王中華，丁佳，吳健,3,4**

（1. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，上海 200032；2. 上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院消化科，上海 200040；3. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化科，上海 200032；4. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院上海市肝病研究所，上海 200032）

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是由代謝異常所致的一類肝病，在初期單純性脂肪肝，即非酒精性脂肪肝（NAFL）階段可通過飲食或運動干預(yù)達到逆轉(zhuǎn)的效果，發(fā)展至非酒精性脂肪性肝炎（NASH）階段可引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)及肝細胞損傷，誘發(fā)纖維化。由于目前對NASH 及肝纖維化尚無有效治療手段，在評估治療NASH 候選藥物療效時，尋求合理有效終點指標(biāo)成為NASH 治療的關(guān)鍵。筆者查閱和結(jié)合近年來本團隊研究及中外文獻，闡述NASH肝纖維化相關(guān)的病理生理機制，歸納總結(jié)正在進行的Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗藥物，旨在為NASH 治療策略提供理論依據(jù)，并進一步評估相應(yīng)纖維化干預(yù)靶點的合理性和有效性。

NAFLD 是以肝細胞脂肪變性為主要特征，與營養(yǎng)代謝異常密切相關(guān)的一類肝臟疾病。隨著肥胖、糖尿病和代謝綜合征的廣泛流行，NAFLD 患病率逐年增加，已經(jīng)成為影響全球的健康問題[1-2]。由于乙型肝炎病毒（HBV）疫苗預(yù)防接種的普及和抗病毒藥物的有效治療，HBV 的發(fā)病率正在逐年降低。而我國非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病率已達15%[3]，最近的報道已達29.2%[4]，遠超過HBV 及丙型肝炎病毒（HCV）感染率的總和，并有向低齡化發(fā)展的趨勢。既往觀點認為NAFLD 進入肝硬化期后才會出現(xiàn)原發(fā)性肝癌（HCC）。但最新臨床研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生于NASH 的HCC 呈上升趨勢，不明原因的HCC大多起因于NASH，并且HCC 可出現(xiàn)于不伴明顯肝硬化的NASH 患者[5]。NASH 相關(guān)肝癌已成為美國近年來肝癌發(fā)病率持續(xù)上升的主要原因。有報道表明，NASH 相關(guān)肝硬化患者71%伴有糖尿病，這類患者5 年內(nèi)HCC 發(fā)生率可達10.2%[6]，高于其他肝硬化并發(fā)肝癌的概率。因此，NASH 纖維化進展至肝硬化和肝癌的高發(fā)生率越來越受到肝病學(xué)者的重視，筆者所在課題組在此領(lǐng)域也取得一些實質(zhì)性的研究進展[7-8]。

