劉曄 洪潤丹 王志國 劉涵云 孟琛達 王茹 徐全臣

1.青島大學附屬醫(yī)院口腔內科 青島 266003；2.青島大學口腔醫(yī)學院 青島 266003；3.青島大學附屬醫(yī)院美容整形科 青島 266003；4.青島大學附屬醫(yī)院感染性疾病科 青島 266003

20世紀90年代，巨噬細胞（macrophages，Mφ）極化是指在極化刺激因子脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）和干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）組合誘導下，生成經典活化的M1型Mφ，即M1 Mφ[1]。后來發(fā)現(xiàn)，IFN-γ刺激的Mφ還能被輔助型T細胞2（T helper 2 cell，Th2）分泌的Th2型細胞因子白細胞介素（interleukin，IL）-4和IL-13所抑制，而Th2型細胞因子刺激的Mφ被命名為替代活化型Mφ，即M2 Mφ[2]。M1 Mφ可產生促炎細胞因子并誘導Th1型免疫反應；而M2 Mφ主要分泌抑制性細胞因子并介導免疫調節(jié)，清除凋亡細胞和碎片，參與組織修復[3-4]。目前，Mφ的極化狀態(tài)在機體免疫反應中起著關鍵作用，調節(jié)炎癥的發(fā)生和消退，參與獲得性免疫反應，影響組織的修復進程，是當前生物治療研究熱點[5]。

外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）衍生的Mφ（PBMC Mφ）和人單核細胞株THP-1衍生的Mφ（THP-1 Mφ）在極化研究中常被用作體外細胞模型[6-7]。PBMC直接來源于機體組織，更能反映體內狀態(tài)；然而該細胞存在提取效率低，無增殖能力，無法凍存，體外培養(yǎng)需要加入生長因子維持性狀，供體間差異較大等諸多問題，其應用較為受限[8]。為克服這些缺點，學者們使用THP-1建立Mφ的研究模型。THP-1是人單核細胞系，易于獲取，操作簡便，純度高，遺傳背景相同且能無限傳代，使用較為廣泛[9]。但是有研究[10]指出，不同來源的Mφ在不同分化狀態(tài)下的表型屬性存在差異，會影響實驗結果。本實驗在建立PBMC體外分離和培養(yǎng)模型的同時，比較了THP-1 Mφ和PBMC Mφ的極化特性，為THP-1替代原代PBMC的應用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS；BI公司，以色列），Trizol、逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq（Takara公司，日本），佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA；Mce公司，美國），LPS（Sigma公司，美國），人重組IFN-γ（human recombinant IFN-γ，rhIFN-γ）、人重組IL-4（human recombinant IL-4，rhIL-4）（PeproTech公司，美國），人重組巨噬細胞集落刺激因子（human recombinant macrophage colony-stimulating factor，rhM-CSF）、淋巴細胞分離液Ficoll（北京索萊寶科技有限公司），CD14免疫磁珠分選試劑盒和磁極、流式抗體抗人CD86-PE和CD206-PE（Biolegend公司，美國）。

1.2 原代PBMC的分離和培養(yǎng)

在征得供體知情同意的條件（倫理學批號：QYFYWZLL25653）下，采集健康人新鮮外周血20 mL置于抗凝管中，并用生理鹽水按體積比1：1稀釋。

吸取淋巴細胞分離液Ficoll置于離心管內，將相同體積的稀釋血液沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持界面清楚。在室溫下以2 000 r·min-1水平離心20 min，液體可分為3層。在上層和中層間的界面處有一個以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶（圖1）。將吸管插到云霧層，小心吸取細胞置于離心管中，并且加入5倍體積無血清RPMI 1640培養(yǎng)基混勻。1 500 r·min-1離心10 min后吸棄上清液，洗滌2次。隨后用3 mL含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基將底部沉淀混勻，過濾細胞懸液并計數(shù)。根據(jù)試劑盒說明，應用免疫磁珠法分選CD14+PBMC。

