張慶芳，王浚晨，于爽，劉春瑩，遲雪梅，遲乃玉

(大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連，116622)

尿酸是人體嘌呤代謝的最終產(chǎn)物，很難被排出體外，如果在體內(nèi)大量積累會(huì)引發(fā)高尿酸血癥，長期保持在高濃度將會(huì)進(jìn)一步引發(fā)通風(fēng)等疾病。隨著人們生活水平日益提高，人們?nèi)粘z入的牛肉、海鮮等高嘌呤食品也不斷增多，痛風(fēng)的患病率逐年上升。尿酸氧化酶能夠有效催化尿酸降解生成尿囊素和CO2，使之在人體內(nèi)快速降解。而人體自身無法合成尿酸酶，只能靠外界的攝入。自然來源的尿酸酶最早在牛胃中發(fā)現(xiàn)[1]，隨后從微生物中發(fā)現(xiàn)的尿酸酶被陸續(xù)報(bào)道。依靠繁殖快、產(chǎn)量大等特點(diǎn)，微生物很快成為尿酸酶的主要來源。

尿酸酶因其能夠快速降解尿酸的作用，很早便被用作醫(yī)藥用酶[2-4]。近年來，國內(nèi)外針對(duì)尿酸酶的應(yīng)用與研究也在不斷深入。在臨床檢測上，尿酸酶可以用來制備尿酸檢測試劑盒以供相關(guān)病患預(yù)防痛風(fēng)等疾??；在臨床治療上，尿酸酶可以直接供高尿酸患者注射，有效降低尿酸濃度；在食品生產(chǎn)方面，尿酸酶亦可以用作食品添加劑專供高尿酸患者食用。根據(jù)早年報(bào)道，尿酸酶已經(jīng)成功在乳酸菌、釀酒酵母等食用菌株中異源表達(dá)[5]，對(duì)微生物發(fā)酵工業(yè)有重要意義。

人體每天排出的尿酸，2/3從尿液中排泄，另外1/3則由腸道分解消化[6]。腸道吸收尿酸由腸道菌群參與代謝調(diào)控，腸道微生態(tài)環(huán)境在人體微生態(tài)系統(tǒng)中最為龐大，其含有的細(xì)菌種類繁多[7]。痛風(fēng)患者的腸道菌群，由于受到高濃度尿酸的影響，相對(duì)于正常人存在失調(diào)現(xiàn)象,主要表現(xiàn)為產(chǎn)尿酸酶菌株增多，乳桿菌和雙歧桿菌減少[8]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)從痛風(fēng)患者糞便中篩選得到產(chǎn)尿酸氧化酶細(xì)菌，并對(duì)其菌株種類進(jìn)行16S rDNA鑒定，最后對(duì)其產(chǎn)生的尿酸酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，旨在針對(duì)功能性尿酸酶的開發(fā)與研究做出突破，得到高產(chǎn)尿酸氧化酶菌株，為日后尿酸酶的發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

選擇1名痛風(fēng)患者新鮮糞便為樣品；

尿酸、酵母膏、NaCl、MgSO4、K2HPO4、KH2PO4、瓊脂、上海生工。

1.1.2 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基(g/L)：尿酸5，酵母膏0.5，NaCl 0.5，MgSO40.5，K2HPO42.0，KH2PO40.5，瓊脂20，pH 7.5；

復(fù)篩培養(yǎng)基(g/L)：尿酸5，酵母膏0.5，NaCl 0.5，MgSO40.5，K2HPO42.0，KH2PO40.5，pH 7.5；

菌株保藏培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏3，蛋白胨5，NaCl 0.1，MgSO40.5，K2HPO42.0，KH2PO40.5，瓊脂20，pH 7.5。

