姜浩 呂雪飛 趙可心

摘?要?適配體（Aptamer）是通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）篩選得到的，可與靶標(biāo)分子以高親和力特異性結(jié)合的單鏈DNA或RNA，在生物分離分析、臨床診斷和疾病靶向治療等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。適配體的發(fā)展與篩選技術(shù)的進(jìn)步密切相關(guān)，以SELEX為基礎(chǔ)，研究者開(kāi)發(fā)了磁珠SELEX和毛細(xì)管電泳SELEX等多種適配體體外篩選技術(shù)，但這些方法存在篩選輪次多、篩選周期長(zhǎng)和樣品消耗量大、對(duì)小分子篩選效率低等缺點(diǎn)。微流控芯片具有體積小、高通量和易集成等特點(diǎn)，基于微流控芯片的SELEX技術(shù)在一定程度上可解決上述問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)適配體快速、高通量的體外篩選。本文在總結(jié)SELEX及其關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)評(píng)述了基于微流控和微陣列芯片SELEX技術(shù)的研究進(jìn)展，并對(duì)SELEX技術(shù)中未來(lái)的發(fā)展方向進(jìn)行了總結(jié)和展望。

關(guān)鍵詞?適配體;篩選;指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù);微流控芯片;微陣列芯片;評(píng)述

1?引 言

適配體是通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）在體外篩選得到的一段寡聚核糖核苷酸（RNA）或單鏈脫氧核糖核苷酸（ssDNA）序列，與靶標(biāo)分子之間具有特異性相互作用，借助范德華力、氫鍵、疏水作用和靜電作用等分子間作用力，折疊成復(fù)雜穩(wěn)定的3D結(jié)構(gòu)，如莖環(huán)[1]、發(fā)夾[2]和G四鏈體[3]等。自1990年Ellington[4]和Tuerk[5]從含有1015種寡核苷酸文庫(kù)中篩選出RNA適配體以來(lái)，研究者陸續(xù)篩選出許多適配體，其靶標(biāo)范圍覆蓋了金屬離子、三磷酸腺苷（ATP）、氨基酸等小分子物質(zhì);生長(zhǎng)因子和細(xì)胞粘附分子等蛋白質(zhì)以及其它大分子有機(jī)物，甚至可通過(guò)靶向特定的膜蛋白識(shí)別病毒、細(xì)菌和細(xì)胞。目前，適配體已被廣泛用于靶向藥物遞送[6]、生物分子識(shí)別和檢測(cè)[7]等領(lǐng)域，并已嘗試用于臨床治療方面[8]。

適配體與靶標(biāo)分子的親和力可達(dá)mmol/L～pmol/L級(jí)別，與抗體水平相當(dāng)[9]。適配體具有抗體不能比擬的優(yōu)勢(shì)，如更高的選擇性和穩(wěn)定性、制備簡(jiǎn)單、易修飾、無(wú)免疫原性等，因此受到研究者關(guān)注。

適配體的發(fā)展與篩選技術(shù)的進(jìn)步密切相關(guān)。研究者根據(jù)SELEX的關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)對(duì)傳統(tǒng)篩選技術(shù)進(jìn)行了改良，如依據(jù)結(jié)合與未結(jié)合寡核苷酸的分離技術(shù)，提出了基于磁珠分離法的SELEX技術(shù)[10]和基于毛細(xì)管電泳分離法的SELEX技術(shù)[11]等;提出了基于不對(duì)稱PCR法[12]、λ核酸外切酶法[13]和磁珠法的次級(jí)文庫(kù)制備技術(shù)[14]。但是，SELEX技術(shù)仍存在篩選輪次多、篩選周期長(zhǎng)、文庫(kù)合成量大、利用率低、樣品消耗量大等問(wèn)題。微流控芯片具有體積小、高通量和易集成等特點(diǎn)，基于微流控芯片的SELEX技術(shù)在一定程度上可解決上述問(wèn)題，為實(shí)現(xiàn)適配體快速、高通量的體外篩選提供了新思路。

本文依據(jù)近年來(lái)適配體篩選技術(shù)的研究進(jìn)展，在總結(jié)SELEX及其關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)的基礎(chǔ)之上，重點(diǎn)評(píng)述了基于微流控芯片和微陣列芯片SELEX技術(shù)的研究進(jìn)展。

2?SELEX及其關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)

2.1?SELEX技術(shù)

SELEX技術(shù)首先需構(gòu)建一個(gè)特定長(zhǎng)度、庫(kù)容量為1014～1015的寡核苷酸文庫(kù)，理論上，該文庫(kù)應(yīng)包含所有序列的適配體;然后，將文庫(kù)與靶標(biāo)分子孵育、洗滌后，將未結(jié)合和結(jié)合不牢固的寡核苷酸洗掉，收集牢固結(jié)合的寡核苷酸與靶標(biāo)分子復(fù)合物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）對(duì)收集到的寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增，制備次級(jí)文庫(kù)，用于下一輪的篩選;經(jīng)過(guò)十余輪的篩選即可得到與靶標(biāo)分子具有較高親和力的適配體候選物;最后，通過(guò)克隆與測(cè)序，得到相應(yīng)的適配體序列。

2.2?結(jié)合與未結(jié)合寡核苷酸的分離技術(shù)

2.2.1?基于磁珠的結(jié)合與未結(jié)合寡核苷酸的分離技術(shù)?磁珠表面可修飾多種功能化基團(tuán)，如鏈霉親和素、氨基、羧基和甲苯磺?；龋m用于不同靶標(biāo)分子的固定[10]，并可利用磁場(chǎng)實(shí)現(xiàn)快速分離。因此，磁珠SELEX技術(shù)是目前應(yīng)用最廣的固定靶標(biāo)的適配體篩選技術(shù)。

