤差與重復(fù)性針對(duì)的是液相色譜儀中的紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器。

液相色譜儀規(guī)程中檢定紫外-可見(jiàn)光/二極管陣列檢測(cè)器的常用方法是以泵注入檢測(cè)器的方式，將重鉻酸鉀溶液充滿整個(gè)檢測(cè)池，測(cè)量235 nm，257 nm，313 nm，350 nm處波長(zhǎng)示值誤差與重復(fù)性。熒光檢測(cè)器是以泵注入檢測(cè)器的方式，將萘甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液充滿整個(gè)檢測(cè)池，測(cè)量激發(fā)波長(zhǎng)290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)330 nm處的波長(zhǎng)示值誤差與重復(fù)性。

液相色譜作為理化分析實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備，客戶的日常使用需求量較大，在檢定波長(zhǎng)后，由于檢測(cè)器的檢測(cè)池中充滿高濃度重鉻酸鉀溶液，導(dǎo)致儀器管路嚴(yán)重污染，需要較長(zhǎng)時(shí)間的沖洗后才能投入使用。因此，通?？赏ㄟ^(guò)各儀器廠商提供的診斷軟件對(duì)儀器波長(zhǎng)進(jìn)行自檢。而對(duì)于不具備自檢能力的儀器，規(guī)程起草人何海紅[2]針對(duì)該問(wèn)題提出利用咖啡因乙腈溶液進(jìn)行液相色譜儀的波長(zhǎng)校準(zhǔn)，通過(guò)進(jìn)樣的方式，測(cè)量咖啡因在 205 nm，245 nm，273 nm 處波長(zhǎng)示值誤差和重復(fù)性。該方法普遍應(yīng)用于各大進(jìn)口儀器廠商，是被美國(guó)FDA承認(rèn)的波長(zhǎng)校準(zhǔn)方法，儀器不產(chǎn)生污染，可以減少后處理所用的時(shí)間，使儀器能夠更快投入使用。

同理，熒光檢測(cè)器使用萘甲醇標(biāo)樣充滿檢測(cè)池，對(duì)標(biāo)樣的需求量較大，建議也采用直接進(jìn)樣的方式，可以較大程度減少萘甲醇的使用量和對(duì)樣品池的沖洗時(shí)間，減少污染，提高工作效率。

除此之外，使用純水相在0.25 mL/min的低流速下測(cè)量水的激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)397 nm，同樣可以得到熒光檢測(cè)器的波長(zhǎng)示值誤差和重復(fù)性。這也是各儀器廠商熒光波長(zhǎng)測(cè)定的常用方法。

3.2 線性范圍

液相色譜儀的線性范圍決定了測(cè)量樣品的濃度范圍，直接影響到樣品的定量結(jié)果準(zhǔn)確性。在液相色譜儀檢定規(guī)程中，線性范圍作為檢測(cè)器的考察項(xiàng)目，是將標(biāo)樣單獨(dú)以注射器注射的方式直接注入檢測(cè)池中，但是，示差折光率檢測(cè)器對(duì)環(huán)境、壓力、流動(dòng)相組成有著較高的要求，工作時(shí)通常需要保持環(huán)境的恒溫、恒壓，且流動(dòng)相組成恒定。按照規(guī)程進(jìn)行線性范圍檢測(cè)上限CH檢定校準(zhǔn)時(shí)，以手動(dòng)方式將注射器中標(biāo)樣推進(jìn)檢測(cè)池的過(guò)程中，這三者都會(huì)發(fā)生明顯變化，無(wú)法保證測(cè)得結(jié)果的準(zhǔn)確性。李碩等[4]在2014版液相色譜儀檢定規(guī)程發(fā)布后提出利用改進(jìn)進(jìn)樣方式，提高線性范圍檢定的可操作性。本實(shí)驗(yàn)室采用自動(dòng)進(jìn)樣器的方式進(jìn)樣（甲醇中膽固醇溶液：膽固醇含量 1×10-4～10×10-4g/mL），所得結(jié)果與同一臺(tái)儀器注射法進(jìn)樣結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同進(jìn)樣方法測(cè)定液相色譜儀泵流量設(shè)定值誤差和穩(wěn)定性

由表2中數(shù)據(jù)可知：利用自動(dòng)進(jìn)樣器直接進(jìn)樣的方式能夠呈現(xiàn)出更好的線性關(guān)系，該方法能綜合評(píng)價(jià)包括進(jìn)樣器在內(nèi)的整機(jī)線性范圍性能。手動(dòng)注射的方式會(huì)在樣品注入檢測(cè)器的瞬間產(chǎn)生較為顯著的溫度、壓力、流動(dòng)相組成的變化，對(duì)于示差折光率檢測(cè)器的干擾過(guò)大，存在著不穩(wěn)定性因素，所得結(jié)果的重現(xiàn)性差。

在常規(guī)檢定及日常使用過(guò)程中，通常以有機(jī)相作為流動(dòng)相使用。因此，為更好地考察儀器整機(jī)的線性性能，可以在純甲醇相中，通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣方式考察線性。其中，紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器均可使用萘甲醇標(biāo)樣進(jìn)樣，示差折光率檢測(cè)器可使用膽固醇-甲醇標(biāo)樣進(jìn)樣。若儀器日常以水相作為常用流動(dòng)相，則可在不接色譜柱的情況下，使用丙酮-水溶液進(jìn)樣，得到線性結(jié)果。陳敏等[5]針對(duì)紫外檢測(cè)器線性范圍的檢定，也同樣提出了自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣的方式，減少樣品消耗量，縮短檢定時(shí)間，證明了自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣方式在紫外檢測(cè)器上同樣具有可行性。

4 結(jié)語(yǔ)

本文根據(jù)檢定經(jīng)驗(yàn)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)，針對(duì)液相色譜儀檢定涉及的泵流量測(cè)定、波長(zhǎng)示值誤差與重復(fù)性、線性范圍等的方法進(jìn)行探討。對(duì)泵流量測(cè)定提出可以增加液相流量計(jì)法，提高工作效率。對(duì)波長(zhǎng)示值誤差與重復(fù)性提出咖啡因進(jìn)樣方式，避免儀器污染。對(duì)線性范圍測(cè)定，以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明對(duì)于溫度、壓力、流動(dòng)相組成的變化敏感的示差折光率檢測(cè)器而言，自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣方式更具有可操作性。同時(shí)結(jié)合液相色譜儀工作實(shí)際，提出可以增加樣品交叉污染、樣品室溫度性能的檢定，為更加完整地評(píng)價(jià)儀器性能提供參考。