1.1.3 儀器與設(shè)備

HZC-250雙層恒溫振蕩培養(yǎng)箱，北京佳源興業(yè)科技有限公司；WS-300恒溫培養(yǎng)箱，北京金達(dá)陽光科技有限公司；DK98-1水浴鍋，北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司；KL-14105鼓風(fēng)干燥箱，上?？道噬锟萍加邢薰荆籋BS-1906A酶標(biāo)儀，上海研卉生物科技有限公司；YXQ-LS-75A壓力蒸汽滅菌鍋，北京佳源興業(yè)科技有限公司；Sorvall ST 8臺(tái)式離心機(jī)，北京昊諾斯科技有限公司；ELITE 300電泳儀，北京銘泰佳信科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株初篩

準(zhǔn)備250 mL錐形瓶1個(gè)，取少量患者糞便置于瓶內(nèi)，倒入100 mL無菌水振蕩混勻。隨后將混勻后的樣品進(jìn)行梯度稀釋，分別涂布于初篩培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)，隨時(shí)觀察菌落形態(tài)與透明圈大小，挑選合適菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.2 菌株復(fù)篩

將初篩得到的不同菌株分別接種于100 mL復(fù)篩培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件設(shè)置為37 ℃，120 r/min培育36 h，隨后對(duì)菌液進(jìn)行酶活檢測，方法參考1.2.4，挑選出酶活最高的菌株。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將篩選得到的菌株接種于固體培養(yǎng)基(同初篩培養(yǎng)基)上，37 ℃劃線培養(yǎng)24 h，得到單菌落；標(biāo)記單菌落，并觀察其菌落形狀、大小及顏色；利用接種環(huán)挑取合適菌株，通過革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡(10×100)下觀察其形狀、排列及顏色，對(duì)其分類鑒定。

1.2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

將篩選后的菌株進(jìn)行16S rDNA基因擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因測序，測序工作由上海生工完成；將測序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用軟件MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 酶活鑒定

1.2.4.1 制備粗酶液

將菌株置于發(fā)酵培養(yǎng)基(同復(fù)篩培養(yǎng)基)中培育36 h、37 ℃、120 r/min，取菌液12 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，將濕菌洗滌3次以上。利用超聲波破碎，參數(shù)設(shè)定為100 mL樣品，功率300 W，破碎時(shí)間3 s，間隔時(shí)間2 s，總時(shí)間15 min。將破碎得到的產(chǎn)物12 000 r/min離心15 min，提取上清液即粗酶液。

1.2.4.2 酶活測定方法

取150 μL 4-AAP(30 mmol/L)，100 μL TBHBA(1 mmol/L)，50 μL過氧化物酶(15 U/mL)，加入到25 mL比色管中，40 ℃預(yù)熱10 min，再加入粗酶液100 μL，600 μL硼酸鹽緩沖液(pH 8.4，0.1 mol/L)，0.2 g尿酸，去離子水定容至20 mL，分裝至96孔板，在540 nm處觀察吸光度的變化[9]?？瞻讓?duì)照為硼酸鹽緩沖液。

酶活單位定義為37 ℃測定條件下，1 min催化產(chǎn)生1 μmol H2O2的酶量為1個(gè)酶活單位。

1.2.5 酶的分離純化

離心破碎后得到粗酶液，通過70%飽和(NH4)2SO4進(jìn)行鹽析沉淀，4 ℃條件下過夜[10]，隨后經(jīng)過透析袋，轉(zhuǎn)移到10 kDa超濾管中離心超濾；將超濾后的酶液進(jìn)行Sephadex G-100 凝膠過濾層析，在每個(gè)洗脫峰處進(jìn)行收集，分別檢測樣管酶活，收集酶活連續(xù)升高至降低的所有樣管即為純化后的尿酸氧化酶；最后通過SDS-PAGE電泳檢測純化后的產(chǎn)物，觀察分析其電泳條帶，并測定酶活大小，計(jì)算純化倍數(shù)。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.6.1 最適作用溫度