本研究組在前期的工作中，建立了基于磁珠分離法的SELEX技術(shù)（磁珠SELEX），用于生物大分子的適配體篩選。例如，Xiao等[15]通過(guò)磁珠SELEX技術(shù)篩選出一組特異性與胰蛋白酶結(jié)合的適配體，并作為酶的固載介質(zhì)，制備了基于適配體的酶反應(yīng)器，與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，用于蛋白質(zhì)的在線酶解。Zhang等[16]通過(guò)磁珠SELEX技術(shù)篩選得到一組肌酸激酶同工酶的適配體，并進(jìn)一步優(yōu)化出可結(jié)合肌酸激酶同工酶不同位點(diǎn)的一對(duì)適配體，建立了基于雙適配體夾心的熒光側(cè)向流層析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了肌酸激酶同工酶的定量檢測(cè)。

但是，磁珠SELEX技術(shù)存在靶標(biāo)分子易過(guò)度修飾問(wèn)題，過(guò)高密度的靶標(biāo)分子間的協(xié)同作用會(huì)降低每輪篩選中寡核苷酸的富集效率[17]，可能對(duì)篩選進(jìn)程產(chǎn)生影響。Hünniger等[18]建立了快速磁分離和固相乳液PCR（emPCR）的適配體篩選技術(shù)，將文庫(kù)與靶標(biāo)分子的孵育、洗滌和洗脫等步驟集成為“FISHing”自動(dòng)化程序，將所得的洗脫液直接通過(guò)emPCR進(jìn)行擴(kuò)增。所建立的篩選技術(shù)用于葡萄酒澄清劑中溶菌酶的適配體篩選，得到了親和力在nmol/L級(jí)的適配體（Kd=4.0～20.7 nmol/L），與以往報(bào)道的溶菌酶的適配體親和力（Kd=2.8～52.9 nmol/L）相當(dāng)[19]。

2.2.2?基于毛細(xì)管電泳的結(jié)合與未結(jié)合寡核苷酸的分離技術(shù)?毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis，CE）可根據(jù)寡核苷酸與寡核苷酸-靶標(biāo)復(fù)合物在電場(chǎng)中的遷移速度不同實(shí)現(xiàn)分離。通常情況下，復(fù)合物的遷移較寡核苷酸慢，與之對(duì)應(yīng)的篩選技術(shù)為毛細(xì)管電泳SELEX技術(shù)（CE-SELEX）。不同于磁珠SELEX，CE-SELEX技術(shù)無(wú)需固定靶標(biāo)，只需2～4輪即可篩選出能結(jié)合靶標(biāo)的適配體，大大加快了篩選進(jìn)程。但是，CE-SELEX技術(shù)會(huì)出現(xiàn)結(jié)合與未結(jié)合靶標(biāo)分子的寡核苷酸均向毛細(xì)管電泳儀的出口端移動(dòng)，會(huì)對(duì)適配體的篩選產(chǎn)生一些干擾，因此需要嚴(yán)格控制篩選時(shí)間，這可能會(huì)導(dǎo)致文庫(kù)富集率低等問(wèn)題[20]。

研究人員先后在CE-SELEX技術(shù)的改良方面做了很多創(chuàng)新性的工作，提出了低pH CE-SELEX技術(shù)（LpH-CE-SELEX）[21]、分流收集CE-SELEX技術(shù)（FCE-SELEX）[22]和同步競(jìng)爭(zhēng)CE-SELEX技術(shù)（scCE-SELEX）[20]等，其中，LpH-CE-SELEX在一定程度上避免了未結(jié)合靶標(biāo)分子的寡核苷酸對(duì)篩選過(guò)程的干擾，F(xiàn)CE-SELEX有效降低了被其它寡核苷酸污染的可能性，scCE-SELEX可實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)分子適配體的同時(shí)篩選。

2.3?次級(jí)文庫(kù)的制備技術(shù)

作為新一輪SELEX的起點(diǎn)，次級(jí)文庫(kù)中寡核苷酸的數(shù)量和質(zhì)量對(duì)篩選結(jié)果至關(guān)重要。因此，次級(jí)文庫(kù)制備技術(shù)成為適配體篩選的關(guān)鍵技術(shù)之一。

2.3.1?磁珠法制備次級(jí)文庫(kù)?利用鏈霉親和素與生物素之間的非共價(jià)相互作用以及磁珠在磁場(chǎng)下易操作的特點(diǎn)，磁珠在次級(jí)文庫(kù)制備中發(fā)揮了重要作用[14]。首先，利用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到生物素化的雙鏈DNA;然后，生物素化的雙鏈DNA與鏈霉親和素修飾的磁珠共同孵育;最后，在堿性條件下，雙鏈DNA變性解鏈，磁分離后，上清液中不帶生物素的正義鏈經(jīng)乙醇沉淀回收，即為制備的次級(jí)文庫(kù)。

2.3.2?λ核酸外切酶法制備次級(jí)文庫(kù)?λ核酸外切酶作用于5端修飾有磷酸基團(tuán)的雙鏈DNA，可通過(guò)其對(duì)5端磷酸化的雙鏈DNA的水解制備次級(jí)文庫(kù)[13]。首先，利用帶磷酸基團(tuán)標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到5端磷酸化的雙鏈DNA;其次，λ核酸外切酶水解5端磷酸化的雙鏈DNA，使其反義鏈從5端逐步降解;最后，利用乙醇沉淀等方式將正義鏈回收，即得到所需的次級(jí)文庫(kù)。

2.3.3?不對(duì)稱PCR法制備次級(jí)文庫(kù)?不對(duì)稱PCR法是利用不等量的一對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)生大量單鏈DNA的方法，在次級(jí)文庫(kù)制備和核苷酸序列分析中具有重要作用[12]。通過(guò)控制限制引物和非限制引物濃度的比例（1∶50～1∶100）達(dá)到制備單鏈DNA的目的。反應(yīng)初期的主要產(chǎn)物為雙鏈DNA，待限制引物用盡后，反應(yīng)產(chǎn)生的均為正義鏈。最后，對(duì)正義鏈和雙鏈DNA進(jìn)行電泳分離，回收得到的正義鏈即為制備的次級(jí)文庫(kù)。