1 非酒精性脂肪性肝炎及肝纖維化的病理生理 特征

NASH 患者多伴有肥胖、代謝綜合征、糖尿病和高脂血癥等，不同NAFL 個體進展至NASH 的過程和機制也不同。因此，NASH 是一種多病因、個體差異較大、脂毒性造成的肝臟慢性疾病。NASH的主要病理特征為肝細胞脂肪變伴有氣球樣變性，合并小葉內(nèi)炎癥。病理上常以肝細胞脂肪變程度、氣球樣變性、炎癥細胞浸潤分級作為NAFLD 活動性評分（NAS）[9]。NAS 小于等于4 為NAFL，而高于此值則是診斷NASH 的病理依據(jù)。持續(xù)的肝細胞損傷及炎癥反應(yīng)啟動修復(fù)過程，這一過程包括肝細胞的再生和以膠原纖維為主細胞外基質(zhì)的沉著，即纖維化的過程。正常情況下肝臟纖維組織的形成和降解保持在一個動態(tài)平衡的狀態(tài)。但是在脂毒性的作用下，肝細胞發(fā)生壞死、凋亡及肝組織炎癥反應(yīng)，激活Kupffer 細胞分泌多種細胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）、血小板源性生長因子（PDGF）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）等，進一步激活肝星狀細胞（HSC）并轉(zhuǎn)變?yōu)榧±w維母細胞，發(fā)生表型和功能轉(zhuǎn)變，通過旁分泌和自分泌機制，不斷刺激HSC 自身分裂增殖，合成和分泌大量膠原等多種細胞外基質(zhì)，同時激活其他尚處于“靜息”狀態(tài)的HSC，造成動態(tài)平衡被破壞，纖維組織形成增多而降解減少，最終導(dǎo)致肝纖維化。因此，HSC 的活化及增殖被認為是肝纖維化啟動及持續(xù)因素，同時HSC 本身也是肝纖維化的效應(yīng)細胞。不同病因所致肝纖維化有各自的特點。NASH 伴發(fā)肝纖維化的特征為肝細胞周圍及肝竇區(qū)域纖維化沉積，后期出現(xiàn)匯管區(qū)纖維化。NASH 伴發(fā)肝纖維化早期隨著肝細胞脂毒性減輕，炎癥反應(yīng)緩解，纖維化有可能逆轉(zhuǎn)。但若NASH 不加控制，肝纖維化將逐漸加重。判斷肝纖維化嚴(yán)重程度最可靠的方法是肝活檢病理分級，根據(jù)公認的標(biāo)準(zhǔn)分為F1 ～ F4 期。NASH 肝纖維化的程度大多處于F1 ～ F2 期，部分可進展到F3 ～ F4 期，后者出現(xiàn)表明已進入重度纖維化及肝硬化期[9]。研究證明，肝纖維化分期與NASH 患者生存期呈負相關(guān)，F(xiàn)3 和F4 期患者的生存年限較無肝纖維化NASH 患者分別減少約10 和20 年[10]。

脂毒性肝損傷是NASH 主要的病理生理機制，代謝綜合征和內(nèi)臟脂肪組織堆積會引起肝內(nèi)脂質(zhì)積累，從而通過氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、胰島素抵抗等多種途徑引起肝細胞損傷[11-12]。此外，腸道微生態(tài)改變，短鏈脂肪酸、脂多糖、DNA、多胺代謝物等細菌產(chǎn)物對肝臟脂肪積蓄、炎癥應(yīng)答、胰島素抵抗起推動作用，進而促進肝纖維化發(fā)展[13]。由此，持續(xù)脂毒性肝細胞損傷和炎癥應(yīng)答很可能是肝纖維化進展的誘導(dǎo)、維持和促進因素。筆者所在課題組的研究也表明脂肪酸所致的肝細胞凋亡以及炎癥小體活化是引起肝細胞損傷和纖維化的主要途徑[11,14-15]。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)肝細胞線粒體損傷導(dǎo)致三羧酸循環(huán)障礙，琥珀酸積蓄釋放入細胞間質(zhì)，通過HSC 表面的GPR-91 受體導(dǎo)致HSC活化，是NASH 肝纖維化進展的重要分子基礎(chǔ)[16]，這為干預(yù)NASH 肝纖維化進展提供了有效治療靶點。

2 肝纖維化與非酒精性脂肪性肝炎患者的生活 質(zhì)量和生存期顯著相關(guān)

NASH 患者肝功能損傷指標(biāo)如轉(zhuǎn)氨酶等升高程度不如病毒性肝炎、藥物性肝炎明顯，單純性肝脂肪變往往無明顯生化指標(biāo)異常。當(dāng)進展至NASH 時才表現(xiàn)出輕度肝功能檢查異常，很少出現(xiàn)黃疸，往往不引起患者的重視，就診率較低。早期肝纖維化也不一定出現(xiàn)顯著臨床癥狀和體征，常在影像學(xué)檢查時發(fā)現(xiàn)。肝纖維化出現(xiàn)是疾病活動的表現(xiàn)，而肝纖維化的嚴(yán)重程度是NASH 患者發(fā)生并發(fā)癥和死亡的重要危險因素[17-19]。一項多中心回顧性研究納入619 例NAFLD 患者，分析了起始組織學(xué)以及隨后平均12.6 年隨訪結(jié)果。其NAFLD 的入選標(biāo)準(zhǔn)為影像學(xué)確診肝脂肪樣變，同時滿足谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）持續(xù)高于正常值。該研究發(fā)現(xiàn)，主要肝臟相關(guān)事件如肝移植等的危險率在NASH 和非NASH 觀察對象之間沒有顯著差異，但伴有肝纖維化患者出現(xiàn)肝臟相關(guān)事件的危險率顯著高于無肝纖維化者。雖然這些主要終點事件的危險率在不同NAS 分級間沒有明顯差異，但會隨著纖維化分級增加而升高。因此，評估肝纖維化對判斷NASH 的嚴(yán)重程度和疾病進展尤為重要，也是疾病隨訪的重要內(nèi)容[18,20]。

