白靜，王會(huì)

1(河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，河南 鄭州，450042)2(河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院 護(hù)理學(xué)院，河南 鄭州，450042)

三聚氰胺[C3N3(NH2)3],俗稱(chēng)密胺，蛋白精，含氮量高達(dá)66.6%，白色無(wú)味，在水中微溶，價(jià)格低，具有低毒性，不能作為添加劑加入到食品中。但是有些不法商販作為“蛋白精”，加入飼料，奶制品，增加產(chǎn)品表現(xiàn)出的蛋白質(zhì)含量，冒充蛋白質(zhì)[1]。研究表明反復(fù)過(guò)量服用三聚氰胺會(huì)導(dǎo)致大頭、腎結(jié)石等多種疾病，危害人體健康[2]。

尿素又名脲，其水溶液呈中性，是有機(jī)氮肥中的一種。在乳及乳制品中摻雜尿素，可以增加乳中的氮含量，進(jìn)而提高蛋白質(zhì)檢測(cè)含量和增加密度。尿素含量測(cè)定在乳制品行業(yè)中具有十分重要的地位，其在乳及乳制品中的含量應(yīng)低于0.70 mg/g[3]。而如果奶粉中的尿素含量超過(guò)正常范圍，也會(huì)導(dǎo)致潰瘍、癌癥、消化不良、胃酸、腎功能疾病等健康問(wèn)題[2]。

目前國(guó)內(nèi)外在測(cè)定奶粉中三聚氰胺和尿素的含量有很多種，如熒光光譜法[4]、近紅外成像技術(shù)[5]、紅外光譜法[6]、拉曼光譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8]、高效液相色譜法[9]、利用非線性化學(xué)指紋圖譜法[10]、同位素稀釋質(zhì)譜法[11]等。國(guó)標(biāo)中規(guī)定測(cè)定奶粉中三聚氰胺和尿素的方法多采用滴定法和高效液相色譜法。

雖然這些方法測(cè)定奶粉中三聚氰胺和尿素的含量具有可行性，但是在其處理方面都有相應(yīng)的缺陷。拉曼光譜法、非線性化學(xué)指紋圖譜法、熒光光譜法檢測(cè)速度快但易受干擾因素影響，成本較高且操作復(fù)雜；同位素稀釋法雖然精密度高，檢出限低，但是對(duì)操作要求過(guò)高，不能進(jìn)行推廣研究。

紅外光譜法對(duì)樣品檢測(cè)無(wú)需進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，建立模型后樣品可在1 min內(nèi)完成檢測(cè)，對(duì)樣品基本無(wú)損耗；分辨率高，但是對(duì)于光譜掃描得到的數(shù)據(jù)龐大，不易分析，因此常將紅外光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)行研究。

本文在研究紅外光譜在奶粉摻三聚氰胺和尿素的應(yīng)用中，結(jié)合二階最小二乘法使用誤差項(xiàng)不相關(guān)的工具變量來(lái)計(jì)算有問(wèn)題的預(yù)測(cè)變量的估計(jì)值，然后通過(guò)計(jì)算值來(lái)估計(jì)因變量的線性回歸模型。與常規(guī)的一元線性回歸相比，該方法能對(duì)復(fù)雜關(guān)系分析其顯著性并能去除異常點(diǎn)增加線性擬合程度[12]，對(duì)于奶粉中三聚氰胺和尿素的監(jiān)控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與樣品

雀巢全家營(yíng)養(yǎng)奶粉市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)；三聚氰胺(純度≥99%)，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；尿素(純度≥99%)，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；KBr(色譜純，純度≥99%)，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

尼高麗紅外光譜儀Nicolet 380FT-IR，馭锘實(shí)業(yè)(上海)有限公司；分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；瑪瑙研缽，湖南力辰儀器有限公司。

1.2 紅外光譜測(cè)定參數(shù)

IR光源，波數(shù)4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1、掃描速度0.632 9 cm/s、掃描次數(shù)32次，掃描之前均需先采集空白背景，紅外光譜儀預(yù)熱30 min以消除外界環(huán)境的影響,提高光譜數(shù)據(jù)的有效信息量[13]。對(duì)光譜數(shù)據(jù)采用平均平滑法進(jìn)行預(yù)處理，選用平滑窗口大小為15，在此條件下能很好地去除各種因素產(chǎn)生的高頻噪聲。樣品數(shù)據(jù)光譜為3次掃描的平均值。每次壓片測(cè)量都需要將ZnSe 晶體、壓片螺母、瑪瑙研缽等用無(wú)水乙醇洗干凈、并置于日光燈下烤干，壓片應(yīng)該透過(guò)性好并無(wú)裂痕。