3微流控芯片SELEX技術(shù)

3.1?微流控芯片概念及特點(diǎn)

微流控芯片又稱為微全分析系統(tǒng)，是由Manz等[23]在20世紀(jì)90年代首次提出并發(fā)展起來(lái)的跨學(xué)科分析技術(shù)。通過(guò)微加工技術(shù)，在硅、玻璃或有機(jī)聚合物基質(zhì)上構(gòu)建流體微通道、反應(yīng)微腔室和儲(chǔ)液池等微結(jié)構(gòu)單元，將分析過(guò)程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動(dòng)完成分析全過(guò)程。微流控芯片具有集成化、小型化、自動(dòng)化等特點(diǎn)，以及樣品和試劑消耗量少、反應(yīng)速度快、可大量平行處理等優(yōu)點(diǎn)，在生物、化學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的發(fā)展?jié)摿ΑＤ壳?，微流控芯片技術(shù)已被廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)[24]、基因擴(kuò)增與分析[25～27]和蛋白質(zhì)檢測(cè)[28]等領(lǐng)域。

基于微流控芯片的SELEX技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的一種快速高效的適配體篩選體系。將微流控芯片與SELEX技術(shù)結(jié)合，可將樣品和試劑的消耗量降至微升級(jí)，大大降低了篩選成本，提升了分析速度和準(zhǔn)確性。目前，已發(fā)展的微流控芯片SELEX技術(shù)主要包括磁珠法[29]和溶膠-凝膠法[30]等。

3.2?微流控芯片SELEX技術(shù)篩選適配體

3.2.1?基于磁珠的微流控SELEX技術(shù)?基于磁珠的微流控SELEX技術(shù)主要包括連續(xù)流磁激活分離芯片（Continuous-flow magnetic activated chip-based separation，CMACS）系統(tǒng)和微磁分離（Micro magnet separation，MMS）系統(tǒng)。

Soh研究組[31]利用CMACS系統(tǒng)，通過(guò)芯片連續(xù)流磁分離對(duì)重組A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素輕鏈的適配體進(jìn)行篩選（圖1）。首先，通過(guò)PCR擴(kuò)增制備DNA文庫(kù)，并通過(guò)1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）介導(dǎo)法將靶標(biāo)分子固定在磁珠上;然后，將DNA文庫(kù)與固定有靶標(biāo)分子的磁珠共同孵育，在CMACS芯片上進(jìn)行連續(xù)洗滌;最后，用生物素化的反義引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)磁珠法制備次級(jí)文庫(kù)，并測(cè)定其親和力。

然而，CMACS系統(tǒng)使用過(guò)程會(huì)出現(xiàn)微氣泡導(dǎo)致的氣流扭曲，以及微通道阻塞導(dǎo)致的磁珠聚集等問(wèn)題，影響適配體的純度和回收率。在后續(xù)的研究中，Soh研究組[32]開(kāi)發(fā)了MMS系統(tǒng)（圖2），將鐵磁材料整合到微通道中，通過(guò)芯片中鎳材料和緩沖液間磁導(dǎo)率的相對(duì)差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)通道內(nèi)流體動(dòng)力和磁致動(dòng)力的精確控制[33]，減少了磁珠和適配體候選物的損失，實(shí)現(xiàn)了較高的分子分配效率。

Huang等[34]在MMS芯片的基礎(chǔ)上，將反應(yīng)池、分離通道和微加熱系統(tǒng)整合到一塊芯片上，成功篩選出C反應(yīng)蛋白的適配體，與傳統(tǒng)SELEX技術(shù)相比，基于微流控芯片的SELEX技術(shù)在單輪篩選時(shí)間和樣品消耗量上均大大降低。

Ahmad等[35]利用MMS芯片高效的捕獲能力和可高流速洗滌的特點(diǎn)，成功篩選出3種蛋白質(zhì)的適配體：人血小板衍生生長(zhǎng)因子BB（Kd=0.028 nmol/L）、凝血酶（Kd=0.33 nmol/L）和載脂蛋白E3（Kd=3.1 nmol/L）。通過(guò)低濃度蛋白篩選和高流速、長(zhǎng)時(shí)間洗滌，降低了非特異性吸附和弱結(jié)合的情況，獲得了與文獻(xiàn)[36，37]不同的人血小板衍生生長(zhǎng)因子BB和凝血酶的適配體序列，而且親和力也有了較大程度的提升。研究人員還發(fā)現(xiàn)適配體的親和力受蛋白質(zhì)帶電狀態(tài)的影響，由人血小板衍生生長(zhǎng)因子BB在不同pH條件下的篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在酸性緩沖液中，其與適配體具有更高的親和力。

Stoltenburg等[38]使用常規(guī)磁珠SELEX技術(shù)經(jīng)13輪篩選得到鏈霉親和素的適配體，其解離常數(shù)約為56～86 nmol/L。而使用MMS系統(tǒng)經(jīng)3輪分離后即得到了解離常數(shù)在25～65 nmol/L之間的適配體。由此可見(jiàn)，基于微流控芯片的微磁分離SELEX技術(shù)比常規(guī)的磁珠SELEX技術(shù)更高效。

3.2.2?基于溶膠-凝膠的微流控SELEX技術(shù)?溶膠-凝膠是用含高化學(xué)活性的化合物作為前體，在液相下均勻混合并進(jìn)行水解、縮合等反應(yīng)，形成穩(wěn)定的透明溶膠體系，經(jīng)過(guò)膠粒間緩慢聚合，形成三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠。凝膠經(jīng)過(guò)干燥、燒結(jié)、固化，制備出納米乃至亞納米結(jié)構(gòu)的材料。通過(guò)溶膠-凝膠及其衍生物材料固定蛋白質(zhì)，無(wú)需親和試劑標(biāo)記，加入硅酸鹽可最大程度地保持蛋白質(zhì)的生物活性[39]，且可長(zhǎng)期保存不失活[40]。此外，溶膠-凝膠材料價(jià)格相對(duì)便宜，與芯片底板材料性質(zhì)相近，具有極好的相容性。這些特點(diǎn)為溶膠-凝膠在微流控芯片上的應(yīng)用和這一類型芯片的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[41]。