Hagstr?m 等[19]對646 名 經(jīng) 肝 活 檢 證 實 的NAFLD 患者進行了回顧性隊列研究，在校正年齡、性別和2 型糖尿病等因素后，12%NAFLD 患者和2.2%對照組在平均20 年隨訪中患有嚴(yán)重肝?。≒＜ 0.001）。與對照組相比，肝纖維化分期和患嚴(yán)重肝病的風(fēng)險成正比（危險比從F0 期的1.9 升至F4 期的104.9）。與無纖維化的NAFLD 患者相比，伴F3 和F4 期纖維化的NASH 患者死亡率顯著升高。2019 年美國肝病年會發(fā)表的一項隨訪長達22 年、納入13 427 例患者的研究表明，嚴(yán)重肝纖維化是引起NAFLD 患者死亡率上升的主要危險因素之一。因此，肝病科醫(yī)師應(yīng)密切監(jiān)測F3 和F4 期NAFLD患者，評估其出現(xiàn)肝臟相關(guān)并發(fā)癥的可能性。

3 非酒精性脂肪性肝炎治療藥物的臨床終點 指標(biāo)

多家藥企正在進行的Ⅲ期臨床試驗的主要臨床終點集中在改善F2 ～ F3 期纖維化，延緩NASH 的進展，而Ⅱ期臨床試驗的終點主要集中于藥物的安全性、耐受性及降低NAS 評分。對于Ⅱa 期臨床試驗，許多試驗初步評價藥物能否改善肝脂肪變，并不需要實施肝活檢，將核磁影像檢測質(zhì)子密度脂肪分數(shù)（PDFF）作為肝脂肪含量的判斷指標(biāo)。由于肝纖維化無可靠非創(chuàng)傷性檢查指標(biāo)，Ⅲ期臨床試驗仍將肝活檢作為評估NASH 和纖維化嚴(yán)重程度的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。作為侵入性檢查，肝活檢操作具有一定的風(fēng)險性，也存在取樣及病理評判誤差。超聲FibroScan 檢測肝硬度（LSM）是一項無創(chuàng)性評估肝纖維化技術(shù)[21-23]，其配備的受控衰減參數(shù)（CAP）軟件可對肝脂肪變進行定量分析，提高NAFLD 患者瞬時彈性成像測量LSM 的準(zhǔn)確性[24]。而磁共振二維實時剪切波彈性成像（SWE）在判斷肝纖維化程度方面已成為一種很有前景的無創(chuàng)影像學(xué)手段。目前對胰島素抵抗大多采用實驗室診斷指標(biāo)，如糖耐量試驗、空腹胰島素、糖化血紅蛋白水平等?？傊?，在無其他生化或影像學(xué)檢查可替代的情況下，對于Ⅲ期臨床試驗，采用肝組織活檢進行NAS 和肝纖維化半定量評分是判斷受試者NASH 及肝纖維化是否進展和消退最有說服力的指標(biāo)。