收集一定量酶液，分別檢測10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃條件下各樣品酶活，共計(jì)3組平行實(shí)驗(yàn)，最終測量結(jié)果最高值設(shè)定相對(duì)酶活為100%，計(jì)算剩余樣品比活力。

1.2.6.2 酶的最適pH

將酶液分別置于pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0不同緩沖液中，檢測各樣品酶活，共計(jì)3組平行實(shí)驗(yàn)，最終測量結(jié)果最高值相對(duì)酶活設(shè)為100%，計(jì)算剩余樣品比活力。

1.2.6.3 酶的熱穩(wěn)定性

將酶液分別置于20、30、40、50、60、70 ℃水浴鍋中保溫1 h，在37 ℃檢測各樣品殘留酶活，共計(jì)3組平行實(shí)驗(yàn)，取最終測量結(jié)果最高值相對(duì)酶活設(shè)為100%，計(jì)算剩余樣品比活力。

1.2.6.4 pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

將酶液分別置于pH 2.0～11.0(條件同1.2.6.2)緩沖液中，37 ℃保溫1 h，檢測各樣品殘留酶活，共計(jì)3組平行實(shí)驗(yàn)，取最終測量最高值相對(duì)酶活設(shè)為100%，計(jì)算剩余樣品比活力。

1.2.6.5 金屬離子對(duì)酶活的影響

在酶最適作用條件下，分別向酶液中加入Fe2+、Ca2+、K+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+等不同金屬離子緩沖液[11]，濃度設(shè)為5 mmol/L，測定不同金屬離子對(duì)酶活的影響，共計(jì)3組平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

從5種產(chǎn)尿酸氧化酶菌株中篩選出1株酶活最高的菌株，參照1.2.4.2在37 ℃下檢測其酶活達(dá)到15.18 U/mg，命名為JC-5。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

如圖1所示，菌落產(chǎn)生較大透明圈，呈白色圓形，邊緣規(guī)則，表面光滑，未產(chǎn)生孢子，革蘭氏染色呈紅色，鑒定為革蘭氏陰性菌。

A菌落形態(tài)；B-革蘭氏染色圖1 JC-5菌落形態(tài)及革蘭氏染色Fig.1 JC-5 colony morphology and gram staining

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

將擴(kuò)增出的16S rDNA基因片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示，在1 500 bp左右有明顯條帶。

M-Marker；1-16S rDNA圖2 菌株JC-5 16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Strain JC-5 16S rDNA agarose gel electrophoresis

隨后對(duì)基因序列進(jìn)行測序，測序工作由上海生工完成，測序后得到的基因大小為1 493 bp，與電泳結(jié)果一致。將測序得到的16S rDNA基因序列在GenBank基因庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選擇同源性在99%以上的菌株及不同屬、種間相似度最高菌株基因序列，利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示，菌株JC-5與彭氏變形桿菌Proteuspenneristrain 2203同源性最高，鑒定并命名為彭氏變形桿菌ProteuspenneriJC-5。

圖3 菌株JC-5 16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain JC-5 16S rDNA gene sequence

2.3 酶的分離純化

分離純化結(jié)果如圖4所示，提取部分粗酶液，加入70%飽和(NH4)2SO4過夜鹽析后，進(jìn)行透析超濾，再經(jīng)過SDS-PAGE電泳得到明顯蛋白條帶。隨后利用Sephadex G-100 凝膠過濾層析，在293 nm處檢測吸光度變化，并檢測吸收峰處的酶活，在25管檢測到酶活，表示目的蛋白開始被洗脫下來，32管酶活達(dá)到最高，41管檢測不到酶活，表明已被完全洗脫，收集此吸收峰內(nèi)的產(chǎn)物即為純化后的尿酸氧化酶。對(duì)得到的純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖5所示，25～32管所收集的樣品在35 kDa左右有明顯條帶，33～40管開始出現(xiàn)雜條帶，推測其分子質(zhì)量約為35 kDa。對(duì)純化后的樣品進(jìn)行酶活檢測，酶總活力為51.48 U，詳細(xì)結(jié)果參照表1，酶比活為66 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到3.6。