1.3 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品梯度制備

將稱(chēng)量瓶洗干凈放入烘箱中烘干，用分析天平(精度0.000 1)稱(chēng)取不同質(zhì)量分析純的三聚氰胺和溴化鉀，先將KBr置于研缽中研磨至粉末，再與三聚氰胺以逐步混勻法混勻，得到12個(gè)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的梯度含量，置于稱(chēng)量瓶中標(biāo)記，并按照1.2光譜條件測(cè)定。

1.4 尿素標(biāo)準(zhǔn)品梯度制備

先將稱(chēng)量瓶洗干凈放入烘箱烘干，稱(chēng)取不同質(zhì)量分析純的尿素和KBr，分別將KBr和尿素置于研缽研磨，再將尿素和KBr按照逐步混勻法混勻，得到12個(gè)尿素標(biāo)準(zhǔn)樣品的梯度含量，置于稱(chēng)量瓶中標(biāo)記，并按照1.2光譜條件測(cè)定。

1.5 樣品測(cè)定

稱(chēng)取不同質(zhì)量的三聚氰胺和奶粉，按照逐步混勻法混合均勻，得到3個(gè)摻入三聚氰胺的奶粉偽樣品三聚氰胺含量分別的為2.018 1、4.995 9、8.291 6 g/100g，置于稱(chēng)量瓶中標(biāo)記，并按照1.2光譜條件測(cè)定。同時(shí)依據(jù)GB/T22388—2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法中規(guī)定的高效液相色譜法對(duì)三聚氰胺進(jìn)行測(cè)定。

稱(chēng)取不同質(zhì)量的尿素和奶粉，按照逐步混勻法混合均勻，得到3個(gè)摻入尿素的奶粉摻偽樣品，尿素含量分別為1.574 4、4.409 2、6.452 4 g/100g，置于稱(chēng)量瓶中標(biāo)記，并按照1.2光譜條件測(cè)定。同時(shí)依據(jù)GB/T 21704—2008乳與乳制品中非蛋白質(zhì)含量測(cè)定中規(guī)定的滴定法對(duì)尿素進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 三聚氰胺特征吸收峰確定

圖1 三聚氰胺和奶粉紅外光譜疊加圖Fig.1 Melamine and milk powder infrared spectrum superposition

三聚氰胺和奶粉是物理混合，對(duì)樣品混合的12組三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2.2 尿素特征吸收峰確定

圖2 尿素和奶粉紅外光譜疊加圖Fig.2 Infrared spectrum superposition diagram of urea and milk powder

由于尿素和奶粉是物理混合，對(duì)樣品混合的12組尿素標(biāo)準(zhǔn)品掃描后的紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

對(duì)比尿素和奶粉紅外光譜疊加圖可以看出,尿素在538、1 157、1 450、1 628、1 655、3 350、3 418、3 470 cm-1處吸光度大，比較奶粉紅外光譜圖可知在1 628、1 655、3 350、3 418、3 470 cm-1四個(gè)點(diǎn)處吸光度較弱，并且隨著尿素含量的增大，吸光度在此4個(gè)點(diǎn)逐漸增大，符合朗伯比爾定律，因此對(duì)這4處吸收峰進(jìn)行回歸分析，進(jìn)而進(jìn)一步確定最佳特征吸收峰進(jìn)行定量分析。

2.3 奶粉摻三聚氰胺模型建立及回歸分析

三聚氰胺特征吸收峰為732、1 551 cm-1，按照1.2光譜條件進(jìn)行的紅外光譜分析數(shù)據(jù)如表1所示。根據(jù)表1對(duì)三聚氰胺在732、1 551 cm-1處吸光度進(jìn)行定量分析，建立一元線性回歸方程后發(fā)現(xiàn)在732 cm-1線性相關(guān)性為0.930 3，在1 551 cm-1線性相關(guān)性為0.993 3，因此選取1 551 cm-1為三聚氰胺特征吸收峰。

由表1可知，三聚氰胺的含量和1 551 cm-1吸光度呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)關(guān)系，關(guān)系式如公式(1)所示：

Y=ax+b+c

(1)

式中：Y表示1 551 cm-1吸光度；x表示三聚氰胺的含量；c表示其他因素對(duì)吸光度的影響總和，比如KBr的質(zhì)量、或者奶粉樣品的品種、噪聲對(duì)吸收峰的影響等，一般認(rèn)為他們是相互獨(dú)立且服從正態(tài)分布的隨機(jī)變量。

