呂莫然，劉 爵

（1.北京農學院，北京 昌平 102206；2.北京農林科學院，北京 海淀 100097）

隨著非洲豬瘟的暴發(fā)和生物技術的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖業(yè)的生物安全問題愈發(fā)突出。養(yǎng)殖場在建設時，要特別注意所選的建設場地，規(guī)劃好合理的豬場結構和布局，完善配套的設施設備并注意及時改進，要有合理的生物安全體系，工作人員也要嚴格執(zhí)行生物安全制度，進出豬場要嚴格消毒，對病豬死豬的處理也要按國家相關規(guī)定，進行無害化處理[1]。生物安全按方法實施的對象，可以分為外部防御和內部控制。外部生物安全防御主要是對養(yǎng)殖場的外來病原體進行控制，防止其進入，主要措施是加強外來人員的清洗消毒；內部生物安全是對養(yǎng)殖場內的病原體進行控制，防止其在養(yǎng)殖場內傳播[2]。因此，及時發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場內的病原體對內部生物安全的管理具有重要作用。目前實驗室最常用的檢測方法是PCR檢測，此項研究通過實際操作實驗中對臨床樣本流行性疾病豬圓環(huán)病毒3型的檢測以及檢測方法的優(yōu)化來建立和完善生物安全體系進行建議指導。

1 材料與方法

1.1 材料

所用毒株以及臨床樣品均保存在實驗室；病毒基因組DNA提取試劑盒購自Qiagen生物技術公司；PCR反應試劑購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒和臨床樣品的DNA提取

實驗前先將水浴鍋預熱至56℃，緩沖液AL和ATL如果有沉淀要重新溶解，分別在緩沖液AW1和AW2中加入適量96%～100%的無水乙醇使之達到工作濃度。將樣品粉碎在2 ml離心管中使用200 μl的PBS渦旋混合，加入20 μl的蛋白酶K，振蕩混勻?；旌?00 μl AL緩沖液，震蕩混勻之后放入預先加熱好的56 ℃ 水浴鍋中，溫水浴10 min。向離心管中加入200 μl無水乙醇，振蕩混勻。將上述液體用移液槍轉移到DNeasy mini濾柱中，靜止1 min，至少8 000hg離心大約1 min，棄去濾出液。將濾柱重新放入新的2 ml離心管，加入500 μl的緩沖液AW1混勻，8 000hg離心 1 min，棄去濾出液。將濾柱置于新的2 ml離心管，加入 500 μl的緩沖液AW2混勻，靜止1 min，至少20 000hg離心大約3 min，棄去濾出液。將濾柱重新放入新的 2 ml離心管或1.5 ml離心管，在濾柱中間加入200 μl核酸酶的水，室溫靜置一會兒，6 000hg離心2 min。

1.2.2 引物的設計與合成

根據(jù)PCV 3全序列（MF155643.1），借助生物工具軟件Primier 5在引物設計原則的基礎上，設計兩種進行普通PCR的特異性引物并送公司進行合成。其序列為：

P1：5? -GTTACCCAACTGTG CCCATCTATG-3’；

P2：5? -GTCACGCACAATTT CTCTCTCGG-3’。

1.2.3 實驗室臨床樣品的檢測

根據(jù)優(yōu)化后的檢測方法，對實驗室臨床樣品進行檢測，此過程根據(jù)試劑盒提供的說明書進行實驗操作，PCR擴增檢測實驗采用25 μL反應體系，加入PCR mix 2.5 μL，forward primer(10 mmol/L) 12.5 μL，reverse primer(10 mmol/l) 0.1 μL，DNA 模板 0.1 μL，ddH2O 添加至25 μL。通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增反應產物。電泳緩沖液為1xTAE，電壓為220 V，反應時間為10 min。使用紫外線照相儀對結果進行記錄。