M-Marker；1-粗酶液；2-粗酶液 (4 ℃過夜)；3-超濾圖4 粗酶液鹽析-SDS-PAGE電泳Fig.4 Crude enzyme solution salting out-SDS-PAGE electrophoresis

M-Marker；1-Sephadex G-100凝膠過濾層析(25～32管)；2-33～40管圖5 凝膠過濾層析-SDS-PAGE電泳Fig.5 Gel filtration chromatography-SDS-PAGE electrophoresis

表1 粗酶液分離純化結(jié)果Table 1 Crude enzyme solution separation and purification results

2.4 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 酶最適作用溫度及熱穩(wěn)定性

對(duì)酶最適溫度的檢測結(jié)果如圖6所示，在35 ℃酶活達(dá)到最大，相對(duì)酶活定為100%，25～30 ℃時(shí)，相對(duì)酶活保持在80%左右，20 ℃酶活仍維持在50%，40 ℃開始酶活迅速下降，50 ℃相對(duì)酶活降至20%，60 ℃失活。針對(duì)該酶熱穩(wěn)定性的檢測，由圖7可知，在30 ℃處理1 h后該酶保持一定酶活且相對(duì)穩(wěn)定，在20 ℃處理1 h后仍有75%相對(duì)酶活，50 ℃處理1 h后相對(duì)酶活僅有6.2%，表明該酶熱穩(wěn)定性較差。

圖6 酶最適作用溫度曲線Fig.6 Enzyme optimum temperature curve

圖7 酶的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of the enzyme

2.4.2 酶的最適pH及穩(wěn)定性

將酶置于pH 2.0～11.0的緩沖液中檢測其酶活，結(jié)果如圖8所示，在pH 8.0時(shí)酶活最大，相對(duì)酶活設(shè)為100%，隨著pH降低或升高，酶活緩慢下降，堿性環(huán)境pH 9.0～10.0條件下，相對(duì)酶活在80%左右，pH 11.0時(shí)相對(duì)酶活為68%；在酸性環(huán)境中pH 4.0～6.0時(shí)，該酶相對(duì)酶活在70%左右，pH 2.0時(shí)仍有21%的相對(duì)酶活。針對(duì)其耐酸堿穩(wěn)定性研究結(jié)果如圖9所示，pH 8.0時(shí)檢測值最大，相對(duì)酶活設(shè)為100%，在pH 4.0～6.0時(shí)，相對(duì)酶活維持在50%以上，表明該酶具有一定的耐酸性，pH 7.0～9.0時(shí)相對(duì)酶活保持在80%以上，pH 11.0時(shí)的相對(duì)酶活降至20%，表明該酶在弱堿性條件下更利于保存。

圖8 酶的最適pH曲線Fig.8 Optimal pH curve of enzyme

圖9 不同pH對(duì)酶穩(wěn)定性影響Fig.9 Effect of different pH on enzyme stability

2.4.3 金屬離子對(duì)酶活性的影響

結(jié)果如表2所示，Ca2+與Mn2+對(duì)酶有激活作用，Ca2+的激活作用較強(qiáng)，處理后的相對(duì)酶活達(dá)到132%，F(xiàn)e2+、K+、Mg2+、Cu2+、Zn2+對(duì)酶活都有一定的抑制作用，F(xiàn)e2+使酶活性降低50%。

