李錦濯，林志鵬，曾倩文，孫仁山

大氣顆粒物（PM）是空氣動(dòng)力學(xué)直徑＜2.5 μm的大氣顆粒物，成分復(fù)雜，主要由重金屬、多環(huán)芳烴、過(guò)敏原、內(nèi)毒素等有害物質(zhì)組成[1,2]。皮膚是機(jī)體抵御PM2.5的第一道屏障，皮膚長(zhǎng)時(shí)間暴露在PM2.5中，PM2.5附著在皮膚表面，可以通過(guò)毛囊吸收[3]，作用于皮膚細(xì)胞，引發(fā)多種生物學(xué)效應(yīng)。流行病學(xué)研究表明PM2.5與多種皮膚病的發(fā)病率增加或癥狀加重相關(guān)[4,5]，對(duì)銀屑病、特應(yīng)性皮炎、痤瘡等炎癥性皮膚病以及皮膚老化、皮膚腫瘤均有一定的影響[6]，但是具體發(fā)生機(jī)制仍不明確。

既往關(guān)于PM2.5對(duì)皮膚損傷機(jī)制的研究認(rèn)為顆粒物及其吸附的有毒物質(zhì)可破壞皮膚屏障，對(duì)皮膚細(xì)胞具有直接毒性，造成細(xì)胞凋亡，同時(shí)可使皮膚細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)、芳香烴受體活化及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)等損傷效應(yīng)[7,8]。角質(zhì)形成細(xì)胞的表面受體識(shí)別外界環(huán)境危險(xiǎn)信號(hào)，產(chǎn)生和分泌抗菌肽、趨化因子及多種細(xì)胞因子，進(jìn)而趨化或激活其他免疫細(xì)胞，在皮膚天然免疫反應(yīng)及多種炎癥性皮膚病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[9]。本文通過(guò)檢測(cè)PM2.5刺激角質(zhì)形成細(xì)胞株（HaCaT細(xì)胞）后細(xì)胞存活率、凋亡率、核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白以及炎性因子CCL20可能的表達(dá)變化，旨在明確PM2.5對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)功能改變，初步探討PM2.5對(duì)皮膚的損傷作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）、CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）儀（美國(guó)BIO-RAD公司）、NanoDrop2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀（Thermo）、流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo）、ChemiDoc?Touch化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（BIO-RAD）等。

1.1.2 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司），CCK-8試劑盒（杭州聯(lián)科生物），PE Annexin V Apoptosis Detection Kit（美國(guó) BD 公司），RT-PCR引物（上海生物工程有限公司），SYBR Green 試劑盒（日本toyobo公司），RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本takara公司），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（武漢Elabscience公司），NF-κB單抗（美國(guó)CST公司）等。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5提取 PM2.5收集膜來(lái)自重慶市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心下面某監(jiān)測(cè)站點(diǎn)。將載有PM2.5的濾膜剪成 0.5 cm × 0.5 cm 小塊，置于離心管，加三蒸水超聲振蕩5 h。收集振蕩液，過(guò)濾。濾液經(jīng)真空冷凍干燥48 h，收集黑色絮狀產(chǎn)物，放射性核素60Co 放射滅菌后存放于-20℃冰箱。稱取適量PM2.5，超凈臺(tái)內(nèi)紫外照射30 min，用無(wú)菌PBS配成10 mg/ml的儲(chǔ)存液，存放于4℃冰箱。實(shí)驗(yàn)前用完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度混懸液（25、50、100、200、400 μg/ml）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞（重慶市陸軍軍醫(yī)大學(xué)防原教研室提供）。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。每2～3 d換液1次，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞傳代至3～5代內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 HaCaT細(xì)胞按處理?xiàng)l件分為兩組：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組：PM2.5濃度為0 μg/ml。實(shí)驗(yàn)組：不同濃度PM2.5刺激，PM2.5濃度為25、50、100、200、400 μg/ml；每個(gè) PM2.5 濃度組設(shè)了3個(gè)平行孔；不同時(shí)間PM2.5刺激，PM2.5濃度均為200 μg/ml。刺激時(shí)間為 1、3、6、、12、24 h，每個(gè)時(shí)間組設(shè)3個(gè)平行孔；實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 不同濃度PM2.5刺激：細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞融合至80%左右，不同濃度PM2.5刺激24 h，棄培養(yǎng)基。PBS洗滌2次，加100 μl含l0%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，加入10 μl CCK-8檢測(cè)試劑，孵育2 h。使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在450nm模式下測(cè)定各孔吸光度值（A值）。不同時(shí)間PM2.5刺激：刺激濃度為 200 μg/ml，分別在1、3、6、12、24 h檢測(cè)A值，方法同上。計(jì)算細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A-空白組A）/（對(duì)照組A-空白組A）×l00%。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種于24孔板，不同濃度PM2.5刺激24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液及胰酶消化下來(lái)的細(xì)胞。40 μm的細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，去除雜質(zhì)，離心，棄液。4℃預(yù)冷的PBS沖洗2次，離心，棄液。1× staining buffer 重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度 1 × 106/ml。吸取 100 μl細(xì)胞懸液于 U 型底 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加 1 μl PE Annexin V 和 1 μl 7-AAD 流式抗體，避光孵育 15 min。加 150 μl 1×staining buffer終止染色，1 h 內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 RT-PCR法檢測(cè)CCL20 mRNA表達(dá)水平 細(xì)胞接種于6孔板，不同濃度PM2.5刺激24 h后，提取細(xì)胞內(nèi)總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明，逆 轉(zhuǎn) 錄 合 成 cDNA。SYBR Green法 檢 測(cè) CCL20mRNA表達(dá)水平。引物序列：GAPDH 上游引物：5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'，下游引物：5'-CAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3'；CCL20上 游 引物：5'-TGTGCGTCTCCTCAGTAAAA-3'，下游引物：5'-CAAGTGAAACCTCCAACCC-3'。PCR運(yùn)行程序：95℃ 3 min，95℃ 10 s，58℃ 5 s，72℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，采用2-△△CT法分析目的基因的相對(duì)量呈表達(dá)。

