呂莫然,劉 爵
(1.北京農(nóng)學(xué)院,北京 昌平 102206;2.北京農(nóng)林科學(xué)院,北京 海淀 100097)
隨著非洲豬瘟的暴發(fā)和生物技術(shù)的不斷發(fā)展,養(yǎng)殖業(yè)的生物安全問(wèn)題愈發(fā)突出。養(yǎng)殖場(chǎng)在建設(shè)時(shí),要特別注意所選的建設(shè)場(chǎng)地,規(guī)劃好合理的豬場(chǎng)結(jié)構(gòu)和布局,完善配套的設(shè)施設(shè)備并注意及時(shí)改進(jìn),要有合理的生物安全體系,工作人員也要嚴(yán)格執(zhí)行生物安全制度,進(jìn)出豬場(chǎng)要嚴(yán)格消毒,對(duì)病豬死豬的處理也要按國(guó)家相關(guān)規(guī)定,進(jìn)行無(wú)害化處理[1]。生物安全按方法實(shí)施的對(duì)象,可以分為外部防御和內(nèi)部控制。外部生物安全防御主要是對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)的外來(lái)病原體進(jìn)行控制,防止其進(jìn)入,主要措施是加強(qiáng)外來(lái)人員的清洗消毒;內(nèi)部生物安全是對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)的病原體進(jìn)行控制,防止其在養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)傳播[2]。因此,及時(shí)發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)的病原體對(duì)內(nèi)部生物安全的管理具有重要作用。目前實(shí)驗(yàn)室最常用的檢測(cè)方法是PCR檢測(cè),此項(xiàng)研究通過(guò)實(shí)際操作實(shí)驗(yàn)中對(duì)臨床樣本流行性疾病豬圓環(huán)病毒3型的檢測(cè)以及檢測(cè)方法的優(yōu)化來(lái)建立和完善生物安全體系進(jìn)行建議指導(dǎo)。
所用毒株以及臨床樣品均保存在實(shí)驗(yàn)室;病毒基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen生物技術(shù)公司;PCR反應(yīng)試劑購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。
1.2.1 病毒和臨床樣品的DNA提取
實(shí)驗(yàn)前先將水浴鍋預(yù)熱至56℃,緩沖液AL和ATL如果有沉淀要重新溶解,分別在緩沖液AW1和AW2中加入適量96%~100%的無(wú)水乙醇使之達(dá)到工作濃度。將樣品粉碎在2 ml離心管中使用200 μl的PBS渦旋混合,加入20 μl的蛋白酶K,振蕩混勻。混合200 μl AL緩沖液,震蕩混勻之后放入預(yù)先加熱好的56 ℃ 水浴鍋中,溫水浴10 min。向離心管中加入200 μl無(wú)水乙醇,振蕩混勻。將上述液體用移液槍轉(zhuǎn)移到DNeasy mini濾柱中,靜止1 min,至少8 000hg離心大約1 min,棄去濾出液。將濾柱重新放入新的2 ml離心管,加入500 μl的緩沖液AW1混勻,8 000hg離心 1 min,棄去濾出液。將濾柱置于新的2 ml離心管,加入 500 μl的緩沖液AW2混勻,靜止1 min,至少20 000hg離心大約3 min,棄去濾出液。將濾柱重新放入新的 2 ml離心管或1.5 ml離心管,在濾柱中間加入200 μl核酸酶的水,室溫靜置一會(huì)兒,6 000hg離心2 min。
1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)PCV 3全序列(MF155643.1),借助生物工具軟件Primier 5在引物設(shè)計(jì)原則的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)兩種進(jìn)行普通PCR的特異性引物并送公司進(jìn)行合成。其序列為:
P1:5? -GTTACCCAACTGTG CCCATCTATG-3’;
P2:5? -GTCACGCACAATTT CTCTCTCGG-3’。
1.2.3 實(shí)驗(yàn)室臨床樣品的檢測(cè)
根據(jù)優(yōu)化后的檢測(cè)方法,對(duì)實(shí)驗(yàn)室臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),此過(guò)程根據(jù)試劑盒提供的說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,PCR擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)采用25 μL反應(yīng)體系,加入PCR mix 2.5 μL,forward primer(10 mmol/L) 12.5 μL,reverse primer(10 mmol/l) 0.1 μL,DNA 模板 0.1 μL,ddH2O 添加至25 μL。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物。電泳緩沖液為1xTAE,電壓為220 V,反應(yīng)時(shí)間為10 min。使用紫外線照相儀對(duì)結(jié)果進(jìn)行記錄。
經(jīng)過(guò)對(duì)擴(kuò)增各參數(shù)多次的優(yōu)化,對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行特異性檢測(cè),結(jié)果如圖1所示,只有特定檢測(cè)的病毒有條帶,表明病原體檢測(cè)的方法具有高度特異性。
