黃秋紅，潘永年，錢 昇，藍(lán) 吉

claudins蛋白是一類跨膜蛋白家族，在人體多種組織中均有表達(dá)，具有維持緊密連接的屏障功能和柵欄功能，若其表達(dá)異?？蓪?dǎo)致上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞，極性喪失，細(xì)胞間黏附力下降，進(jìn)而導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生、侵襲與轉(zhuǎn)移[1]。因此，claudins蛋白與腫瘤的相關(guān)性研究已成為近年來研究的熱點(diǎn)。claudin-1 是claudins蛋白家族中最早被發(fā)現(xiàn)的，并且是腫瘤表達(dá)中最失調(diào)的claudins蛋白之一。已有研究證實(shí)claudin-1在神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)腫瘤等中均存在異常表達(dá)，并且與腫瘤

的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)，但其與皮膚腫瘤的相關(guān)性研究罕見報(bào)道。因此，本研究擬通過免疫組化法檢測(cè)claudin-1蛋白在皮膚基底細(xì)胞癌（BCC）組織中的表達(dá)，從而初步探討claudin-1在BCC發(fā)病機(jī)制中的作用，為BCC的早期診斷和基因靶向治療建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 claudin-1兔抗人多克隆抗體（Abcam公司），免疫組化SP試劑盒、DAB顯色試劑盒（南京凱基生物發(fā)展有限公司）。

1.1.2 樣本資料 收集2014年11月—2016年11月于蘇州市吳江區(qū)中醫(yī)醫(yī)院皮膚科就診、其臨床表現(xiàn)及組織病理確診為BCC的38例患者，男20例，女18例，年齡50～77歲，平均年齡（63.8±8.0）歲，病程5個(gè)月～3年。正常對(duì)照組標(biāo)本來源于手術(shù)切除時(shí)所帶的正常皮膚組織。取材部位均為頭面部，所有標(biāo)本具有典型或較為典型的皮損，并且通過蘇木精-伊紅（HE）染色證實(shí)均具有典型的組織病理學(xué)改變。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法檢測(cè)組織樣本中claudin-1蛋白的表達(dá) 將所有標(biāo)本按常規(guī)方法進(jìn)行石蠟包埋、切片，嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行檢測(cè)。①抗原修復(fù)：先將放有切片的耐高溫塑料染色架放入盛有抗原修復(fù)液的燒杯中，高火檔至煮沸，將燒杯取出置于電熱器上保持微沸狀態(tài)20 min，再將燒杯浸入流水中自然冷卻后用PBS浸洗3次。②滅活酶：每張切片滴加2滴3%H2O2-甲醇溶液，室溫封閉10 min。PBS浸洗3次。③封閉：滴加即用型山羊血清50～100 μl，室溫孵育20 min。④抗原-抗體反應(yīng)：滴加一抗（1：100稀釋）50 ～ 100 μl，37 ℃，濕盒孵育 2 h，PBS 浸洗 3次。⑤加增強(qiáng)劑：滴加增強(qiáng)劑50 μl，室溫濕盒孵育30 min。PBS浸洗3次。⑥一抗二抗反應(yīng)：滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體50 μl，室溫孵育30 min。PBS清洗3次。⑦顯色、復(fù)染，最后脫水封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2 結(jié)果判定 高倍鏡（×400）下選取10個(gè)視野，綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量測(cè)定。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%～35%為1分，35%～65%為2分，＞65%者為3分。兩者評(píng)分相乘，0～2分為陰性，3～9分均判斷為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析均通過SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行。claudin-1在皮膚BCC和癌旁正常皮膚組織的免疫組化陽性率間的比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 claudin-1蛋白在癌旁正常皮膚和BBC組織中表達(dá)情況（SP法）

2 結(jié)果

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，claudin-1蛋白在癌旁正常皮膚組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，定位于表皮基底層至顆粒層的角質(zhì)形成細(xì)胞膜上，呈棕褐色（圖1a）；而在BCC中，其表達(dá)信號(hào)明顯降低，呈弱陽性至陰性表達(dá)（圖1b）。claudin-1蛋白在癌旁正常皮膚組織和BCC組織中的陽性表達(dá)率分別為100%（38/38）和21.05（8/38），兩組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

3 討論

claudin-1是緊密連接中最重要的骨架蛋白，在心臟、肝臟、腦組織、脾臟、肺部、腎臟等器官中均有表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)claudin-1蛋白在正常皮膚組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性率可達(dá)100.00%，且主要定位于表皮基底層至顆粒層的角質(zhì)形成細(xì)胞膜上，呈棕褐色、線狀分布，該結(jié)果與翁立強(qiáng)等[2]研究結(jié)果基本一致。

大量研究證明，claudins蛋白在腫瘤中的表達(dá)具有組織特異性，且同一種claudin蛋白在不同腫瘤組織中的表達(dá)或者在同一類型腫瘤的不同病理亞型中的表達(dá)亦各不相同，這種表達(dá)的差異性為腫瘤的診斷、治療均提供了新的思路?，F(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)claudin-1蛋白的表達(dá)情況及其作用在不同腫瘤或同一腫瘤的不同亞型或不同分期中所起到的作用不盡相同。如在浸潤(rùn)性乳腺癌中，claudin-1的表達(dá)低于正常上皮組織[3]，而在食管鱗癌中claudin-1的表達(dá)顯著高于癌旁組織[4]。claudin-1在肺腺癌中表達(dá)下降，而在肺鱗癌中表達(dá)升高，故可作為鑒別肺鱗癌和肺腺癌的重要指標(biāo)[5]。在甲狀腺癌中，乳頭狀癌claudin-1呈高表達(dá)，而濾泡性癌和濾泡性腺癌呈低表達(dá)[6]。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，claudin-1在癌旁口腔上皮組織、高分化鱗癌、中和低分化鱗癌中均有信號(hào)表達(dá)，表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)[7]。然而claudins蛋白與皮膚腫瘤中的相關(guān)性研究較少。最新一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，claudin-1在正常表皮和脂溢性角化病（SK）中的表達(dá)明顯高于日光性角化?。ˋK）、鮑恩病和皮膚鱗狀細(xì)胞癌（SCC），由此推測(cè)皮膚SCC的發(fā)生可能與claudin-1的表達(dá)下調(diào)（或缺失）導(dǎo)致細(xì)胞間黏附性喪失，細(xì)胞分化變差及侵襲性增加有關(guān)[2]。

BCC是一種常發(fā)生在表皮或皮膚附屬器的惡性腫瘤，起源于上皮干細(xì)胞[8]，位居皮膚腫瘤發(fā)病率的第一位。有關(guān)claudin-1與BCC的相關(guān)性研究在國(guó)內(nèi)極少。本研究通過分析38例BCC組織中claudin-1蛋白的表達(dá)情況，并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者之間可能存在的作用關(guān)系。研究結(jié)果顯示claudin-1蛋白在BCC中的表達(dá)明顯低于癌旁正常皮膚組織，推測(cè)可能其在腫瘤的發(fā)生中也參與作用。

本研究雖然從組織病理學(xué)上證實(shí)claudin-1蛋白在BCC中呈現(xiàn)低表達(dá)， 但其具體的作用分子機(jī)制不詳，應(yīng)采用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步探討。