洗脫的細胞使用含10% FBS以及40 ng·mL-1rhM-CSF的RPMI 1640培養(yǎng)基調整細胞密度，密度達到每毫升3×106個細胞后接種于6孔板，置于5%CO2、37 ℃條件下孵育7 d，獲得貼壁的細胞即為PBMC Mφ。通過倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）觀察細胞形態(tài)。

圖 1 密度梯度離心法中液體分為3層Fig 1 Liquid was divided into three layers in density gradient centrifugation

1.3 單核細胞株的培養(yǎng)

人單核細胞系THP-1購自上海中喬新舟生物有限公司，并培養(yǎng)在含10% FBS和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中。THP-1為懸浮細胞，生長速度較快，細胞密度一般控制在每毫升0.8×106～1.0×106個，每2～3 d傳代1次。收集生長狀態(tài)良好的THP-1進行實驗，將細胞以每孔0.5×106個細胞的密度接種于6孔板，用含10% FBS和100 nmol·L-1PMA的RPMI 1640培養(yǎng)基孵育24 h分化成初始巨噬細胞（M0 Mφ）。隨后用新鮮培養(yǎng)基替換，靜置24 h，置于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.4 極化模型的建立

取兩種來源的靜息狀態(tài)下的Mφ，用LPS（50 ng·mL-1）和IFN-γ（20 ng·mL-1）進行刺激，使其向M1型極化；另外再取兩種Mφ，使用IL-4（20 ng·mL-1）進行刺激，使其向M2型極化；以未加任何刺激因子的細胞作為對照，所有細胞孵育24 h后進行檢測。

1.5 實時定量聚合酶鏈式反應檢測細胞因子mRNA的表達

采用實時定量聚合酶鏈式反應（quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測各組細胞因子mRNA的表達情況，包括表征M1型分化標志的IL-1β和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），以及表征M2型分化標志的甘露糖受體C1樣蛋白（mannose receptor C-type 1，MRC1）和IL-10。

收集上述6組細胞，冰磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2次，使用Trizol法提取細胞總RNA，并逆轉錄成cDNA。本研究所用的PCR引物序列見表1，均由上海生工生物工程股份有限公司合成。使用LightCycler 480 qRT-PCR儀進行擴增反應。擴增程序如下：95 ℃ 30 s預變性；95 ℃ 5 s變性，60 ℃ 30 s退火和延伸，共40個循環(huán)。反應結束后，檢查融解曲線以確定PCR產物的特異性。使用比較Ct值法（2-ΔΔCt）計算相對mRNA水平，管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的平均值作為參考對結果進行校正。

表 1 qRT-PCR檢測基因的引物序列Tab 1 Primer sequences of qRT-PCR analysis

1.6 流式細胞術

CD86、CD206是已被廣泛接受的Mφ極化標記[11]，本研究采用流式細胞術檢測CD86、CD206的表達。消化并收集兩種來源的細胞，分別經LPS+IFN-γ和IL-4刺激后形成M1、M2型極化細胞，密度為每毫升不少于106個，PBS洗滌2次后，根據(jù)操作說明，分別加入流式抗體CD86-PE、CD206-PE，以相應單克隆抗體作同型對照，4 ℃避光孵育30 min，洗滌3次后重懸于PBS中，用流式細胞儀檢測，使用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附實驗

收集經LPS+IFN-γ和IL-4刺激后形成的各組細胞培養(yǎng)上清液，使用酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（深圳達科為生物技術股份有限公司）嚴格按照操檢測各組細胞IL-6、TNF-α和IL-1β的表達情況。

1.8 統(tǒng)計學分析

每組至少進行3次獨立實驗，數(shù)據(jù)結果使用Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析并作圖，兩樣本比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 形態(tài)學觀察

圖 2 兩種來源Mφ的形態(tài)學變化 倒置顯微鏡Fig 2 Morphological changes of Mφ from two cells sources inverted microscope