表2 不同金屬離子對(duì)酶活的影響Table 2 Effects of different metal ions on enzyme activity

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從痛風(fēng)病人腸道內(nèi)篩選得到1株優(yōu)產(chǎn)尿酸氧化酶菌株，命名為JC-5，通過16S rDNA測序，鑒定為彭氏變形桿菌。通過鹽析、G-100 凝膠過濾層析等步驟分離純化，該菌所產(chǎn)尿酸酶最終酶活達(dá)到66 U/mg。通過對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)研究，確認(rèn)該酶最適作用溫度為35 ℃，并在30～40 ℃保持一定熱穩(wěn)定性。該酶最適pH為8.0，在pH 7.0～9.0穩(wěn)定性強(qiáng)。Ca2+與Mn2+對(duì)該酶有一定激活作用，F(xiàn)e2+對(duì)酶抑制作用較強(qiáng)，與豬的腸道菌群所產(chǎn)酶的作用結(jié)果相似[12]。該酶在常溫狀態(tài)下熱穩(wěn)定性一般，在保藏與運(yùn)輸方面存在不足，未來可對(duì)其產(chǎn)酶基因進(jìn)行修飾，用于工業(yè)化生產(chǎn)[13]。

4 討論

變形桿菌主要存在于人體及動(dòng)物的腸道內(nèi)，以奇異變形桿菌(P.mirabilis)最為常見，而后是普通變形桿菌(P.vulgaris)，彭氏變形桿菌(P.penneri)和摩爾根變形桿菌(P.morganii)相對(duì)較為少見[14]。奇異變形桿菌是引起人類食物中毒的主要菌株，一些還會(huì)造成泌尿感染、結(jié)石等疾病[15]。彭氏變形桿菌較為少見，一般在醫(yī)院環(huán)境及患者身上篩選得到[16]，與銅綠假單胞菌具有高度相似性(86%)。最早在1988年有報(bào)道表明，同其他變形桿菌一樣，該菌株也能催化尿素形成CO2和氨，影響尿液的pH變化導(dǎo)致尿道結(jié)石等疾病[17]。除了能夠產(chǎn)生尿素酶催化尿素反應(yīng)外，變形桿菌在體內(nèi)也可以產(chǎn)生大量尿酸酶用于降解尿酸，其在尿毒癥患者體內(nèi)降解尿酸的能力僅次于大腸桿菌[18]。

本實(shí)驗(yàn)從痛風(fēng)患者糞便中篩選得到的產(chǎn)尿酸酶菌株通過系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定為彭氏變形桿菌(P.penneri)，相對(duì)于其他種類變形桿菌，P.penneri可隨呼吸道侵染人體或動(dòng)物，進(jìn)入食道及腸道，當(dāng)?shù)挚沽ο陆禃r(shí)容易被感染。該菌株帶有一定的致病性，將來實(shí)驗(yàn)可以對(duì)該產(chǎn)酶菌株的生長、發(fā)酵特性及毒理學(xué)進(jìn)行研究；也可以將該菌株進(jìn)行誘變育種，提取其產(chǎn)酶目的基因進(jìn)行進(jìn)行基因克隆工業(yè)化生產(chǎn)。

目前國內(nèi)外少有關(guān)于尿酸酶熱穩(wěn)定性的報(bào)道[19-20]，本實(shí)驗(yàn)篩選菌株所產(chǎn)尿酸酶，最適溫度處于人體體溫范圍，適合用于痛風(fēng)病人的臨床診斷與注射治療[21, 5]；在人體弱堿性環(huán)境中能夠有效降解尿酸，未來在醫(yī)藥用酶的開發(fā)方面亦有著很大發(fā)展前景[22]。但其在低溫環(huán)境下穩(wěn)定性較差，不利于保存。張慶芳等[23]篩選的海洋來源菌株Z7所產(chǎn)低溫尿酸酶可以在20 ℃仍保持較好穩(wěn)定性，將來可以更多地篩選生長在嚴(yán)苛環(huán)境下的產(chǎn)尿酸氧化酶菌株，針對(duì)其耐寒性、耐熱性及抗酸堿性作出研究；另一方面，將來可以對(duì)兩種產(chǎn)酶基因進(jìn)行修飾，起到功能互補(bǔ)的作用。