表1 三聚氰胺特征吸收峰含量和吸光度Table 1 Characteristic absorption peak lontent and absorbance of melamine

通過(guò)SPSS軟件讀取表1中三聚氰胺含量(工具變量)，1 551 cm-1吸光度(因變量)，KBr質(zhì)量(解釋變量)進(jìn)行二階最小二乘分析同時(shí)繪制出三聚氰胺含量和1 551 cm-1吸光度的散點(diǎn)圖(圖3)，得到復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.999 0，ANOVA(方差分析)表格中統(tǒng)計(jì)檢定值F為11.456，sig(顯著性)為0.007,說(shuō)明三聚氰胺含量對(duì)吸光度影響顯著(sig小于0.05說(shuō)明回歸效應(yīng)顯著，回歸方程成立)，存在回歸關(guān)系；系數(shù)表格中雖然KBr質(zhì)量對(duì)應(yīng)sig為0.007，但是對(duì)應(yīng)統(tǒng)計(jì)檢定值t(發(fā)生幾率)為-3.385，說(shuō)明溴化鉀質(zhì)量對(duì)三聚氰胺含量和吸光度無(wú)影響。

圖3 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品原始數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter plot of original data of melamine standard

應(yīng)用SPSS進(jìn)行回歸分析得到回歸標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)計(jì)值和回歸標(biāo)準(zhǔn)化殘差圖如圖4，由圖4可以看出，大部分點(diǎn)殘差在-2～+2，說(shuō)明回歸方程顯著，但是S3點(diǎn)回歸標(biāo)準(zhǔn)化殘差值在+2～+3，標(biāo)準(zhǔn)化殘差異常，因此應(yīng)該去除S3進(jìn)行建立線性模型，以三聚氰胺含量(g/100g)作為橫坐標(biāo)，以吸光度作為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)得y=0.219 7x+0.700 4，R2=0.999 2，檢出限為0.744 2～3.986 1 g/100g。

圖4 三聚氰胺回歸標(biāo)準(zhǔn)化殘差圖Fig.4 Melamine regression standardized residual plot

圖5 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品線性擬合圖Fig.5 Melamine standard linear fitting diagram

2.4 奶粉摻尿素模型建立及回歸分析

對(duì)尿素在1 628、1 655、3 350、3 418、3 470 cm-1四個(gè)特征吸收峰進(jìn)行定量分析，按照1.2光譜條件進(jìn)行的紅外光譜分析數(shù)據(jù)如表2所示，建立回歸方程后比較可得5個(gè)峰值線性相關(guān)度分別為0.872 1、0.909 2、0.774 9、0.856 7、0.856 5，因此選取1 655 cm-1作為奶粉摻加尿素的特征吸收峰進(jìn)行定量分析。

表2 尿素特征吸收峰和吸光度Table 2 Characteristic absorption peak and absorbance of urea

由表2可知，三聚氰胺的含量和1 551 cm-1吸光度呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)關(guān)系，關(guān)系式如公式(2)所示：

Y=ax+b+c

(2)

式中：Y表示1 551 cm-1吸光度；x表示三聚氰胺的含量；c表示其他因素對(duì)吸光度的影響總和，比如KBr的質(zhì)量、或者奶粉樣品的品種、噪聲對(duì)吸收峰的影響等，一般認(rèn)為他們是相互獨(dú)立且服從正態(tài)分布的隨機(jī)變量。

通過(guò)SPSS軟件讀取表1中尿素含量(解釋變量)，1 655 cm-1吸光度(因變量)，KBr質(zhì)量(工具變量)進(jìn)行最小二乘分析同時(shí)繪制出尿素含量和1 655 cm-1吸光度的散點(diǎn)圖(圖6)，得到復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.954，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)為0.999 3，ANOVA表格中sig為0.168，統(tǒng)計(jì)檢定值F為2.207，說(shuō)明尿素含量和吸光度呈現(xiàn)線性正相關(guān)，表格中溴化鉀質(zhì)量對(duì)應(yīng)sig為0.68，說(shuō)明KBr質(zhì)量對(duì)尿素含量無(wú)影響。

圖6 尿素標(biāo)準(zhǔn)品原始數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖Fig.6 Scatterplot of raw data for urea reference