倒置顯微鏡下觀察可見，兩種來源的細胞在靜息狀態(tài)下均黏附牢固，形態(tài)相似，呈圓形，散在分布（圖2A、B）。PBMC在rhM-CSF誘導下分化培養(yǎng)7 d后，細胞多數(shù)為橢圓形，呈“煎蛋狀”，少數(shù)呈長梭形（圖2C）。THP-1在PMA誘導24 h后分化成包含圓形和紡錘形細胞的異質細胞群，細胞體積增大，偽足伸展明顯（圖2D）。繼續(xù)向靜息狀態(tài)下的Mφ加入極化刺激因子后，細胞形態(tài)更為多樣（圖2E、F）。

2.2 qRT-PCR結果

使用qRT-PCR測定兩種來源Mφ極化標記基因的相對表達量，結果見圖3。

圖 3 兩種來源Mφ極化后細胞因子mRNA的相對表達量Fig 3 Relative expression level of cytokine mRNA after Mφ polarization from two resources of cells

與靜息狀態(tài)細胞相比，Mφ在接受LPS+IFN-γ刺激后，M1型相關標志基因（TNF-α、IL-1β）的表達水平顯著上調（P<0.05，圖3A、B）。THP-1 Mφ的IL-1β、TNF-α mRNA的相對表達量分別為8.72±1.58、10.39±1.58，高于PBMC Mφ的相對表達量（5.14±2.08、9.54±2.31），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Mφ在接受IL-4刺激后，M2型相關標志基因（MRC1和IL-10）的相對表達量也明顯高于對照組（P<0.05，圖3C、D）。THP-1 Mφ的MRC1和IL-10 mRNA的相對表達量分別為2.32±0.32和1.74±0.33，均低于PBMC Mφ的相對表達量（3.73±0.51和2.26±0.15）；其中MRC1 mRNA表達水平響應LPS+IFN-γ的極化反應較弱，但在IL-4刺激后出現(xiàn)高表達（P<0.05，圖3C）。上述結果說明，LPS+IFN-γ可以成功誘導兩種來源細胞的M1型極化反應，IL-4可以誘導M2型極化反應，THP-1對M1型極化的刺激更為敏感。

2.3 流式細胞術結果

流式細胞術檢測及量化結果顯示：THP-1 Mφ接受LPS+IFN-γ刺激后，M1型標記物CD86較靜息狀態(tài)下表達顯著升高，PBMC Mφ有相似的趨勢（P<0.05，圖4上）；PBMC Mφ接受IL-4的誘導后，M2型標記物CD206的表達明顯增強（P<0.05），但THP-1 Mφ中CD206的表達則沒有明顯差異（P>0.05，圖4下）。上述結果說明，LPS+IFN-γ可以誘導Mφ向M1方向極化，IL-4可以誘導Mφ向M2方向極化，CD206對THP-1的M2極化反應沒有特異性表達。

圖 4 Mφ極化標記物CD86和CD206的表達Fig 4 The expression of polarization markers CD86 and CD206 from Mφ

2.4 ELISA結果

細胞培養(yǎng)上清液的ELISA檢測結果見表2。兩種來源細胞經LPS+IFN-γ刺激后分泌的細胞因子水平存在差異：IL-1β、TNF-α在THP-1 Mφ中表達更強，高于PBMC Mφ（P<0.05）；相反，IL-6在PBMC Mφ中的表達較THP-1 Mφ更明顯（P<0.05）。兩種來源細胞經IL-4刺激后分泌的細胞因子水平的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表 2 兩種來源Mφ上清液中細胞因子的表達量Tab 2 The expression levels of cytokines in Mφ supernatant from two resources of cells pg·mL-1

3 討論

單核細胞在骨髓中產生，進入血液循環(huán)并外滲后分化為Mφ，后者在協(xié)調損傷反應中起著重要作用[12]。人白血病來源的單核細胞系THP-1克服了使用原代Mφ的限制，已在研究中廣泛使用[9]。THP-1衍生的Mφ與原代人Mφ有非常相似的表型和功能特征[13]，但不能簡單地假設兩者必然相等。因此，本研究比較了兩種細胞在靜息和活化狀態(tài)下的基因表達、表面標志物以及細胞因子分泌等特征。