基于溶膠-凝膠的微流控SELEX技術(shù)中，靶標(biāo)分子包裹于具有多孔納米結(jié)構(gòu)的硅酸鹽水凝膠中，寡核苷酸進(jìn)入納米孔與靶標(biāo)分子結(jié)合[42]。因此，溶膠-凝膠顆粒的加工工藝極為關(guān)鍵[43～45]。首先，溶膠-凝膠基質(zhì)中納米孔結(jié)構(gòu)的尺寸必須與靶標(biāo)分子匹配;其次，溶膠-凝膠顆粒須在點(diǎn)樣后長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在，并且有足夠強(qiáng)的粘附力，以防洗滌過(guò)程中顆粒丟失;最后，每個(gè)顆粒的形態(tài)與尺寸必須統(tǒng)一，這對(duì)采用計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。

Ahn等[46]在芯片上集成溶膠-凝膠腔室和微加熱器等結(jié)構(gòu)單元，用于文庫(kù)的洗脫和篩選（圖3）。該芯片帶有一組鋁電極、5個(gè)相連的六邊形腔室和聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）微通道，各腔室靶標(biāo)分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合寡核苷酸鏈。每個(gè)腔室內(nèi)單個(gè)溶膠-凝膠顆粒的體積約為7 nL，每個(gè)顆粒可容納30 fmol蛋白質(zhì)。將該技術(shù)用于酵母TATA結(jié)合蛋白和幾種同源蛋白質(zhì)的適配體篩選，僅經(jīng)過(guò)6輪篩選，得到了解離常數(shù)為2.7 nmol/L的TATA結(jié)合蛋白的適配體。

小分子適配體的體外篩選工作極具挑戰(zhàn)性，一是因?yàn)樾》肿与y以固定;二是受小分子本身結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的限制，篩選出的適配體與小分子的結(jié)合也會(huì)受到影響。通過(guò)改變?nèi)苣z-凝膠顆?？讖降某叽?，可很好地實(shí)現(xiàn)小分子靶標(biāo)的固定。Bae等[47]加工了具有納米孔徑和微米通道的溶膠-凝膠顆粒，寡核苷酸可在微米通道內(nèi)自由移動(dòng)，但與小分子靶標(biāo)相互作用后，被截留在溶膠-凝膠顆粒中。通過(guò)基于溶膠-凝膠法的微流控SELEX技術(shù)，采用7輪篩選得到了黃嘌呤的適配體，解離常數(shù)為4.2 μmol/L。

微流控芯片與SELEX技術(shù)結(jié)合，提高了適配體的篩選效率，降低了篩選成本。但是，基于微流控芯片的適配體篩選技術(shù)在流體流動(dòng)過(guò)程中常會(huì)產(chǎn)生氣泡[48]，對(duì)靶標(biāo)分子與適配體的識(shí)別，以及后續(xù)的PCR擴(kuò)增等均會(huì)產(chǎn)生影響。

4?微陣列芯片SELEX技術(shù)篩選適配體

4.1?微陣列芯片及其分類

微陣列芯片是通過(guò)微點(diǎn)陣技術(shù)或微顆粒填充技術(shù)將數(shù)以萬(wàn)計(jì)的生物探針固定在基板上，通過(guò)生物探針與溶液中的待測(cè)分子特異性結(jié)合完成分析和檢測(cè)過(guò)程。微陣列芯片表面不存在微通道、微腔室等微結(jié)構(gòu)，無(wú)需考慮流體在芯片內(nèi)部流動(dòng)造成的堵塞和氣泡等問(wèn)題，降低了芯片加工和使用的難度。另外，微陣列芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可通過(guò)計(jì)算機(jī)陣列分析技術(shù)獲得。

4.1.1?核酸微陣列芯片與蛋白質(zhì)微陣列芯片

核酸微陣列芯片常以玻璃、硅和塑料作為基板材料，通過(guò)光引導(dǎo)原位合成技術(shù)[49]或物理遞送技術(shù)制造高密度核酸陣列，其中，物理遞送技術(shù)，如噴墨或微噴射沉積[50]，可將納升甚至皮升的溶液體積分配和點(diǎn)樣到微陣列芯片的特定部位。微陣列芯片上檢測(cè)探針與帶有修飾的報(bào)告探針（如熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性同位素等）結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告探針完成信號(hào)檢測(cè)[51]。

與核酸微陣列芯片相同，蛋白質(zhì)微陣列芯片的構(gòu)建最初是直接將蛋白質(zhì)點(diǎn)樣在相關(guān)載體上。常用于制作蛋白質(zhì)微陣列芯片的載體有硝酸纖維素膜、硅樹(shù)脂、玻璃和塑料等[52]。載體的固定對(duì)蛋白質(zhì)的生物活性和空間結(jié)構(gòu)的維持有一定的影響。另外，常見(jiàn)的蛋白質(zhì)微陣列芯片的制備工藝中通常只點(diǎn)樣一種蛋白質(zhì)，將多種蛋白質(zhì)點(diǎn)樣在一塊微陣列芯片上的報(bào)道較少[53]。

4.1.2?微顆粒陣列芯片?微顆粒因其具有比表面積大、結(jié)合動(dòng)力學(xué)快的特點(diǎn)而在生化分析中得到廣泛應(yīng)用[54]。與傳統(tǒng)的平面微陣列芯片相比，微顆粒微陣列芯片利用其上的微顆?？蓪?shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的更快、更靈敏的檢測(cè)[55]。同時(shí)，微顆粒微陣列芯片易實(shí)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)的固定[56]。

