王相偉

摘要：細(xì)胞色素P450單加氧酶（P450BM3）能特異性催化脂肪酸ω碳位羥基化反應(yīng)生成羥基脂肪酸，在前期構(gòu)建攜帶單加氧酶基因P450BM3工程大腸桿菌（Escherichia coli）轉(zhuǎn)化脂肪酸的基礎(chǔ)上，為解決外源脂肪酸在羥基化過(guò)程中的消耗和轉(zhuǎn)運(yùn)問(wèn)題，構(gòu)建了脂?；o酶A合成酶基因（fadD）缺失和外膜蛋白編碼基因（fadL）過(guò)表達(dá)的工程菌株。搖瓶條件下羥基十二酸產(chǎn)量達(dá)到748.8 mg/L，轉(zhuǎn)化率為93.6%。

關(guān)鍵詞：脂酰輔酶A合成酶;外膜蛋白編碼基因;羥基脂肪酸;重組大腸桿菌（Escherichia coli）

中圖分類(lèi)號(hào)：TS206.4 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）01-0152-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.035 ? ? ? ? ? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Cytochrome P450BM3 can hydroxylates fatty acids into hydroxyfatty acids（HFAs） at the ω-positions with high entioselectivity. Based on the construction of Escherichia coli carrying P450BM3 gene to transform fatty acids. As an effort to solve inhibit fatty acid β-oxidation and increase outer membrane fatty acids transporter， the lipoacyl-coa synthase gene（fadD） deletion and outer membrane proteins encode gene（fadL） overexpression strains were built. Under shake-flask conditions， this recombinant strains produced 748.8 mg/L hydroxy dodecanoic acid， meanwhile the conversion rate was 93.6%.

Key words： lipoacyl-coa synthase gene（fadD）; outer membrane proteins encode gene（fadL）; hydroxy fatty acid; recombinant Escherichia coli

羥基脂肪酸是合成假神經(jīng)酰胺、聚酯以及內(nèi)酯的重要前體[1-3]，其中，ω-羥基脂肪酸由于羥基位于首位碳鏈端，可為聚合物材料合成提供最長(zhǎng)碳鏈，是生物可降解材料研究開(kāi)發(fā)中最理想的原料之一[4-6]。由于傳統(tǒng)化學(xué)合成的局限性，微生物合成羥基脂肪酸已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[7]。

微生物轉(zhuǎn)化脂肪酸合成羥基脂肪酸具有轉(zhuǎn)化效率低的特點(diǎn)[8]，為提高外源脂肪酸轉(zhuǎn)化率和羥基脂肪酸產(chǎn)量，引入增加胞外脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)量和降低菌體β氧化途徑的策略，通過(guò)敲除脂?；o酶A合成酶基因（fadD）阻斷脂肪酸β氧化途徑[9，10]，以增加底物脂肪酸濃度;過(guò)表達(dá)大腸桿菌（Escherichia coli）外膜蛋白編碼基因（fadL），增大外源脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)量[11，12]。通過(guò)對(duì)重組菌發(fā)酵條件的優(yōu)化，有效提高了外源脂肪酸轉(zhuǎn)化率和ω-羥基脂肪酸產(chǎn)量。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?菌株、質(zhì)粒和引物 ?Escherichia coli BL21 （DE3）和Escherichia coli DH5α，Invitrogen公司;菌株Bacillus megaterium 14581、Escherichia coli K-12、質(zhì)粒pET-28a（+）和pACYCDuet-1，Novagen公司。

工程菌Escherichia coli BL21（DE3）+pACYCDuet-1-P450BM3記作WX1;Escherichia coli BL21（DE3）△fadD+pACYCDuet-1-P450BM3，記作WX2;Escherichia coli BL21（DE3）△fadD+pACYCDuet-1-P450BM3+pET-28a（+）-fadL，記作WX3。3種工程菌株由山東大學(xué)（威海）海洋學(xué)院實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏。菌株WX1攜帶質(zhì)粒pACYCDuet-1，質(zhì)粒上攜有脂肪酸羥化酶基因P450BM3，菌株WX2、WX3為fadD基因敲除型，質(zhì)粒pET-28a（+）攜帶fadL基因。本研究所用菌株、質(zhì)粒及引物見(jiàn)表1。