4 非酒精性脂肪性肝炎和肝纖維化的相關(guān)靶點 及臨床在研新藥

如前所述，肝臟脂肪累積及脂毒性是NASH 肝損傷的起始原因。肥胖、代謝綜合征、糖尿病等都會出現(xiàn)胰島素抵抗，肝內(nèi)脂肪分解減少，加劇肝臟脂肪蓄積[25]。胰島素抵抗還會促進脂肪因子和炎性細胞因子的產(chǎn)生和分泌，造成線粒體功能異常、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[26]。上述營養(yǎng)代謝異常引起持續(xù)性肝臟炎癥和修復(fù)應(yīng)答，HSC 活化及細胞外間質(zhì)的合成增加，最終導(dǎo)致肝纖維化。反映肝臟脂肪沉積、肝細胞炎癥損傷和胰島素抵抗等無創(chuàng)性指標(biāo)易于監(jiān)測，但由于無可靠非侵入性肝纖維化評價指標(biāo)，將肝活檢組織學(xué)改善（纖維化程度至少降低1個級別）作為NASH 藥物治療的Ⅲ期臨床試驗主要終點指標(biāo)往往難以達到，臨床效果難以令人滿意。NASH 涉及多種發(fā)病機制，針對每種機制的關(guān)鍵分子靶點已經(jīng)被應(yīng)用到新型治療藥物的研發(fā)中，其中幾種已在前期臨床試驗中顯現(xiàn)出希望，在此重點介紹進入Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗的NASH 治療藥物及其作用機制。

賴氨酰氧化酶樣蛋白-2（LOXL2）是一種與膠原蛋白交聯(lián)相關(guān)的酶，其在肝纖維化組織中高表達。盡管單克隆抗體治療NASH 模型動物的研究顯示LOXL2 抑制劑可以改善肝纖維化[27]，但GS-6624（Gilead Sciences）對于伴有顯著纖維化的NASH患者的隨機、雙盲、安慰劑對照的Ⅱb 期臨床試驗未能達到改善肝纖維化的主要終點指標(biāo)。另一種化合物selonsertib[28]，是凋亡信號通路調(diào)節(jié)激酶1（ASK-1）抑制劑。ASK-1 是氧化應(yīng)激以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵激酶，參與肝細胞凋亡、Kupffer 細胞活化及HSC 激活。其抑制劑selonsertib 在臨床前期被認為是有希望的制劑之一，因其能對NASH 及肝纖維化的多個環(huán)節(jié)起到抑制作用。在早期試驗中，Selonsertib 也顯現(xiàn)降低炎癥活動和纖維化程度的療效，但因在Ⅲ期臨床試驗中期評估未達到改善纖維化的終點指標(biāo)而宣告終止[28]。經(jīng)歷同樣命運的還有泛半胱氨酸蛋白酶抑制劑emricasan，也因Ⅱ期臨床試驗未達到改善肝纖維化的主要終點而終止。炎癥反應(yīng)引起單核細胞趨化因子（MCP）釋放及其受體CCR2/5 的激活，使得MCP-CCR2/5 阻滯劑cenicriviroc成為治療NASH的候選靶向藥物之一[29]。CCR2/5 受體存在于淋巴細胞、Kupffer 細胞及HSC表面，cenicriviroc 通過抑制這些細胞在NASH 形成過程中的炎癥反應(yīng)，降低活化和促進纖維化的信號。因在NASH Ⅱ期臨床試驗中對纖維化有顯著改善，明顯優(yōu)于安慰劑[30]，該藥物進入Ⅲ期臨床試驗。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）α/σ 雙重激動劑elafibranor 在Ⅱ期臨床試驗表現(xiàn)出對NAS 改善作用及肝纖維化的緩解[30]，已通過RESOLVE-IT Ⅲ期臨床試驗中期評估，決定繼續(xù)按原定的72 周方案進行試驗。另一PPAR-α/γ 雙重激動劑saroglitazer 的Ⅱ期臨床試驗也已完成，NASH 患者ALT 水平下降44.39%，達到主要臨床終點指標(biāo)。Saroglitazer 通過調(diào)節(jié)脂肪代謝和增強胰島素敏感性來減少肝內(nèi)脂肪含量（磁共振PDFF 指標(biāo)）。以奧貝膽酸（OCA）為代表的法尼酯X 受體（FXR）激動劑在FLINT Ⅱ期臨床試驗中取得了較滿意的療效，除改善NAS外，35%的NASH 患者肝纖維化得到改善，顯著高于安慰劑組的改善率（19%）[31]。Intercept 公司宣布長達18 個月的REGENERATE Ⅲ期臨床試驗已達到改善NASH 患者肝纖維化的終點目標(biāo)。奧貝膽酸因此成為首個申請FDA 審批的抗NASH 纖維化藥物。但其18 個月臨床改善率并不令人滿意，相比于安慰劑組11.9%的臨床改善率，奧貝膽酸每日25 mg 和10 mg 劑量組的臨床改善率分別為23.1%和17.6%。此外，有17%（115/658）患者出現(xiàn)血清低密度脂蛋白升高，51%（336/658）患者出現(xiàn)瘙癢等不良反應(yīng)，9%患者因瘙癢或其他不良反應(yīng)而停藥。甲狀腺素受體-β（THR-β）激動劑MGL-3196，也已進入Ⅲ期臨床試驗。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動劑利拉魯肽（liraglutide）[32]、成纖維細胞生長因子-21（FGF-21） 類似物pegbelfermin-BMS-986036[33]也已完成NASH 治療的Ⅱ期臨床試驗。

