魏春豪，遲海，楊光昕，陶樂(lè)仁

1(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院， 上海, 200093)2(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所， 上海, 200090)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，VP)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌, 常存在于沿海環(huán)境及水產(chǎn)品中，是沿海地區(qū)的一種高發(fā)性食源性致病菌[1-3]。食用VP污染的食物可能會(huì)引起腹瀉、惡心、嘔吐、急性腸胃炎，重癥患者表現(xiàn)為脫水、休克甚至死亡[4-5]，隨著全球變暖以及VP生長(zhǎng)條件改善，在中國(guó)、日本、東南亞爆發(fā)了多次因誤食VP污染的食物而造成的死亡安全事件[6]。VP的污染和增殖已經(jīng)成為了水產(chǎn)品檢測(cè)與監(jiān)管的關(guān)鍵因素之一。目前對(duì)VP的檢測(cè)主要依據(jù)并遵守GB4789.7—2013[7-8]，該方法雖然較為成熟可靠，但是操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而基于分子擴(kuò)增手段的檢測(cè)方法，如傳統(tǒng)PCR技術(shù)[9]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、熒光定量PCR、多重PCR等[10-13]，有效克服了上述缺點(diǎn)，且方法特異性好、靈敏度高，但這些方法對(duì)檢測(cè)設(shè)備和技術(shù)人員要求較高，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速、批量檢測(cè)。

酶聯(lián)免疫吸附法是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)和酶的高效催化性質(zhì)結(jié)合起來(lái)的一種分析檢測(cè)方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于VP的檢測(cè)[14-15]。謝曼曼等[16]用甲醛滅活VP免疫小鼠成功制備單抗，雖然特異性較強(qiáng)但是靈敏度較差；SAKATA等[17]使用2種針對(duì)VP-F0F1-ATP合成酶的單克隆抗體制備免疫層析試紙，實(shí)現(xiàn)VP的快速檢測(cè)，覆蓋率高，但存在交叉反應(yīng)；LIU等[18]基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移原理建立熒光免疫檢測(cè)法，檢測(cè)限低至10 CFU/mL，無(wú)需預(yù)富集，適用于檢測(cè)實(shí)際食品樣品中的VP，但這類方法穩(wěn)定性相對(duì)較差。本研究通過(guò)熱滅活VP免疫大白兔制備了效價(jià)高、特異性好的多克隆抗體，并建立和優(yōu)化了檢測(cè)VP的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，ic-ELISA)方法。利用該方法檢測(cè)實(shí)際水樣中的VP，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法結(jié)果一致，方法為進(jìn)一步研究VP的快速檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

副溶血性弧菌ATCC17802(V.parahaemolyticusATCC17802)，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；霍亂弧菌53105(V.cholera53105)、創(chuàng)傷弧菌ATCC27562(V.vulnificus27562)、金黃色葡萄球菌LMGT3242(StaphylococcusaureusLMGT3242)、單增李斯特菌LMGT2813(ListeriamonocytogenesLMGT2813)、蠟樣芽孢桿菌LMGT2805(BacillussubtilisLMGT2805)、傷寒沙門(mén)氏菌LMGT8004(SalmonellaentericaLMGT8004)、大腸桿菌LMGT3704(EscherichiacoliLMGT3704)、糞腸球菌LMGT3355(EnterococcusfaecalisLMGT3355)、銅綠假單胞菌LMGT8020(PseudomonasaeruginosaLMGT8020),均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 材料與試劑

純種新西蘭大白兔，上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、脫脂奶粉，Sigma公司；胰蛋白胨(tryptone)、酵母提取物，英國(guó)OXIOD；TCBS肉湯，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；羊抗兔IgG-HRP，上海索萊寶科技有限公司；明膠、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、卵清蛋白(ovalbumin，OVA)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。本實(shí)驗(yàn)所用其他生物試劑純度均大于98%，化學(xué)試劑均為分析純及以上純度。

Multiskan MK3酶標(biāo)儀，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；YXQ-LS-SLL立式壓力蒸汽滅菌器、酶標(biāo)板，上海生工生物工程有限公司。