Zhu等[54]通過(guò)光聚合反應(yīng)，以4-二甲氨基吡啶（4-Dimethylaminopyridine，DMAP）作為光引發(fā)劑，將摻雜DMAP和丙烯酰胺/雙丙烯酰胺的溶液按照掩膜圖案進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，形成微陣列芯片的微結(jié)構(gòu)，并采用物理俘獲法實(shí)現(xiàn)微顆粒在微陣列芯片上的填充，有效克服了靜電自組裝和電場(chǎng)輔助組裝中微顆粒必須帶電的問(wèn)題。每塊芯片上有40個(gè)凝膠墊陣列單元，每個(gè)單元外周均以聚乙二醇微柱作為親水屏障，將試劑和樣品限制在微陣列芯片上。他們利用該芯片初步實(shí)現(xiàn)了前列腺特異性抗原和人絨毛膜促性腺激素的免疫測(cè)定。Kim等[57]報(bào)道了一種微顆粒陣列芯片的加工工藝，即用停流光刻法進(jìn)行微顆粒的加工，通過(guò)負(fù)壓法實(shí)現(xiàn)微顆粒在陣列芯片上的填充。另外，他們還通過(guò)改變掩膜圖案，制作出形狀各異的微顆粒，并成功生成了防偽應(yīng)用程序的二維粒子陣列代碼。

微陣列芯片不存在氣泡等問(wèn)題帶來(lái)的干擾，而且微陣列芯片上固定的靶標(biāo)數(shù)量大、種類多。特別是微顆粒陣列芯片的出現(xiàn)，可使不同靶標(biāo)分子固定于不同微顆粒上，再將這些微顆粒填充于相應(yīng)區(qū)域，便于檢測(cè)且不會(huì)產(chǎn)生干擾。微陣列芯片與SELEX技術(shù)的結(jié)合為發(fā)展新型適配體篩選技術(shù)提供了思路。

4.2?微陣列芯片SELEX在適配體篩選中的應(yīng)用

4.2.1?基于溶膠-凝膠的微陣列SELEX技術(shù)篩選適配體?基于微陣列SELEX技術(shù)篩選適配體時(shí)，研究者將蛋白質(zhì)靶標(biāo)包裹于凝膠顆粒內(nèi)，再點(diǎn)樣于微陣列芯片上，可有效維持蛋白質(zhì)的生物活性和空間結(jié)構(gòu)。例如，Park等[58]將包裹有蛋白質(zhì)的凝膠顆粒點(diǎn)樣在微加熱器上，在微混合器的作用下，先后在微陣列芯片上完成寡核苷酸文庫(kù)與靶標(biāo)分子的結(jié)合、洗滌和洗脫等過(guò)程。目前，利用該芯片可同時(shí)實(shí)現(xiàn)5種靶標(biāo)分子適配體的篩選。

溶膠-凝膠顆粒已廣泛用于大分子的捕獲，但將其應(yīng)用于小分子的捕獲時(shí)仍存在一定挑戰(zhàn)，原因在于，若將溶膠-凝膠設(shè)計(jì)為截留小分子，通常會(huì)損害溶膠-凝膠顆粒與常規(guī)基質(zhì)（如微量滴定孔板聚合物）的粘附性[59]。Ahn等[60]基于陽(yáng)極刻蝕技術(shù)和電化學(xué)工藝開(kāi)發(fā)了一種多孔聚苯乙烯（PS）基質(zhì)，該材料可有效錨定多種不同孔徑的溶膠-凝膠顆粒（圖4）。研究者將包裹雙酚A的溶膠-凝膠顆粒固定在PS基質(zhì)上，考察了基于溶膠-凝膠顆粒的微陣列芯片SELEX技術(shù)篩選雙酚A適配體的可行性，為小分子適配體的篩選開(kāi)辟了一條通用途徑。

4.2.2?微陣列耦合微流控的SELEX技術(shù)篩選適配體?微流控芯片技術(shù)能較好地集成靶標(biāo)分子與寡核苷酸文庫(kù)的結(jié)合、洗滌和洗脫等篩選步驟，而微陣列芯片的超高通量的特點(diǎn)也有助于實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)分子適配體的同時(shí)篩選。因此，微陣列耦合微流控的SELEX技術(shù)在適配體篩選中具有更大的優(yōu)勢(shì)，可發(fā)揮更大的作用。

Liu等[61]發(fā)展了一種微陣列耦合微流控芯片的SELEX技術(shù)（Protein microarray integrated with a microfluidic chip，PMM-SELEX），用于篩選蛋白質(zhì)的適配體（圖5）。利用物理俘獲法將靶標(biāo)分子吸附在微陣列芯片的蛇形微通道上，在靶標(biāo)分子與寡核苷酸文庫(kù)結(jié)合后，通過(guò)微陣列芯片掃描技術(shù)檢測(cè)靶標(biāo)分子與寡核苷酸文庫(kù)的結(jié)合情況。研究結(jié)果表明，PMM-SELEX技術(shù)省時(shí)、高效，僅需5輪篩選即可得到對(duì)乳鐵蛋白具有較高親和力（Kd=0.63 nmol/L）的適配體。

Gortrik等[62]通過(guò)將寡核苷酸文庫(kù)固定在微陣列芯片上，篩選出多條適配體候選物，并通過(guò)微流控技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)分別實(shí)現(xiàn)了適配體的分離與測(cè)序，克服了篩選過(guò)程輪次多、鑒定耗時(shí)等缺點(diǎn)。

