（天津渤海農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)聯(lián)合研究院有限公司,天津 300308）

2019年12月中旬，中國武漢發(fā)生“不明原因肺炎”，后經(jīng)研究人員分離鑒定后認定是由一種新型的冠狀病毒引起的嚴重呼吸系統(tǒng)疾病[1]。2020年2月11日世界衛(wèi)生組織將新型冠狀病毒命名為 COVID-19[2]。21世紀以來除COVID-19外，還出現(xiàn)2種致病性較高的新型人冠狀病毒，2003年的嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（SARS）、2012年的中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（MERS）。冠狀病毒[3]是一類有包膜，包膜上有棘突的單股正鏈RNA病毒，整個病毒像王冠或日冕而得名，這類病毒廣泛存在于自然界中，屬于人畜共患病毒。新型冠狀病毒肺炎雖然是自限性疾病，但有一定的致死率，且該病毒為傳染性極強，至今尚無有效疫苗和治療方法。目前預(yù)防該病毒感染最行之有效的手段就是隔離與消毒[4]。

目前，常用84消毒劑和酒精是單方消毒劑，但日常生活中使用84消毒劑會導(dǎo)致一定的漂白及腐蝕性，酒精在封閉環(huán)境中使用具有一定危險性。獸用消毒劑很多是復(fù)方消毒劑，為了評估這些消毒劑對于冠狀病毒是否有效，同時在消毒劑評估上掌握一種替代的評價方法，此研究建立了以冠狀病毒-豬流行性腹瀉病毒（PEDV）為指示病毒的評價模型，重點評估消毒劑最低有效濃度和最短作用時間，以期為冠狀病毒的消毒劑評估提供了一種可行和敏感的方法。

1 材料與方法

1.1 細胞、毒株

Vero-E6細胞和純凈穩(wěn)定傳代PEDV（ZJ08株）毒株均由天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司研究院饋贈。

1.2 待測消毒劑

安立消（月芐三甲氯銨，雙鏈季銨鹽）、衛(wèi)清寧（過硫酸氫鉀復(fù)合物粉 含氯≥10%）、新歐福（戊二醛-葵甲溴銨）、二氯異氰脲酸鈉（含氯20%）、84消毒液（含氯4.5%）、酒精。

1.3 實驗方法

1.3.1 最大無毒濃度摸索

將各種消毒劑用細胞維持液按照100倍稀釋后接種鋪滿Vero-E6細胞的細胞板，觀察細胞變化，無細胞變化的最小稀釋度為該消毒劑的最大無毒濃度。

1.3.2 最低有效濃度（病毒滅活率）測定

將消毒劑從1.3.1中最大無毒濃度開始進行100系列稀釋，與病毒液進行等體積混合，室溫下靜置30 min使消毒劑與病毒液充分作用。作用完后，加入相應(yīng)中和劑終止實驗，將混合物用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行10倍梯度稀釋，測定TCID50，同時作無消毒劑、無病毒的空白對照；取長滿Vero-E6細胞單層的96孔細胞板作原病毒對照板，測定與消毒劑作用前病毒液TCID50；另設(shè)75%乙醇做消毒劑對照。將接種后的96孔細胞板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)觀察120 h，分別計算有消毒劑和無消毒劑的TCID50，計算病毒滅活率和消毒前后病毒下降滴度Log10TCID50/100μL。

病毒滅活率%=（消毒前病毒滴度-消毒后病毒滴度）/消毒前病毒滴度 100%

1.3.3 最短作用時間測定

將消毒劑稀釋到1.3.2中測定最低有效濃度的中間濃度，與病毒液進行等體積混合，室溫下分別靜置1 min、5 min、10 min使消毒劑與病毒液充分作用。作用完后，加入相應(yīng)中和劑終止實驗，將混合物用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行10倍梯度稀釋，測定TCID50，同時作無消毒劑、無病毒的空白對照。另取長滿Vero-E6細胞單層的96孔細胞板作原病毒對照板，測定與消毒劑作用前病毒液TCID50。將接種后的96孔細胞板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)觀察120 h，分別計算有消毒劑和無消毒劑的TCID50，計算消毒前后病毒下降滴度Log10TCID50/100μL。

1.3.4 判定標準

實驗結(jié)果判定標準為：消毒后滴度下降≥104即為有效。

2 實驗結(jié)果

2.1 最低有效濃度

新歐福最低有效濃度為1:500；安立消最低有效濃度為1:800；衛(wèi)清寧最低有效濃度為1:1 600；二氯異氰脲酸鈉的最低有效濃度為1:1 000；84消毒液最低有效濃度為1:100。具體實驗結(jié)果見表1。

2.2 最短作用時間測定

含氯制劑二氯異氰脲酸鈉粉、84消毒液、衛(wèi)清寧（主要成分為過硫酸氫鉀復(fù)合粉）與病毒作用1 min后，為毒價降低106.5，能夠有效殺滅豬病毒性腹瀉病毒PEDV，季銨鹽類消毒劑安立消和醛類消毒劑新歐福、酒精最短作用時間>10 min，需要更長的時間才能殺滅病毒。不同作用時間消毒效果詳見表2。

