呂莫然，劉 爵

（1.北京農(nóng)學(xué)院，北京 昌平 102206；2.北京農(nóng)林科學(xué)院，北京 海淀 100097）

隨著非洲豬瘟的暴發(fā)和生物技術(shù)的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖業(yè)的生物安全問(wèn)題愈發(fā)突出。養(yǎng)殖場(chǎng)在建設(shè)時(shí)，要特別注意所選的建設(shè)場(chǎng)地，規(guī)劃好合理的豬場(chǎng)結(jié)構(gòu)和布局，完善配套的設(shè)施設(shè)備并注意及時(shí)改進(jìn)，要有合理的生物安全體系，工作人員也要嚴(yán)格執(zhí)行生物安全制度，進(jìn)出豬場(chǎng)要嚴(yán)格消毒，對(duì)病豬死豬的處理也要按國(guó)家相關(guān)規(guī)定，進(jìn)行無(wú)害化處理[1]。生物安全按方法實(shí)施的對(duì)象，可以分為外部防御和內(nèi)部控制。外部生物安全防御主要是對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)的外來(lái)病原體進(jìn)行控制，防止其進(jìn)入，主要措施是加強(qiáng)外來(lái)人員的清洗消毒；內(nèi)部生物安全是對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)的病原體進(jìn)行控制，防止其在養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)傳播[2]。因此，及時(shí)發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)的病原體對(duì)內(nèi)部生物安全的管理具有重要作用。目前實(shí)驗(yàn)室最常用的檢測(cè)方法是PCR檢測(cè)，此項(xiàng)研究通過(guò)實(shí)際操作實(shí)驗(yàn)中對(duì)臨床樣本流行性疾病豬圓環(huán)病毒3型的檢測(cè)以及檢測(cè)方法的優(yōu)化來(lái)建立和完善生物安全體系進(jìn)行建議指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用毒株以及臨床樣品均保存在實(shí)驗(yàn)室；病毒基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen生物技術(shù)公司；PCR反應(yīng)試劑購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒和臨床樣品的DNA提取

實(shí)驗(yàn)前先將水浴鍋預(yù)熱至56℃，緩沖液AL和ATL如果有沉淀要重新溶解，分別在緩沖液AW1和AW2中加入適量96%～100%的無(wú)水乙醇使之達(dá)到工作濃度。將樣品粉碎在2 ml離心管中使用200 μl的PBS渦旋混合，加入20 μl的蛋白酶K，振蕩混勻。混合200 μl AL緩沖液，震蕩混勻之后放入預(yù)先加熱好的56 ℃ 水浴鍋中，溫水浴10 min。向離心管中加入200 μl無(wú)水乙醇，振蕩混勻。將上述液體用移液槍轉(zhuǎn)移到DNeasy mini濾柱中，靜止1 min，至少8 000hg離心大約1 min，棄去濾出液。將濾柱重新放入新的2 ml離心管，加入500 μl的緩沖液AW1混勻，8 000hg離心 1 min，棄去濾出液。將濾柱置于新的2 ml離心管，加入 500 μl的緩沖液AW2混勻，靜止1 min，至少20 000hg離心大約3 min，棄去濾出液。將濾柱重新放入新的 2 ml離心管或1.5 ml離心管，在濾柱中間加入200 μl核酸酶的水，室溫靜置一會(huì)兒，6 000hg離心2 min。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)PCV 3全序列（MF155643.1），借助生物工具軟件Primier 5在引物設(shè)計(jì)原則的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)兩種進(jìn)行普通PCR的特異性引物并送公司進(jìn)行合成。其序列為：

P1：5? -GTTACCCAACTGTG CCCATCTATG-3’；

P2：5? -GTCACGCACAATTT CTCTCTCGG-3’。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)室臨床樣品的檢測(cè)

根據(jù)優(yōu)化后的檢測(cè)方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，此過(guò)程根據(jù)試劑盒提供的說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，PCR擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)采用25 μL反應(yīng)體系，加入PCR mix 2.5 μL，forward primer(10 mmol/L) 12.5 μL，reverse primer(10 mmol/l) 0.1 μL，DNA 模板 0.1 μL，ddH2O 添加至25 μL。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物。電泳緩沖液為1xTAE，電壓為220 V，反應(yīng)時(shí)間為10 min。使用紫外線照相儀對(duì)結(jié)果進(jìn)行記錄。

2 結(jié)果

2.1 PCV3 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)過(guò)對(duì)擴(kuò)增各參數(shù)多次的優(yōu)化，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行特異性檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，只有特定檢測(cè)的病毒有條帶，表明病原體檢測(cè)的方法具有高度特異性。