適配體對(duì)（Aptamer pairs）可同時(shí)識(shí)別靶標(biāo)分子不同表位，有助于增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度和特異性[63]。然而，適配體對(duì)很難通過(guò)篩選得到，因?yàn)樵诔Ｒ?guī)篩選過(guò)程中會(huì)優(yōu)先產(chǎn)生可識(shí)別顯性“熱點(diǎn)”表位的適配體，而熱點(diǎn)表位適配體的確定，對(duì)另一表位的結(jié)合存在一定的阻礙作用[64]。Cho等[65]建立的基于微陣列芯片的適配體對(duì)篩選平臺(tái)（Array-based discovery platform for multivalent aptamers process，AD-MAP）有效克服了這一問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了適配體對(duì)的篩選（圖6）。首先，通過(guò)微流控芯片分離結(jié)合與未結(jié)合靶標(biāo)分子的寡核苷酸;然后，通過(guò)高通量測(cè)序獲得適配體候選物的序列信息，并將這些適配體候選物點(diǎn)樣在陣列芯片上;最后，通過(guò)平行親和力檢測(cè)獲得與靶標(biāo)分子親和性最高的適配體，并將二者形成復(fù)合物，該復(fù)合物可有效阻斷靶標(biāo)分子上的主要結(jié)合位點(diǎn)。將復(fù)合物與微陣列芯片上的適配體候選物共同孵育，即可獲得與蛋白質(zhì)次要表位結(jié)合的適配體。他們通過(guò)AD-MAP平臺(tái)篩選出了一對(duì)能識(shí)別人血管生成素2（Ang 2）不同表位的適配體，該適配體對(duì)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，即使在未稀釋的血清中也能準(zhǔn)確識(shí)別Ang 2的表位。

適配體的發(fā)展與篩選技術(shù)的進(jìn)步密切相關(guān)，目前報(bào)道的適配體篩選技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，尚未形成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的模式。表1對(duì)磁珠SELEX、毛細(xì)管電泳SELEX、微流控芯片SELEX以及微陣列芯片SELEX的篩選輪次數(shù)、單輪篩選時(shí)間，以及各自優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了對(duì)比。

4.2.3?基于微流控及微陣列芯片SELEX技術(shù)的適配體篩選進(jìn)程監(jiān)測(cè)技術(shù)?適配體的篩選過(guò)程必須配合實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)技術(shù)[66]，從而有效地獲得具有更高親和力、更強(qiáng)穩(wěn)定性的適配體。

表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）通過(guò)適配體候選物與靶標(biāo)分子結(jié)合引起的金屬膜表面共振角的改變對(duì)SELEX篩選進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。雖然，利用SPR容易對(duì)適配體候選物與靶標(biāo)分子的結(jié)合情況進(jìn)行評(píng)估，但早期研究發(fā)現(xiàn)，大多情況下，第1輪篩選并未檢測(cè)到SPR信號(hào)的變化[67]，顯然傳統(tǒng)的SPR并不適于高通量檢測(cè)。將金納米顆粒引入SPR的局域表面等離子體共振（Localized surface plasmon resonance，LSPR）可有效增強(qiáng)SPR信號(hào)的輸出。Gifford等[68]使用金納米顆粒增強(qiáng)的SPR成像技術(shù)（Surface plasmon resonance imaging，SPRI）實(shí)現(xiàn)了PCR產(chǎn)物的高靈敏檢測(cè)。與金納米顆粒相比，銀納米顆?？僧a(chǎn)生更強(qiáng)的共振信號(hào)，據(jù)此構(gòu)建的“金核銀殼”結(jié)構(gòu)可更好地監(jiān)測(cè)篩選過(guò)程[69]。Jia等[70]將微流控芯片和SPRI技術(shù)整合至SELEX過(guò)程中，利用十面體銀納米顆粒（Ag10）增強(qiáng)表面等離子體共振信號(hào)強(qiáng)度，完成了對(duì)乳鐵蛋白的適配體的篩選，將檢測(cè)信號(hào)提高了128倍。在后續(xù)的研究中，Jia等[71]利用十面體銀納米顆粒探針（Ag10-NPs-RP15）在實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)SELEX過(guò)程的同時(shí)，消除了因靶標(biāo)分子末端固定導(dǎo)致的其與適配體候選物親和力降低的影響，篩選得到了脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-1（Lipocalin-1）的適配體。

小分子與適配體分子量差異較大，兩者親和力的表征也是難點(diǎn)之一，目前尚無(wú)通用的表征方法。Ahn等[60]將包埋有BPA的溶膠-凝膠顆粒固定在微陣列芯片上，利用熒光素標(biāo)記BPA適配體候選物，與小分子結(jié)合的適配體候選物無(wú)法從溶膠-凝膠顆粒中逃逸，從而可觀察到顆粒的熒光。但是，這種熒光標(biāo)記探針的方式對(duì)適配體的折疊有潛在影響，可能會(huì)進(jìn)一步影響適配體與靶標(biāo)分子的結(jié)合[72]。表征小分子與適配體親和力的另一種方法是反向散射干涉術(shù)（Back scattering interferometry，BSI），即利用激光照射樣品，光束在通道內(nèi)被反射和折射，形成特定的條紋圖案，并由電耦合器件（Charge coupled device，CCD）實(shí)現(xiàn)陣列檢測(cè)。監(jiān)測(cè)過(guò)程中，適配體和靶標(biāo)分子均游離在溶液中，無(wú)需固定和標(biāo)記。Kammer等[73]成功地將該技術(shù)用于抗生素（如替諾福韋、表阿霉素、氨芐青霉素和四環(huán)素）以及激素、神經(jīng)遞質(zhì)等小分子與適配體的親和力表征研究中。

5?總結(jié)與展望

近年來(lái)，適配體篩選技術(shù)有了長(zhǎng)足的發(fā)展，但是，傳統(tǒng)基于磁珠和毛細(xì)管電泳技術(shù)的SELEX方法存在篩選輪次多、篩選周期長(zhǎng)和樣品消耗量大、對(duì)小分子篩選效率低等問(wèn)題。近幾年，研究者利用微流控芯片和微陣列芯片的高通量、低樣品消耗和易集成等特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)了基于微流控芯片和微陣列芯片的SELEX技術(shù)篩選適配體。然而，到目前為止，僅是將篩選環(huán)節(jié)中部分關(guān)鍵步驟（如分離和檢測(cè)等操作單元）轉(zhuǎn)移至芯片上，在芯片上并未實(shí)現(xiàn)所有適配體篩選環(huán)節(jié)。隨著微納米技術(shù)的發(fā)展，利用微流控芯片高集成和微陣列芯片超高通量的特點(diǎn)，未來(lái)SELEX技術(shù)的全部過(guò)程將有可能都在芯片上實(shí)現(xiàn)。因此，將微流控和微陣列芯片與高通量測(cè)序等技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化篩選過(guò)程，將是適配體篩選工作的發(fā)展趨勢(shì)之一。