表1 介紹了NASH 主要靶點及相關(guān)藥物的作用機制和臨床試驗進展情況。表2 重點介紹了目前已開展Ⅲ期臨床試驗的代表性藥物。

調(diào)平控制系統(tǒng)Bode圖如圖5，相位裕度和幅值裕度均為正，該調(diào)平控制系統(tǒng)是穩(wěn)定的。由Simulink仿真可得出控調(diào)平制系統(tǒng)單位階躍響應(yīng)曲線(圖6)，調(diào)平控制系統(tǒng)能達到穩(wěn)定狀態(tài)，但響應(yīng)較慢，需設(shè)計模糊PID控制器。

5 結(jié)語

NAFLD 的發(fā)病機制及疾病發(fā)展過程非常復(fù)雜，涉及肝實質(zhì)細胞、非實質(zhì)細胞、免疫細胞和多種細胞因子及通路。這些病理生理機制的關(guān)鍵靶點對于開發(fā)NASH 和肝纖維化非侵入性標(biāo)記物以及靶向治療藥物十分重要。現(xiàn)有臨床治療主要針對單一靶點和通路，療效欠佳。因此，開發(fā)安全有效并針對NASH 和肝纖維化進展的多因素和環(huán)節(jié)的特異性藥物，以及合用作用于不同靶點的藥物已成為治療NASH 及肝纖維化的新策略。已完成Ⅱ期臨床試驗或正開展的Ⅲ期臨床試驗藥物作用于NASH 及肝纖維化的多個環(huán)節(jié)，包括脂質(zhì)代謝、脂毒性、過氧化應(yīng)激、胰島素抵抗、炎癥及免疫應(yīng)答、細胞調(diào)亡、肝纖維化和膠原轉(zhuǎn)化等。這些藥物除對NASH 脂肪積蓄、炎癥應(yīng)答、胰島素抵抗等過程中的酶、轉(zhuǎn)錄因子、脂肪因子或炎癥因子受體具有靶向作用外，能否阻止肝纖維化的進展是判斷其成為NASH 特異性藥物的重要標(biāo)準(zhǔn)。其中，F(xiàn)XR 激動劑奧貝膽酸、CCR2/5 拮 抗 劑cenicriviroc、PPAR-α/σ 雙 重 激 動劑elafibranor 都不直接抑制對肝纖維化起重要作用的HSC，而是減少肝細胞的脂肪積累、脂毒性、改善胰島素抵抗、降低肝臟的炎癥反應(yīng)，從而減少對HSC 的刺激、阻止肝纖維化的進展。

表 1 NASH 主要靶點及相關(guān)藥物[34]Table 1 Main targets of NASH and related drugs

表 2 已完成、終止和正在進行的抗NASH 藥物Ⅲ期臨床試驗Table 2 Completed, terminated and ongoing clinical trials for anti-NASH drugs