1.2.7 ELISA法檢測(cè)CCL20分泌水平 細(xì)胞接種于12孔板，不同濃度PM2.5刺激24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心，取上清，-20 ℃冰箱保存。采用ELISA試劑盒推薦的步驟，檢測(cè)上清液中CCL20水平。

1.2.8 Western blot法檢測(cè)NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白細(xì)胞接種于6孔板，不同濃度PM2.5濃度刺激24 h后，每孔加入150 μl RIPA裂解液（含蛋白酶、磷酸酶抑制劑）裂解細(xì)胞獲得蛋白質(zhì)提取物。按照標(biāo)準(zhǔn)Western blot法上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)、顯影，比較GAPDH及NF-κB通路中p65、p-p65的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad prism7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照組比較，刺激濃度為50、100、200、400 μg/ml各組細(xì)胞存活率明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且刺激濃度越高，存活率越低（圖1a）；與對(duì)照組比較，刺激時(shí)間為3、6、12、24 h各組存活率明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且刺激時(shí)間越長(zhǎng)，存活率越低（圖1b）。

2.2 PM2.5對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡率的影響

與對(duì)照組比較，刺激濃度為50～400 μg/ml各組細(xì)胞凋亡率顯著增高（P＜0.01），且隨刺激濃度升高，細(xì)胞凋亡率逐漸增高（圖2）。

2.3 PM2.5對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)CCL20mRNA水平的影響

與對(duì)照組比較，暴露于 50 ～ 400 μg/ml PM2.5濃度各組細(xì)胞內(nèi)CCL20 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），且隨刺激濃度升高，mRNA表達(dá)水平逐漸增高（表1）。

2.4 PM2.5對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌CCL20水平的影響

與對(duì)照組比較，刺激濃度為25～400 μg/ml各組細(xì)胞分泌CCL20水平顯著升高（P＜0.05）；且隨PM2.5刺激濃度升高，細(xì)胞分泌CCL20水平逐漸增高（表1）。

2.5 PM2.5對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)NF-κB蛋白水平的影響

隨著PM2.5刺激濃度增高，細(xì)胞表達(dá)NF-κB p-p65蛋白水平逐漸上調(diào)。NF-κB p-p65是NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)上調(diào)，表明細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路激活（圖3）。

表1 不同濃度PM2.5刺激下HaCaT細(xì)胞表達(dá)CCL20 mRNA和分泌CCL20水平 （±s）

表1 不同濃度PM2.5刺激下HaCaT細(xì)胞表達(dá)CCL20 mRNA和分泌CCL20水平 （±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