2 結果

2.1 PCV3 PCR反應條件優(yōu)化結果

經(jīng)過對擴增各參數(shù)多次的優(yōu)化，對實驗設計的引物進行特異性檢測，結果如圖1所示，只有特定檢測的病毒有條帶，表明病原體檢測的方法具有高度特異性。

M：DL 2000 Maker；1：豬圓環(huán)病毒3型（Porcine circovirus type 3，PCV3）2：豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）3：豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）4：豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）5：豬流行腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）6：豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）7：豬 瘟 病 毒（Classical swine fever virus，CSFV）8：豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）9：豬圓環(huán)病毒1型（Porcine circovirus type 1，PCV1）

2.2 臨床病料檢測的結果

利用優(yōu)化好的聚合酶鏈式反應（PCR）檢測方法，將實驗室2018年之前和2019年在各省豬場收集的病料進行檢測。樣本包括心、肝、脾、肺、腎等臟器和支氣管淋巴結、腸系淋巴結、腹股溝淋巴結、肺淋巴結等。檢測結果可以反映豬場內部生物安全的管理效果，如表1所示。

3 討論

近年來，隨著流行性疾病的頻繁暴發(fā)，豬場生物安全的內部控制變得愈發(fā)重要。一些傳染病由于沒有及時被檢測出來，在豬群中快速傳播，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。因此建立靈敏特異的檢測方法對完善生物安全體系具有重要作用。

圖1 設計引物的特異性實驗

表1 臨床病料的檢測結果

此次用于指導生物安全生產的是豬圓環(huán)病毒的一種基因型，豬感染后會引起斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征、腎病、皮膚及內臟的炎癥反應。感染母豬難以受孕，流產率上升，還會生產出弱胎、死胎、畸形胎甚至木乃伊胎。豬圓環(huán)病毒3型常常與豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、偽狂犬病病毒等形成混合或繼發(fā)感染，僅僅根據(jù)臨床癥狀和病理變化難以做出正確的判斷。而電鏡觀察最直接，也最常規(guī)，是將病豬的組織制成切片在電鏡下觀察，但這種方法步驟繁瑣，需要大量的時間和精力。原位雜交技術檢測是使用探針與組織、細胞或染色體上待測單鏈DNA或RNA形成專一的核酸雜交分子，再經(jīng)特殊方法檢測出來；但目前這種方法在國內應用于檢測豬圓環(huán)病毒不多見，操作也較為復雜，特異性不高。新興起的LAMP（環(huán)介導恒溫擴增技術）是指在設計好引物之后，在恒溫水浴鍋內進行基因的擴增，花費時間短，也無需特殊實驗儀器，靈敏度比PCR也高，但在實際操作中，容易被氣溶膠污染產生假陽性。ELISA檢測方法是利用抗原或抗體的相互作用與酶進行連接，再與底物作用[3-6]；該種方法特異性和敏感性都比較高，缺點是檢測過程中需要精密儀器（酶標儀），除此之外，使用該方法檢測的試劑盒價格較高。IFA（間接免疫熒光）和IPMA（免疫過氧化物酶單層細胞實驗）兩種檢測方法相似，主要區(qū)別是最后的觀察，IFA依靠熒光觀察，IPMA依靠酶進行顯色反應觀察。兩者都需要精密的儀器，而且，IFA實驗結果存在非特異性染色。綜合來說，實驗室大多數(shù)檢測操作復雜，花費時間較長，專業(yè)性要求較高。PCR（聚合酶鏈反應）因其操作簡便成為實驗室應用最廣泛的檢測方法，實驗需要設計出特異性較高的引物，以堿基互補配對為原則，在模板和引物的指導下，通過DNA聚合酶擴增出新鏈。

在對豬場內部進行生物安全管理時，要嚴格執(zhí)行消毒制度，加強管理；科學飼養(yǎng)，提高豬群免疫力，加強保健意識。及時對豬群進行疾病檢測，減少病毒感染擴散[7]。