3 討論

新型冠狀病毒COVID-19與SARS病毒以相同的方式進入宿主細胞，與蝙蝠相關(guān)病毒基因組測序相似型達87.1%，屬于SARS相關(guān)冠狀病毒。但傳染性與致病性均高于2003年SARS病毒[5]，截止本文發(fā)稿前，該病毒導(dǎo)致的確診病例達超7萬多例，還有疑似5萬多例，累計死亡超過2 600例，感染和死亡人數(shù)遠遠超過SARS病毒。

根據(jù)新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第6版）規(guī)定，COVID-19病毒屬于β屬冠狀病毒，乙醚、酒精、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等均能有效殺滅病毒。有專家指出有效消毒是保證豬場生物安全的必要手段[6]。王成新認為，有效消毒必須選擇適用的消毒劑，必須針對不同的消毒對象采用不同的方法。此研究中，將84消毒劑、酒精和常見獸用復(fù)方消毒劑建立了一種利用Vero-E6細胞進行消毒效果評估[7-8]，利用細胞將PEDV-ZJ08株作為指示病毒，通過進行消毒前后病毒效價測定對比，對消毒劑殺滅冠狀病毒的效果進行評估的模型。這種方法比其他消毒劑評價方式更加敏感，且可專門針對冠狀病毒進行消毒劑評估，在新冠疫情期間豬場人員、環(huán)境消毒非常具有指導(dǎo)意義。

表1 不同類消毒劑感作30 min時的最低有效濃度

表2 不同類消毒劑與病毒作用不同時間病毒滴度的降低值

共測定6種消毒劑，其中安立消（月芐三甲氯銨，雙鏈季銨鹽）、衛(wèi)清寧（過硫酸氫鉀復(fù)合粉）、二氯異氰脲酸鈉粉、84消毒液均為含氯消毒劑；新歐福（戊二醛-葵甲溴銨）為醛類消毒劑；75%乙醇為醇類消毒劑。根據(jù)實驗結(jié)果分析，所測消毒劑均能有效殺滅冠狀病毒，但不同消毒劑有效的最低有效濃度有差異，最短作用時間結(jié)果顯示，含氯消毒劑對于殺滅冠狀病毒效果迅速，可在1 min內(nèi)迅速殺滅PEDV，而其他種類消毒劑作用超過10 min才能達到殺滅冠狀病毒的效果。衛(wèi)清寧（過硫酸氫鉀復(fù)合粉）消毒效果明顯優(yōu)于其他消毒劑。84消毒劑的最大稀釋到1:100倍可以使PEDV病毒下降104，衛(wèi)清寧最大稀釋倍數(shù)為1:1 600時，仍然可以有效殺滅冠狀病毒，與84消毒劑相比較，衛(wèi)清寧是84消毒液效果的16倍。二氯異氰脲酸鈉粉是84消毒劑消毒效果的10倍，這可能與二者有效含氯量有關(guān)，前者有效含氯量為20%，后者有效含氯量為4.5%，而衛(wèi)清寧（過硫酸氫鉀復(fù)合粉）有效含氯量≥10%，除氯制劑起作用外，還與其溶于水后產(chǎn)生氧化性和酸性有關(guān)。

由于新型冠狀病毒COVID-19具有高度傳染性，許多生物實驗室的等級不夠，不能直接進行該病毒的研究，但在消毒劑評價時，?？梢越栌弥甘鞠拘Ч奶娲《净蛑甘静《?。在2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》中[9-10],規(guī)定可以脊髓灰質(zhì)炎病毒1型疫苗株和艾滋病毒1型美國株懸液定量滅活試驗作為指示病毒,來分別代表腸道致病病毒和艾滋病病毒。新型冠狀病毒COVID-19可在Vero-E6細胞上進行增殖[11]。而豬流行性腹瀉PEDV屬于冠狀病毒科[6]，其中ZJ08株是能穩(wěn)定傳代的疫苗株，在Vero-E6細胞上有明顯特征性細胞病變，操作簡便，安全且具有良好的穩(wěn)定性，可作為冠狀病毒科新型冠狀病毒的指示病毒。

衛(wèi)清寧主要成分為過硫酸氫鉀復(fù)合粉有效含氯量≥10%，不受有機物影響，適合不同條件下環(huán)境、水體等消毒，最終代謝產(chǎn)物為氯化鈉和二氧化碳，屬于低毒產(chǎn)品，對環(huán)境及人體無害，且根據(jù)報道，研究人員對過硫酸氫鉀消毒劑產(chǎn)品已做過很多研究，對多種病毒和細菌孢子等具有殺滅作用，可適用于豬場環(huán)境及人員、水體消毒和家庭日常消毒及泳池水體消毒等，是一種安全高效環(huán)保消毒劑。[12-15]