1.3 多克隆抗體的制備

1.3.1 菌株培養(yǎng)和VP免疫原的制備

新購(gòu)進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)菌株VP17802用LB培養(yǎng)基37 ℃有氧培養(yǎng)12 h，于TCBS平板上劃線分離觀察菌落形態(tài)，挑取典型的VP單菌落進(jìn)行培養(yǎng)并保存。將過(guò)夜培養(yǎng)的VP在滅菌鍋中121 ℃滅活15 min后4 000 r/min離心10 min，用生理鹽水洗脫沉淀3次，最后用生理鹽水將菌液濃度調(diào)整為2×108CFU/mL保存?zhèn)溆?。分別取免疫原與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑按1∶1體積比裝入試管中混勻備用。

1.3.2 免疫方法與血清效價(jià)測(cè)試

以熱滅活VP為免疫原，采用小劑量多部位交替注射的方式進(jìn)行免疫，實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)共計(jì)進(jìn)行9次免疫注射，初次免疫3周后，每2周進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫，免疫部位交替選取頸部和大腿[19]。具體免疫方法如表1所示。第3次免疫后1周，由耳靜脈處取血液2 mL，并用間接ELISA法進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)；此后每隔2周取1次血，用于效價(jià)測(cè)試。

1.4 抗血清的純化和抗體蛋白濃度測(cè)定

當(dāng)效價(jià)達(dá)到適當(dāng)水平后終止免疫，頸部動(dòng)脈取全血，采用硫酸鹽沉淀法純化抗血清。將純化后的抗體用PBS稀釋至適當(dāng)濃度，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量VP抗體在260、280 nm處的OD值，通過(guò)公式(1)計(jì)算純化后的抗體蛋白質(zhì)量濃度：

CIgG/(g·L-1)=1.45×OD280-0.74×OD260

(1)

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫方案Table 1 Immunization program of experimental animals

注：-表示無(wú)

1.5 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

抗原抗體結(jié)合反應(yīng)受多種因素影響，本實(shí)驗(yàn)考察了包被原和抗體反應(yīng)濃度，封閉液種類以及酶標(biāo)二抗?jié)舛葘?duì)ic-ELISA檢測(cè)方法的影響。

1.5.1 抗原抗體濃度的優(yōu)化

采用棋盤(pán)法優(yōu)化包被原和抗體工作濃度。在包被階段，用CBS(磷酸鹽緩沖液)將包被原稀釋一系列濃度梯度，每個(gè)濃度做3次平行；在抗原抗體反應(yīng)時(shí)，用PBS將抗體稀釋一系列梯度濃度，研究不同濃度下抗原抗體反應(yīng)情況。

1.5.2 封閉液的選擇

在ELISA分析實(shí)驗(yàn)中，常用的封閉液主要有BSA、明膠、OVA、脫脂奶粉等。本實(shí)驗(yàn)選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉、0.5%明膠、1% OVA、1% BSA作為封閉液，研究不同封閉液條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，并選出最佳封閉液。

1.5.3 酶標(biāo)二抗?jié)舛鹊膬?yōu)化

在抗體與二抗反應(yīng)階段，用PBS溶液將酶標(biāo)二抗分別稀釋4個(gè)濃度，分別為500、1 000、1 500和2 000 倍，研究不同二抗?jié)舛葘?duì)實(shí)驗(yàn)的影響，并選擇最佳工作濃度。

1.6 ic-ELISA方法的建立

用CBS將熱滅活VP稀釋至一定濃度，加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100 μL，37 ℃包被1 h；倒掉包被液，每孔加入200 μL PBST，洗滌3次后每孔加入200 μL封閉液， 37 ℃封閉1 h；PBST洗板后，用PBS將抗體和競(jìng)爭(zhēng)物稀釋至適當(dāng)濃度，每孔加入 50 μL競(jìng)爭(zhēng)物、50 μL抗體，陰性對(duì)照孔加入50 μL陰性血清和50 μL的PBS緩沖液，空白對(duì)照孔加入100 μL PBS稀釋液，37 ℃溫育1 h；PBST洗板后，用PBS將二抗羊抗兔IgG-HRP稀釋，每孔100 μL加入酶標(biāo)板中，保鮮膜密封，37 ℃溫育1 h；用PBST洗板5次，甩干。每孔加入100 μL新鮮配制的顯色液，室溫下反應(yīng)15 min；每孔加入50 μL終止液，酶標(biāo)儀讀取450和630 nm的吸光度。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用PBS將VP標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋(107、 5×106、 106、 5×105、 105、 5×104CFU/mL)，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，采用 ic-ELISA法分析測(cè)定，依據(jù)吸光度計(jì)算各濃度樣品對(duì)抗體的抑制率。其中不添加競(jìng)爭(zhēng)物的空白孔OD值為A0，添加VP標(biāo)準(zhǔn)品的孔OD值為A。每個(gè)VP標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，取平均OD值計(jì)算抑制率，抑制率/%=(1-A/A0)×100，并以其為縱坐標(biāo)，以VP標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫A坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)線性回歸方程計(jì)算檢測(cè)下限濃度IC15，即抑制率為15%時(shí)所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