濃度（μg/ml） CCL20 mRNA 變化倍數(shù)（2-△△ CT）CCL20 濃度（pg/ml）0 0.076±0.0197 43.3± 4.31 25 0.108±0.0686 105.1±23.16*50 0.588±0.1521* 265.7±32.34**100 0.855±0.2626* 303.7±28.18**200 1.489±0.2177** 470.8± 3.25**400 5.897±0.7249** 577.2±33.61**F值 43.97 71.58 P值 ＜0.0001 ＜0.0001

圖1 不同濃度與時(shí)間PM2.5刺激下細(xì)胞存活率

圖2 不同濃度PM2.5刺激下細(xì)胞凋亡率

圖3 不同濃度PM2.5刺激下細(xì)胞表達(dá)NF-κB蛋白水平

3 討論

本研究揭示PM2.5誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)NF-κB p-p65蛋白上調(diào)。NF-κB是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以特異性結(jié)合多種基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列位點(diǎn)，調(diào)控白細(xì)胞介素（IL）-1、腫瘤壞死因子（TNF）、IL-6等多種重要的細(xì)胞因子及黏附分子、趨化因子、生長(zhǎng)因子和免疫受體的表達(dá)[10]。NF-κB p-p65蛋白作為NF-κB信號(hào)通路中的一種關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)上調(diào)，表明該信號(hào)通路激活，異二聚體p50-p65進(jìn)入細(xì)胞核中與特定的κB位點(diǎn)結(jié)合，激活多種NF-κB靶基因，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[11]。上皮細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)在調(diào)節(jié)上皮組織穩(wěn)態(tài)以及在慢性炎癥疾病的病理機(jī)制中具有重要作用[12]。

同時(shí)，PM2.5誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞CCL20 mRNA表達(dá)水平及CCL20分泌水平上調(diào)，呈劑量依賴關(guān)系。CCL20是一種重要的趨化因子，細(xì)胞受體為CCR6。皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的 CCL20，通過(guò)趨化效應(yīng)使CCR6+的樹(shù)突狀細(xì)胞，Th17細(xì)胞和γδT淋巴細(xì)胞向皮損區(qū)募集，參與銀屑病的發(fā)病機(jī)制，CCL20在銀屑病皮損區(qū)表皮基底層表達(dá)明顯增多[13]。研究發(fā)現(xiàn)，使用CCL20單抗可以阻斷CCR6+T淋巴細(xì)胞向皮損區(qū)的募集，進(jìn)而顯著減輕小鼠銀屑病樣皮損[14]。研究認(rèn)為銀屑病易感人群表皮角質(zhì)形成細(xì)胞受到外在環(huán)境中毒素及微生物等刺激后，細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路激活及CCL20、IL-1等多種炎性因子表達(dá)增高，CCL20、IL-1等炎性因子通過(guò)募集樹(shù)突狀細(xì)胞并誘導(dǎo)其產(chǎn)生IL-23，進(jìn)而導(dǎo)致Th17細(xì)胞的增殖與活化，并產(chǎn)生IL-17、IL-22等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子反過(guò)來(lái)作用于角質(zhì)形成細(xì)胞，又進(jìn)一步導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生CCL20增多，最終形成惡性炎癥循環(huán)，在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[15]。且研究發(fā)現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的CCL20主要依賴于細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路的激活[16]。

既往關(guān)于PM2.5刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，急性PM2.5暴露可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞內(nèi)胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）、TNF-α、IL-1α、IL-8數(shù)種炎性因子的釋放，可能與PM2.5增加濕疹發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[17]。文獻(xiàn)報(bào)道急性PM2.5暴露可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路激活，進(jìn)而介導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)[18]。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)PM2.5刺激后，HaCaT細(xì)胞中的NF-κB和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NALP3）炎癥體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Zhang等采用蛋白微陣列芯片檢測(cè)NF-κB蛋白，而本研究采用Western blot法檢測(cè)NF-κB p-p65蛋白水平，結(jié)果一致，均顯示PM2.5刺激角質(zhì)形成細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路被激活。這些研究結(jié)果均表明角質(zhì)形成細(xì)胞受PM2.5刺激后細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)信號(hào)通路激活，促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生增多。

本研究結(jié)果還顯示PM2.5刺激角質(zhì)形成細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低，凋亡率增加。這與薛晨紅等[20]研究結(jié)果基本一致，認(rèn)為PM2.5對(duì)HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞S期阻滯，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果表明，PM2.5可降低角質(zhì)形成細(xì)胞存活率，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且可能通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子CCL20的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而介導(dǎo)多種慢性皮膚炎癥反應(yīng)，具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。