適配體篩選技術(shù)可從以下幾方面加強(qiáng)研究：（1）增加適配體篩選過(guò)程中的監(jiān)測(cè)手段，如結(jié)合微陣列芯片點(diǎn)陣掃描技術(shù)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，并對(duì)篩選過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化;（2）加強(qiáng)適配體與靶標(biāo)分子結(jié)合的機(jī)理研究，結(jié)合靶標(biāo)分子自身特點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)的作用機(jī)制，合理設(shè)計(jì)適配體序列及結(jié)構(gòu)，提高篩選成功率;（3）加快適配體數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)，除適配體序列、親和性和特異性等信息之外，也應(yīng)該附有最新的篩選技術(shù)信息如微磁技術(shù)的改進(jìn)等，為適配體的篩選提供理論指導(dǎo);（4）努力建立通用型篩選模式，簡(jiǎn)化篩選過(guò)程，如利用微流控芯片易集成的特點(diǎn)，將進(jìn)樣、結(jié)合、洗脫、擴(kuò)增和測(cè)序等技術(shù)集成于多塊甚至是一塊芯片上?？深A(yù)見(jiàn)，隨著新的分離技術(shù)、次級(jí)文庫(kù)制備技術(shù)和監(jiān)測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，適配體的篩選過(guò)程會(huì)變得更加快速、便捷和高效，而適配體也會(huì)在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)、靶向識(shí)別和疾病治療等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

References

1?Li J，F(xiàn)u H E，Wu L J，Zheng A X，Yang H H. Anal. Chem.，2012，84（12）： 5309-5315

2?Jiang B，Li F，Yang C，Xie J，Xiang Y，Yuan R. Anal. Chem.，2015，87（5）： 3094-3098

3?Leung K H，He B Y，Yang C，Leung C H，Wang H M D，Ma D L. ACS Appl. Mater. Interfaces，2015，7（43）： 24046-24052

4?Ellington A D，Szostak J W. Nature，1990，346（6287）： 818-822

5?Tuerk C，Gold L. Science，1990，249（4968）： 505-510

6?Wang C，Liu B，Lu J，Zhang G，Lu A. J. Nanosci. Nanotechnol.，2014，14（1）： 501-512

7?Ilgu M，Nilsen-Hamilton M. Analyst，2016，141（5）： 1551-1568

8?Zhou J，Rossi J. Nat. Rev. Drug Discov.，2017，16（3）： 181-202

9?Chang A L，McKeague M，Liang J C，Smolke C D. Anal. Chem.，2014，86（7）： 3273-3278

10?Ozer A，Pagano J M，Lis J T. Mol. Ther-Nucl. Acids，2014，3（8）： 183-200

11?Zhu C，Wang X，Li L，Hao C，Hu Y，Rizvi A S，Qu F. Biochem. Biophys. Res. Commun.，2018，506（1）： 169-175

12?Sanchez J A，Pierce K E，Rice J E，Wangh L J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2004，101（7）： 1933-1938

13?Avci-Adali M，Paul A，Wilhelm N，Ziemer G，Wendel H P. Molecules，2010，15（1）： 1-11

14?Costa G，Leamon J，Rothberg J，Weiner M. U.S. Patent Application. No.10/767，894. 2004

15?Xiao P，Lv X，Wang S，Iqbal J，Qing H，Li Q，Deng Y. Anal. Biochem.，2013，441（2）： 123-132

16?Zhang J，Lv X F，F(xiàn)eng W，Li X Q，Li K J，Deng Y L. Microchim. Acta，2018，185（8）： 364-371

17?Wang J，Rudzinski J F，Gong Q，Soh H T，Atzberger P J. PLoS One，2012，7（8）： e43940

18?Hünniger T，Wessels H，F(xiàn)ischer C，Paschke-Kratzin A，F(xiàn)ischer M. Anal. Chem.，2014，86（21）： 10940-10947

19?Han B，Zhao C，Yin J，Wang H. J. Chromatogr. B，2012，903： 112-117

20?Zhu C，Yang G，Ghulam M，Li L S，Qu F. Biotechnol. Adv.，2019，37（8）： 9734-9750

21?Li Q，Zhao X，Liu H，Qu F. J. Chromatogr. A，2014，1364： 289-294

22?Luo Z，Zhou H，Jiang H，Ou H，Li X，Zhang L. Analyst，2015，140（8）： 2664-2670

23?Manz A，F(xiàn)ettinger J C，Verpoorte E，Lüdi H，Widmer H，Harrison D J. TrAC-Trend. Anal. Chem.，1991，10（5）： 144-149

24?Li R，Zhang X，Lv X，Geng L，Li Y，Qin K，Deng Y. Anal. Biochem.，2017，539： 48-53

25?Qin K，Lv X，Xing Q，Li R，Deng Y. Anal. Methods，2016，8（12）： 2584-2591

26?Xu J，Lv X，Wei Y，Zhang L，Li R，Deng Y，Xu X. Sens. Actuators B，2015，212： 472-480

27?Zhang C，Lv X，Yasmeen S，Qing H，Deng Y. Anal. Methods，2017，9（24）： 3619-3625

28?Yu L，Li X，Hu X，Yu S，Lv X，Li Q，Deng Y. 2015 8th International Conference on Biomedical Engineering and Informatics （BMEI），2015： 328-332

29?Li J L，Chang K W，Wang C H，Yang C H，Shiesh S C，Lee G B. Biosens. Bioelectron.，2016，79： 887-893