M：DL 2000 Maker；1：豬圓環(huán)病毒3型（Porcine circovirus type 3，PCV3）2：豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）3：豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）4：豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）5：豬流行腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）6：豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）7：豬 瘟 病 毒（Classical swine fever virus，CSFV）8：豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）9：豬圓環(huán)病毒1型（Porcine circovirus type 1，PCV1）

2.2 臨床病料檢測(cè)的結(jié)果

利用優(yōu)化好的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)方法，將實(shí)驗(yàn)室2018年之前和2019年在各省豬場(chǎng)收集的病料進(jìn)行檢測(cè)。樣本包括心、肝、脾、肺、腎等臟器和支氣管淋巴結(jié)、腸系淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、肺淋巴結(jié)等。檢測(cè)結(jié)果可以反映豬場(chǎng)內(nèi)部生物安全的管理效果，如表1所示。

3 討論

近年來(lái)，隨著流行性疾病的頻繁暴發(fā)，豬場(chǎng)生物安全的內(nèi)部控制變得愈發(fā)重要。一些傳染病由于沒(méi)有及時(shí)被檢測(cè)出來(lái)，在豬群中快速傳播，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此建立靈敏特異的檢測(cè)方法對(duì)完善生物安全體系具有重要作用。

圖1 設(shè)計(jì)引物的特異性實(shí)驗(yàn)

表1 臨床病料的檢測(cè)結(jié)果

此次用于指導(dǎo)生物安全生產(chǎn)的是豬圓環(huán)病毒的一種基因型，豬感染后會(huì)引起斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征、腎病、皮膚及內(nèi)臟的炎癥反應(yīng)。感染母豬難以受孕，流產(chǎn)率上升，還會(huì)生產(chǎn)出弱胎、死胎、畸形胎甚至木乃伊胎。豬圓環(huán)病毒3型常常與豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、偽狂犬病病毒等形成混合或繼發(fā)感染，僅僅根據(jù)臨床癥狀和病理變化難以做出正確的判斷。而電鏡觀察最直接，也最常規(guī)，是將病豬的組織制成切片在電鏡下觀察，但這種方法步驟繁瑣，需要大量的時(shí)間和精力。原位雜交技術(shù)檢測(cè)是使用探針與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)單鏈DNA或RNA形成專一的核酸雜交分子，再經(jīng)特殊方法檢測(cè)出來(lái)；但目前這種方法在國(guó)內(nèi)應(yīng)用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒不多見(jiàn)，操作也較為復(fù)雜，特異性不高。新興起的LAMP（環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)）是指在設(shè)計(jì)好引物之后，在恒溫水浴鍋內(nèi)進(jìn)行基因的擴(kuò)增，花費(fèi)時(shí)間短，也無(wú)需特殊實(shí)驗(yàn)儀器，靈敏度比PCR也高，但在實(shí)際操作中，容易被氣溶膠污染產(chǎn)生假陽(yáng)性。ELISA檢測(cè)方法是利用抗原或抗體的相互作用與酶進(jìn)行連接，再與底物作用[3-6]；該種方法特異性和敏感性都比較高，缺點(diǎn)是檢測(cè)過(guò)程中需要精密儀器（酶標(biāo)儀），除此之外，使用該方法檢測(cè)的試劑盒價(jià)格較高。IFA（間接免疫熒光）和IPMA（免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞實(shí)驗(yàn)）兩種檢測(cè)方法相似，主要區(qū)別是最后的觀察，IFA依靠熒光觀察，IPMA依靠酶進(jìn)行顯色反應(yīng)觀察。兩者都需要精密的儀器，而且，IFA實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在非特異性染色。綜合來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)室大多數(shù)檢測(cè)操作復(fù)雜，花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，專業(yè)性要求較高。PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）因其操作簡(jiǎn)便成為實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)出特異性較高的引物，以堿基互補(bǔ)配對(duì)為原則，在模板和引物的指導(dǎo)下，通過(guò)DNA聚合酶擴(kuò)增出新鏈。

在對(duì)豬場(chǎng)內(nèi)部進(jìn)行生物安全管理時(shí)，要嚴(yán)格執(zhí)行消毒制度，加強(qiáng)管理；科學(xué)飼養(yǎng)，提高豬群免疫力，加強(qiáng)保健意識(shí)。及時(shí)對(duì)豬群進(jìn)行疾病檢測(cè)，減少病毒感染擴(kuò)散[7]。