1.1.2 ?試劑與培養(yǎng)基 ?Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、dNTP、感受態(tài)細(xì)胞，Takara公司;限制性?xún)?nèi)切酶及膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒等，生工生物工程（上海）股份有限公司;十二酸（月桂酸）、10-羥基癸酸、卡那霉素、氯霉素、胰蛋白胨、酵母提取物及IPTG等，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

LB液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0。

M9發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，磷酸氫二鈉6，磷酸二氫鉀3，氯化銨1，氯化鈉0.5，硫酸鎂0.12。

1.1.3 ?儀器與設(shè)備 ?Aglient 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Aglient Technologies公司;LDZM-80KCS型蒸氣滅菌器，馳通儀器（上海）有限公司;ZHWY-1102B恒溫?fù)u床，上海申安醫(yī)療器械廠;Neofuge15R型冷凍離心機(jī)，力新儀器（上海）有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?發(fā)酵條件 ?構(gòu)建的工程菌株以1∶100的比例轉(zhuǎn)接至500 mL M9培養(yǎng)基搖瓶中，菌株WX1和WX2培養(yǎng)時(shí)加入終濃度34 mg/L氯霉素，菌株WX3添加終濃度34 mg/L氯霉素和50 mg/L卡那霉素。恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)至菌體OD600 nm為2.0，加入IPTG（0.1 mmol/L）誘導(dǎo)基因表達(dá)，為增加蛋白表達(dá)活性，培養(yǎng)溫度降為30 ℃，以利于蛋白表達(dá)[13]。在菌體培養(yǎng)至指數(shù)后期，菌體用0.2 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.4）配成菌懸液，添加葡萄糖（0.5%）和脂肪酸進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)。

1.2.2 ?代謝產(chǎn)物處理與分析 ?產(chǎn)物處理及檢測(cè)參考文獻(xiàn)[14]，離心收集發(fā)酵液上清，6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，利用等體積氯仿抽提，抽提液加入甲酯化試劑（H2SO4/CH3OH）于60 ℃水浴酯化反應(yīng)20 min后，等體積正己烷萃取。利用Aglient 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性，以10-羥基癸酸為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。

轉(zhuǎn)化率=ω-羥基脂肪酸產(chǎn)量/外源脂肪酸添加量×100%

代謝產(chǎn)物分析色譜條件為HP-5毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）;升溫程序?yàn)槠鹗?0 ℃，持續(xù)2 min，5 ℃/min升溫至250 ℃，保持10 min。加樣器和檢測(cè)器溫度分別為250 ℃和300 ℃。

質(zhì)譜條件為電子轟擊（EI）離子源，離子能量70 eV，離子源溫度220 ℃;掃描模式為全掃描;質(zhì)量掃描范圍m/z為10～600。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?fadD基因缺失對(duì)羥基脂肪酸產(chǎn)量的影響

大腸桿菌脂肪酸β氧化途徑過(guò)程會(huì)消耗脂肪酸[15]，因此在羥基脂肪酸的合成途徑中敲除脂酰基輔酶A合成酶基因，可以減少羥化底物的消耗，增加羥基脂肪酸產(chǎn)量。在P450單加氧酶（P450BM3）成功表達(dá)的基礎(chǔ)上，為驗(yàn)證fadD基因缺失對(duì)羥基脂肪酸產(chǎn)量的促進(jìn)作用，分別將重組菌WX1和WX2接種至M9基本培養(yǎng)基中，添加1 mmol/L十二酸測(cè)定細(xì)胞羥基脂肪酸產(chǎn)量的變化情況。搖瓶試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株WX2發(fā)酵后羥基十二酸產(chǎn)量為163.8 mg/L（轉(zhuǎn)化率81.9%），是對(duì)照菌株WX1產(chǎn)量的1.9倍（圖1）。表明在Escherichia coli中敲除脂?；o酶A合成酶后，對(duì)羥基脂肪酸產(chǎn)量有了明顯的促進(jìn)作用，提高了Escherichia coli羥基脂肪酸合成能力。