應(yīng)用SPSS進(jìn)行回歸分析得到回歸標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)計(jì)值和回歸標(biāo)準(zhǔn)化殘差圖如圖7，由圖7可知，大部分點(diǎn)殘差在-2～+2，說(shuō)明回歸方程顯著，但是N1點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化殘差值在+2～+3，因此去除N1進(jìn)行線性擬合建模，以尿素含量(g/100g)為橫坐標(biāo)，以1 655 cm-1吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖8)，為y=0.089 5x+0.390 8，R2=0.999 3，由于N1號(hào)樣品吸光度異常，故檢出限為0.042 5～1.729 0 g/100 g。

圖7 尿素回歸標(biāo)準(zhǔn)化殘差圖Fig.7 urea regression standardized residual plot

圖8 尿素標(biāo)準(zhǔn)品線性擬合圖Fig.8 A linear fitting diagram of urea standards

2.5 奶粉摻三聚氰胺精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

取高效液相色譜法測(cè)定摻偽含量為2.018 1 mg/100g樣品1份，按照1.2分析條件進(jìn)行紅外光譜測(cè)定，平行測(cè)定3次，再將三聚氰胺摻偽特征峰處吸光度代入各自回歸分析方程中進(jìn)行測(cè)定得出其摻偽含量計(jì)算絕對(duì)誤差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確度用絕對(duì)誤差表示，精密度用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示[15]，計(jì)算結(jié)果如表3所示。

表3 三聚氰胺精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Precision test results of melamine

2.6 奶粉摻三聚氰胺結(jié)果計(jì)算及加標(biāo)回收率

將1.4配制的奶粉摻偽三聚氰胺梯度樣品S1、S2、S3，按照1.2光譜條件進(jìn)行分析，并將1 551 cm-1吸收峰帶入回歸方程中計(jì)算摻偽含量并計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果如表4所示。

表4 三聚氰胺加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Experimental results of melamine spiked recovery rate

2.7 奶粉摻三聚氰胺重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取含量為2.018 1 g/100g三聚氰胺，在間隔1、3、5天對(duì)3個(gè)樣品按照1.2紅外光譜條件進(jìn)行測(cè)量，再將三聚氰胺摻偽1 551 cm-1處吸光度代入回歸分析方程中進(jìn)行測(cè)定得出其摻偽濃度計(jì)算精密度，結(jié)果如表5所示。

表5 三聚氰胺重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Reproducibility test results of melamine

2.8 奶粉摻尿素精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

取滴定法法測(cè)定摻偽含量為1.574 4 g/100g樣品1份，按照1.2分析條件進(jìn)行紅外光譜測(cè)定，平行測(cè)定3次，再將其特征峰處吸光度代入回歸分析方程中進(jìn)行測(cè)定得出其摻偽含量并計(jì)算準(zhǔn)確度和精密度[16]，結(jié)果如表6所示。

表6 尿素精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Precision test results of urea

2.9 奶粉摻尿素結(jié)果計(jì)算及加標(biāo)回收率

將配制的奶粉摻偽尿素梯度樣品按照1.2光譜條件進(jìn)行分析，并將1 655 cm-1吸收峰帶入回歸方程中計(jì)算摻偽濃度并計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果如表7所示。

表7 尿素加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Experimental results of urea standard addition recovery rate

2.10 奶粉摻尿素重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取尿素含量為1.574 4 g/100g摻偽樣品，在間隔1、3、5 d對(duì)樣品按照1.2紅外光譜條件進(jìn)行測(cè)量，再將尿素?fù)絺? 655 cm-1處吸光度代入尿素回歸分析方程中進(jìn)行測(cè)定得出其摻偽濃度計(jì)算精密度，結(jié)果如表8所示。

表8 尿素重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 8 Results of urea reproducibility experiment

3 結(jié)論

通過(guò)奶粉和三聚氰胺和尿素紅外光譜圖官能團(tuán)分析，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度的三聚氰胺圖譜確定特征吸收峰，通過(guò)SPSS軟件回歸分析和最小二乘法優(yōu)化處理建立三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線，為y=0.219 7x+0.700 4，線性相關(guān)性為0.999 2，最低檢出限為0.744 2 g/100g，精密度RSD=0.50%，重現(xiàn)性RSD=3.12%，回收率為100.21%。尿素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.089 5x+0.390 8，線性相關(guān)性為0.999 3，最低檢出限為0.042 5 g/100g，精密度RSD=1.56%，重現(xiàn)性RSD=3.51%，回收率為99.66%。結(jié)果表明，此方法與國(guó)標(biāo)法相比可以很好的用于奶粉中三聚氰胺和尿素的定量分析，實(shí)現(xiàn)三聚氰胺和尿素快速無(wú)損檢測(cè)。