1.8 抗體特異性分析

分別以5株副溶血性弧菌與12株非副溶血性弧菌作為抗體和包被原的競(jìng)爭(zhēng)物，用公式(2)分別計(jì)算其對(duì)抗體的交叉反應(yīng)率(cross-reactivity，CR)。

(2)

式中：IC50VP和IC50Com分別為抑制率為50%時(shí)VP與競(jìng)爭(zhēng)物的濃度。

1.9 樣品檢測(cè)

采集的水樣品來(lái)自于上海市水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)中魚(yú)、貝暫養(yǎng)池以及東海研究所實(shí)驗(yàn)室用水，樣品處理方法參考WU等[20]的方法。將水樣過(guò)0.45 μm膜后添加一定濃度的VP菌液進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。將處理好的實(shí)際樣品及加標(biāo)樣品分別用ic-ELISA和國(guó)標(biāo)法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比2種方法的測(cè)定結(jié)果，評(píng)價(jià)ic-ELISA方法的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 間接ELISA檢測(cè)多克隆抗體效價(jià)

以熱滅活VP免疫2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)兔子，采用間接ELISA測(cè)試血清效價(jià)。如圖1所示，隨著免疫次數(shù)的增加，血清效價(jià)顯著上升，3只兔子血清效價(jià)都達(dá)到了90 000，但是到達(dá)第8次免疫時(shí)，2號(hào)、4號(hào)兔子血清上升緩慢，3號(hào)兔子抗血清有下降趨勢(shì)，因此在第9次加強(qiáng)免疫后考慮取血收獲抗血清。

圖1 抗血清效價(jià)趨勢(shì)圖Fig.1 The trend chart of serum titer

2.2 多克隆抗體蛋白質(zhì)含量測(cè)定

將抗體稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，分別測(cè)量其在260 nm和280 nm的OD值，通過(guò)公式(1)計(jì)算純化后抗體的蛋白質(zhì)量濃度為14.24 g/L。

2.3 ic-ELISA實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.3.1 抗原抗體濃度的優(yōu)化

抗原抗體結(jié)合反應(yīng)遵循一定的量比關(guān)系，只有在兩者比例相當(dāng)時(shí)，反應(yīng)最徹底，形成的免疫復(fù)合物最多。本實(shí)驗(yàn)采用棋盤(pán)法對(duì)抗原抗體的濃度進(jìn)行優(yōu)化，選擇OD450值接近1.0的反應(yīng)體系所對(duì)應(yīng)的抗原抗體濃度為最佳抗原抗體濃度。結(jié)果顯示，當(dāng)包被原稀釋100倍(106CFU/mL)，抗體稀釋比例在64 000時(shí)，OD450值接近1.0，抗原抗體反應(yīng)更充分(表2)。

表2 檢測(cè)VP的間接ELISA中包被原、抗體濃度的優(yōu)化Table 2 The optimization of coating antigen and antibody concentration for VP detection by indirect ELISA

2.3.2 二抗?jié)舛鹊膬?yōu)化

在以上優(yōu)化好的抗原抗體稀釋比例條件下，以106CFU/mL的活菌作為競(jìng)爭(zhēng)物，將二抗羊抗兔IgG-HRP分別進(jìn)行1∶500、1∶1 000、1∶1 500、1∶2 000稀釋，對(duì)二抗?jié)舛葍?yōu)化。根據(jù)抑制率和OD空白選擇最佳二抗?jié)舛取Ｓ蓤D2可知當(dāng)二抗稀釋1 000倍時(shí)抑制率最大且OD空白最低，因此選擇該濃度為最佳二抗?jié)舛取?/p>

圖2 檢測(cè)VP的ic-ELISA中羊抗兔IgG-HRP濃度的優(yōu)化Fig.2 The optimization of goat anti-rabbit IgG-HRP concentration for VP detection by ic-ELISA