2.2 ?fadD基因缺失和fadL基因過(guò)表達(dá)對(duì)羥基脂肪酸產(chǎn)量的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證fadL基因過(guò)表達(dá)對(duì)羥基脂肪酸產(chǎn)量的影響，分別將重組菌WX2和WX3接種至M9基本培養(yǎng)基中，添加1 mmol/L十二酸測(cè)定HFAs的產(chǎn)量。在搖瓶條件下，經(jīng)GC檢測(cè)，菌株WX3發(fā)酵后羥基十二酸產(chǎn)量為189.4 mg/L（轉(zhuǎn)化率94.7%），是WX2菌株產(chǎn)量的1.2倍（圖1）。表明在Escherichia coli中過(guò)表達(dá)大腸桿菌fadL基因，有利于提高脂肪酸轉(zhuǎn)化率和菌株羥基脂肪酸產(chǎn)量，是提高Escherichia coli羥基脂肪酸合成能力的有效途徑。

2.3 ?底物十二酸濃度對(duì)羥基脂肪酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的影響

為更進(jìn)一步提高羥基脂肪酸（HFAs）產(chǎn)量，對(duì)底物十二酸不同濃度進(jìn)行了研究，在濃度為1～5 mmol/L，菌株WX3濃度為1～4 mmol/L時(shí)產(chǎn)量隨濃度增加而增加，底物轉(zhuǎn)化率維持在較高的水平（>90%），在4.0 mmol/L時(shí)羥基十二酸產(chǎn)量達(dá)到最大值748.8 mg/L（轉(zhuǎn)化率93.6%）（圖2）。然而隨著底物濃度增大，羥基脂肪酸產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率降低，在濃度為5 mmol/L時(shí)產(chǎn)量?jī)H為529.9 mg/L（轉(zhuǎn)化率26.8%），原因可能是隨底物脂肪酸濃度增大引起酶失活或?qū)?xì)胞有毒害作用[16]，導(dǎo)致羥基脂肪酸產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率的降低。

2.4 ?fadD基因缺失和fadL基因過(guò)表達(dá)對(duì)羥基脂肪酸組成的影響

通過(guò)GC-MS方法對(duì)菌株WX1和WX3產(chǎn)物組成進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖3所示。工程菌株WX1和WX3產(chǎn)物均含有3種羥基脂肪酸，分別為ω-1羥基十二酸、ω-2羥基十二酸和ω-3羥基十二酸。其中，ω-1羥基十二酸在兩種工程菌種產(chǎn)物中所占比例最高，在40.7%～43.7%，無(wú)明顯差異。產(chǎn)物ω-2羥基十二酸和ω-3羥基十二酸所占比例差別不大，分別為31.1%、28.3%和27.5%、28.8%。表明fadD基因缺失和fadL基因過(guò)量表達(dá)僅影響羥基脂肪酸產(chǎn)量而不影響其種類(lèi)和組成。

3 ?小結(jié)與討論

研究的目的是構(gòu)建能高效轉(zhuǎn)化外源脂肪酸生成羥基脂肪酸的菌株，在試驗(yàn)中構(gòu)建了敲除大腸桿菌脂酰基輔酶A合成酶基因和過(guò)表達(dá)外膜蛋白編碼基因的菌株以提高羥基脂肪酸的產(chǎn)量，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，基因工程菌株WX3羥基十二酸產(chǎn)量為189.4 mg/L，轉(zhuǎn)化率為94.7%，相比原始菌株產(chǎn)量（82.4 mg/L）和轉(zhuǎn)化率（41.2%）均有較大的提高。增加底物濃度至4 mmol/L，羥基十二酸產(chǎn)量達(dá)748.8 mg/L（轉(zhuǎn)化率93.6%），代表了生物轉(zhuǎn)化脂肪酸生成羥基脂肪酸的一個(gè)較高水平。在今后的研究中，通過(guò)尋找反應(yīng)性更強(qiáng)的羥化酶以及對(duì)大腸桿菌進(jìn)行進(jìn)一步代謝工程改造，羥基脂肪酸產(chǎn)量有望得到進(jìn)一步的改善和提高。

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