30?Xu Y，Yang X，Wang E. Anal. Chim. Acta，2010，683（1）： 12-20

31?Lou X，Qian J，Xiao Y，Viel L，Gerdon A E，Lagally E T，Atzberger P，Tarasow T M，Heeger A J，Soh H T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2009，106（9）： 2989-2994

32?SOh S，Ahmad K M，Cho M，Kim S，Xiao Y，Soh H T. Anal. Chem.，2011，83（17）： 6883-6889

33?Qian J，Lou X，Zhang Y，Xiao Y，Soh H T. Anal. Chem.，2009，81（13）： 5490-5495

34?Huang C J，Lin H I，Shiesh S C，Lee G B. Biosens. Bioelectron.，2010，25（7）： 1761-1766

35?Ahmad K M，Oh S S，Kim S，McClellen F M，Xiao Y，Soh H T. PloS One，2011，6（11）： e27051

36?Bock L C，Griffin L C，Latham J A，Vermaas E H，Toole J J. Nature，1992，355（6360）： 564-566

37?Green L S，Jellinek D，Jenison R，stman A，Heldin C H，Janjic N. Biochemistry-US，1996，35（45）： 14413-14424

38?Stoltenburg R，Reinemann C，Strehlitz B. Biomol. Eng.，2007，24（4）： 381-403

39?Gill I. Chem. Mater.，2001，13（10）： 3404-3421

40?Livage J，Coradin T，Roux C. J. Phys.Condens.Mat.，2001，13（33）： R673-R691

41?Pastor I，F(xiàn)errer M L，Lillo M P，Gómez J，Mateo C R. J. Phys. Chem. B，2007，111（39）： 11603-11610

42?Kim Y Y，Chae S Y，Kim S，Byun Y，Bae Y H. J. Biomater. Sci. Polym. Edit.，2005，16（12）： 1521-1535

43?Besanger T R，Easwaramoorthy B，Brennan J D. Anal. Chem.，2004，76（21）： 6470-6475

44?Cho E J，Bright F V. Anal. Chem.，2002，74（6）： 1462-1466

45?Rupcich N，Goldstein A，Brennan J D. Chem. Mater.，2003，15（9）： 1803-1811

46?Ahn J Y，Jo M，Dua P，Lee D K，Kim S. Oligonucleotides，2011，21（2）： 93-100

47?Bae H，Ren S，Kang J，Kim M，Jiang Y，Jin M M，Min I M，Kim S. Nucleic Acid Ther.，2013，23（6）： 443-449

48?Huang C J，Lin H I，Shiesh S C，Lee G B. Biosens. Bioelectron.，2012，35（1）： 50-55

49?Hughes T R，Mao M，Jones A R，Burchard J，Marton M J，Shannon K W，Lefkowitz S M，Ziman M，Schelter J M，Meyer M R. Nat. Biotechnol.，2001，19（4）： 342-347

50?Okamoto T，Suzuki T，Yamamoto N. Nat. Biotechnol.，2000，18（4）： 438-441

51?Jain K. Science，2001，294（5542）： 621-623

52?Albala J S. Expert Rev.Mol.Diagn.，2001，1（2）： 145-152

53?Butun S，Sahiner N. Polymer，2011，52（21）： 4834-4840

54?Zhu Q，Trau D. Anal. Chim. Acta，2012，751： 146-154

55?Verpoorte E. Lab Chip，2003，3（4）： 60N-68N

56?Kawaguchi H. Prog. Polym. Sci.，2000，25（8）： 1171-1210

57?Kim J J，Bong K W，Retegui E，Irimia D，Doyle P S. Nat.Mater.，2017，16（1）： 139

58?Park S M，Ahn J Y，Jo M，Lee D K，Lis J T，Craighead H G，Kim S. Lab Chip，2009，9（9）： 1206-1212

59?Ressine A，Ekstrom S，Marko-Varga G，Laurell T. Anal. Chem.，2003，75（24）： 6968-6974

60?Ahn J Y，Lee S，Jo M，Kang J，Kim E，Jeong O C，Laurell T，Kim S. Anal. Chem.，2012，84（6）： 2647-2653

61?Liu X，Li H，Jia W，Chen Z，Xu D. Lab Chip，2017，17（1）： 178-185

62?Gotrik M R，F(xiàn)eagin T A，Csordas A T，Nakamoto M A，Soh H T. Acc. Chem. Res.，2016，49（9）： 1903-1910

63?Lao Y H，Peck K，Chen L C. Anal. Chem.，2009，81（5）： 1747-1754

64?Fitter S，James R. J. Biol. Chem.，2005，280（40）： 34193-34201

65?Cho M，Oh S S，Nie J，Stewart R，Radeke M J，Eisenstein M，Coffey P J，Thomson J A，Soh H T. Anal. Chem.，2014，87（1）： 821-828

66?Tran D T，Knez K，Janssen K P，Pollet J，Spasic D，Lammertyn J. Biosens. Bioelectron.，2013，43： 245-251

67?Dausse E，Barré A，Aimé A，Groppi A，Rico A，Ainali C，Salgado G，Palau W，Daguerre E，Nikolski M. Biosens. Bioelectron.，2016，80： 418-425

68?Gifford L K，Sendroiu I E，Corn R M，Luptk A. J. Am. Chem. Soc.，2010，132（27）： 9265-9267

69?Hobbs K，Cathcart N，Kitaev V. Chem. Commun.，2016，52（63）： 9785-9788

70?Jia W，Li H，Wilkop T，Liu X，Yu X，Cheng Q，Xu D，Chen H Y. Biosens. Bioelectron.，2018，109： 206-213

71?Jia W，Lu Z，Yang H，Li H，Xu D. Anal. Chim. Acta，2018，1043： 158-166

72?Ruscito A，de Rosa M C. Front.Chem.，2016，4： 14

73?Kammer M N，Olmsted I R，Kussrow A K，Morris M J，Jackson G W，Bornhop D J. Analyst，2014，139（22）： 5879-5884