M:DL 2000 Maker;1:豬圓環(huán)病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)2:豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV)3:豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)4:豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)5:豬流行腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)6:豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus,PPV)7:豬 瘟 病 毒(Classical swine fever virus,CSFV)8:豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)9:豬圓環(huán)病毒1型(Porcine circovirus type 1,PCV1)
利用優(yōu)化好的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)方法,將實(shí)驗(yàn)室2018年之前和2019年在各省豬場(chǎng)收集的病料進(jìn)行檢測(cè)。樣本包括心、肝、脾、肺、腎等臟器和支氣管淋巴結(jié)、腸系淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、肺淋巴結(jié)等。檢測(cè)結(jié)果可以反映豬場(chǎng)內(nèi)部生物安全的管理效果,如表1所示。
近年來(lái),隨著流行性疾病的頻繁暴發(fā),豬場(chǎng)生物安全的內(nèi)部控制變得愈發(fā)重要。一些傳染病由于沒(méi)有及時(shí)被檢測(cè)出來(lái),在豬群中快速傳播,給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此建立靈敏特異的檢測(cè)方法對(duì)完善生物安全體系具有重要作用。
圖1 設(shè)計(jì)引物的特異性實(shí)驗(yàn)
表1 臨床病料的檢測(cè)結(jié)果
此次用于指導(dǎo)生物安全生產(chǎn)的是豬圓環(huán)病毒的一種基因型,豬感染后會(huì)引起斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征、腎病、皮膚及內(nèi)臟的炎癥反應(yīng)。感染母豬難以受孕,流產(chǎn)率上升,還會(huì)生產(chǎn)出弱胎、死胎、畸形胎甚至木乃伊胎。豬圓環(huán)病毒3型常常與豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、偽狂犬病病毒等形成混合或繼發(fā)感染,僅僅根據(jù)臨床癥狀和病理變化難以做出正確的判斷。而電鏡觀察最直接,也最常規(guī),是將病豬的組織制成切片在電鏡下觀察,但這種方法步驟繁瑣,需要大量的時(shí)間和精力。原位雜交技術(shù)檢測(cè)是使用探針與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)單鏈DNA或RNA形成專一的核酸雜交分子,再經(jīng)特殊方法檢測(cè)出來(lái);但目前這種方法在國(guó)內(nèi)應(yīng)用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒不多見(jiàn),操作也較為復(fù)雜,特異性不高。新興起的LAMP(環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù))是指在設(shè)計(jì)好引物之后,在恒溫水浴鍋內(nèi)進(jìn)行基因的擴(kuò)增,花費(fèi)時(shí)間短,也無(wú)需特殊實(shí)驗(yàn)儀器,靈敏度比PCR也高,但在實(shí)際操作中,容易被氣溶膠污染產(chǎn)生假陽(yáng)性。ELISA檢測(cè)方法是利用抗原或抗體的相互作用與酶進(jìn)行連接,再與底物作用[3-6];該種方法特異性和敏感性都比較高,缺點(diǎn)是檢測(cè)過(guò)程中需要精密儀器(酶標(biāo)儀),除此之外,使用該方法檢測(cè)的試劑盒價(jià)格較高。IFA(間接免疫熒光)和IPMA(免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞實(shí)驗(yàn))兩種檢測(cè)方法相似,主要區(qū)別是最后的觀察,IFA依靠熒光觀察,IPMA依靠酶進(jìn)行顯色反應(yīng)觀察。兩者都需要精密的儀器,而且,IFA實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在非特異性染色。綜合來(lái)說(shuō),實(shí)驗(yàn)室大多數(shù)檢測(cè)操作復(fù)雜,花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng),專業(yè)性要求較高。PCR(聚合酶鏈反應(yīng))因其操作簡(jiǎn)便成為實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法,實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)出特異性較高的引物,以堿基互補(bǔ)配對(duì)為原則,在模板和引物的指導(dǎo)下,通過(guò)DNA聚合酶擴(kuò)增出新鏈。
在對(duì)豬場(chǎng)內(nèi)部進(jìn)行生物安全管理時(shí),要嚴(yán)格執(zhí)行消毒制度,加強(qiáng)管理;科學(xué)飼養(yǎng),提高豬群免疫力,加強(qiáng)保健意識(shí)。及時(shí)對(duì)豬群進(jìn)行疾病檢測(cè),減少病毒感染擴(kuò)散[7]。