2.3.3 封閉液的選擇

封閉液的使用可以有效減少ELISA中的非特異性結(jié)合，降低背景值。通過(guò)比較不同封閉液所得的抑制率和OD空白，以最大抑制率和最低OD空白選取最優(yōu)封閉液。如圖3所示，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%明膠為封閉液時(shí)抑制率最高且背景值最低，因此選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%明膠為最佳封閉液。

圖3 檢測(cè)VP的ic-ELISA中最佳封閉液的選擇Fig.3 The Selection of the blocking buffer for VP detection by ic-ELISA

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

建立了 ic-ELISA 檢測(cè)VP的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該法的線性范圍為5×104～107CFU/mL，線性回歸方程為y= 0.21x-0.74(R2= 0.99)，IC50為106CFU/mL，最低檢出限IC15為1.7×104CFU /mL。通過(guò)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，得板間變異系數(shù)為4.71%～8.74%，板內(nèi)變異系數(shù)為2.61%～4.15%，表明該法具有良好的穩(wěn)定性。

圖4 基于ic-ELISA檢測(cè)VP的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve for detection of VP by ic-ELISA

2.5 抗體特異性分析

免疫原是獲取高特異性抗體關(guān)鍵。VP具有多個(gè)抗原決定簇，實(shí)驗(yàn)中直接以滅活VP為免疫原。為保證抗體的特異性，在制備免疫原過(guò)程中注意無(wú)菌操作，防止其他菌污染免疫原；免疫過(guò)程中注意兔子的健康狀況，防止感染其他致病菌，在體內(nèi)產(chǎn)生非特異性抗體。

用ic-ELISA 分析多克隆抗體與常見(jiàn)致病菌的交叉反應(yīng)，結(jié)果如表3所示，所得抗體與5株副溶血性弧菌均能結(jié)合，與V.cholerae、V.vulnificus、V.fluvialis的交叉反應(yīng)率接近10%，而與其他菌株交叉反應(yīng)率在0.3%以下，表明該抗體對(duì)VP具有較高的特異性。

表3 抗體與細(xì)菌反應(yīng)譜Table 3 Specmcity of monoelonal antibodies

2.6 樣品檢測(cè)

采集的樣品分別來(lái)自市場(chǎng)中魚(yú)、貝暫養(yǎng)池和實(shí)驗(yàn)室用水，樣品經(jīng)預(yù)處理后分別用ic-ELISA和平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)(表4)。結(jié)果顯示，ic-ELISA對(duì)樣品的檢測(cè)結(jié)果均為未檢出；平板計(jì)數(shù)法對(duì)市場(chǎng)上采集的水樣檢出VP濃度均為1 CFU/mL，實(shí)驗(yàn)室用水VP為未檢出。依照國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)，2種方法檢測(cè)結(jié)果一致，所有樣品均為陰性樣品。

為了考察方法的準(zhǔn)確性，將樣品過(guò)濾后加入7.5×104CFU/mL濃度的VP，用建立的ic-ELISA進(jìn)行加標(biāo)水樣檢測(cè)。結(jié)果顯示，3種水樣的加標(biāo)檢驗(yàn)均為陽(yáng)性結(jié)果，與平板計(jì)數(shù)法結(jié)果一致。由此表明新方法具有較高的可靠性，而且整個(gè)ic-ELISA檢測(cè)樣品的時(shí)間約為5 h，相比于國(guó)標(biāo)方法大幅縮短了檢測(cè)時(shí)間，可以用于實(shí)際樣品中VP的快速分析檢測(cè)。

表4 ic-ELISA法分析水樣中的副溶血性弧菌Table 4 Analysis of VP in the water samples by ic-ELISA

注： +表示陽(yáng)性；-表示陰性

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以熱滅活副溶血性弧菌免疫新西蘭大白兔成功制備抗VP多克隆抗體，并建立了檢測(cè)VP的 ic-ELISA 分析方法，優(yōu)化了抗原抗體濃度、封閉液等實(shí)驗(yàn)條件，選擇包被原稀釋倍數(shù) 100、抗體稀釋倍數(shù)64 000，二抗稀釋倍數(shù)1 000，封閉液為0.5%的明膠為最佳實(shí)驗(yàn)條件，該方法的檢出限為1.7×104CFU/mL，本方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、廉價(jià)實(shí)用等特點(diǎn)，對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法一致，具有較好的準(zhǔn)確性，該方法有望開(kāi)發(fā)成試劑盒用于食品實(shí)際樣品中VP的檢測(cè)。