本實驗結合筆者經驗和先前的研究[14]為THP-1和PBMC選擇了合適的培養(yǎng)和誘導方案。采集健康人新鮮循環(huán)外周血提取PBMC，使用免疫磁珠法捕獲CD14+單核細胞。CD14是細胞表面的糖蛋白，被認為是單核巨噬細胞系統(tǒng)特征性的表面標記物[15]。免疫磁珠是一種細胞分選技術，可以將培養(yǎng)物進一步分化成高純度的巨噬細胞，為后續(xù)實驗奠定基礎[16]。PMA是從THP-1獲得與PBMC Mφ相似巨噬細胞的最有效的激活劑[17]。根據(jù)文獻[14]報道，PMA誘導THP-1分化的最佳方案是：細胞在100 nmol·L-1的PMA誘導下孵育24 h，然后在沒有PMA的培養(yǎng)液中靜置至少24 h，以減少分化期間上調的核因子-κB表達。通過上述方法獲得的兩組細胞緊緊黏附在培養(yǎng)板內，不易被0.25%的胰酶消化，符合Mφ貼壁牢固的特點。通過倒置顯微鏡觀察到，初始狀態(tài)的兩種Mφ形態(tài)相似，均為散在分布。不同極化條件下的Mφ由不同形狀的細胞異質群組成。紡錘形或偽足伸展明顯的Mφ被認為具有促炎性質，而圓形或觸角圓鈍的Mφ被認為具有抗炎特性。

本研究結果顯示：在接受LPS+IFN-γ刺激時，表征M1型標志的IL-1β、TNF-α mRNA相對表達量顯著增加，而接受IL-4刺激時IL-1β、TNF-α mRNA的相對表達量無明顯變化，兩種Mφ的極化反應相似；表征M2型標志的MRC1、IL-10 mRNA相對表達量在接受IL-4刺激時表達增強，且THP-1 Mφ的相對表達量較PBMC Mφ要低。兩種Mφ的表面標志物在極化過程中也存在明顯差異：表征M1型標志的表面分子CD86在兩種Mφ接受M1極化因子刺激后同時增強；而表征M2型標志的CD206，接受M2極化因子刺激后僅在PBMC Mφ極化反應時變化明顯。上述結果說明，M1型標志物的表達在兩種Mφ極化反應之間是相似的，但是部分M2型標志物僅在PBMC Mφ的極化反應中有表達。分析兩種Mφ培養(yǎng)上清液可以發(fā)現(xiàn)，在M1極化因子的刺激下，兩種來源Mφ分泌的細胞因子水平明顯提高，并且IL-1β、TNF-α在THP-1 Mφ中表達更強，而IL-6在PBMC Mφ中表達更強。

由本研究結果可以看出，THP-1 Mφ確實與PBMC Mφ有相似的極化表達，但THP-1 Mφ對M2表型的極化能力有限，并不能完全替代原代細胞。THP-1可能更適合進行M1極化的研究，而PBMC更適合進行M2極化的研究。當在Mφ極化模型中使用THP-1和PBMC時，需要考慮這些差異。造成這種差異的原因可能與THP-1和PBMC的生物學差異有關，例如基因表達程度和細胞因子分泌程度的差異等[18]。與THP-1相比，PBMC與組織來源的巨噬細胞可以在肥胖、慢性炎癥疾病等不同的疾病中處于不同極化狀態(tài)，能夠產生不同的表型，從而發(fā)揮不同的促炎和抗炎作用[19]。

綜上所述，人類的健康與免疫功能密切相關，而免疫功能受多種因素影響。體外細胞系的應用能夠最大限度地減少培養(yǎng)期和遺傳變異的影響、倫理問題的限制，以及供者的可獲得性，在研究方面具有一定意義；但在研究中應注意，體內細胞是以交互作用的網(wǎng)絡形式而存在，而體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中缺乏這種交互作用，因此應明確不同細胞在不同狀態(tài)下的功能及表達，以進一步模擬體內情況。