姚懷兵，李 玲，馬 強(qiáng)，阿爾曼·海熱，苗 靜，陳鋼糧，唐 釗，楊 潔*

(1.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；3.新疆旺源生物科技集團(tuán)有限公司，新疆 阿勒泰 836500)

泌乳是哺乳動(dòng)物重要經(jīng)濟(jì)性狀之一，尤其在奶牛(奶水牛)、奶山羊等乳用家畜上最能直接體現(xiàn)其對畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的影響，選育產(chǎn)奶性能高的優(yōu)勢群體在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中具有重要意義。

目前，高產(chǎn)動(dòng)物選育及產(chǎn)奶性狀改良的分子育種技術(shù)主要有兩種策略[1]，一種是選擇功能候選基因策略，即篩選與動(dòng)物產(chǎn)奶性狀密切相關(guān)的候選基因，另一種則是全基因組選擇策略。隨著高通量測序技術(shù)(Next Generation Sequencing，NGS)和單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)芯片的發(fā)展，許多不曾被關(guān)注的基因功能也越來越多地被挖掘出來。

動(dòng)物產(chǎn)奶性狀主要包括產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳脂量和乳蛋白量五方面。產(chǎn)奶是由主效基因-微效多種基因共同調(diào)控的數(shù)量性狀，并受到飼養(yǎng)條件及外界環(huán)境等因素的影響[2]。利用分子標(biāo)記輔助選育高產(chǎn)性狀動(dòng)物(Marker Assisted Selection，MAS)技術(shù)，是對動(dòng)物產(chǎn)奶性狀基因或與之連鎖的遺傳標(biāo)記的選擇，實(shí)現(xiàn)對控制性狀的數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative Trait Locus，QTL)的選擇，針對動(dòng)物產(chǎn)奶性狀有明顯效應(yīng)的基因，揭示泌乳相關(guān)基因調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而應(yīng)用于動(dòng)物泌乳性狀的改良及高產(chǎn)動(dòng)物選育工作中[3]。

二?；视王；D(zhuǎn)移酶(Diacylglycerol Acyltransferase，DGAT)是控制哺乳動(dòng)物甘油三酯合成的關(guān)鍵微粒體酶[4-5]，主要作用機(jī)制是使甘油二酯(Diacylglycerol，DAG)與脂肪酸?；磻?yīng)生成甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)，主要包括二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶1(Diacylglycerol Acyltransferase 1，DGAT1)和二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶2(Diacylglycerol Acyltransferase 2，DGAT2)兩個(gè)亞型。諸多研究者通過對哺乳動(dòng)物DGAT基因的研究，表明其與動(dòng)物脂肪沉積、產(chǎn)奶性能、泌乳質(zhì)量等生產(chǎn)性狀緊密相關(guān)。本文主要對哺乳動(dòng)物DGAT1、DGAT2基因的克隆與定位、功能、生物學(xué)效應(yīng)及其家畜的遺傳多態(tài)性與產(chǎn)奶性狀之間的關(guān)系進(jìn)行論述，旨在為哺乳動(dòng)物泌乳相關(guān)的分子標(biāo)記篩選及生產(chǎn)實(shí)踐提供參考和理論依據(jù)。

1 DGAT基因的克隆與定位

1.1 DGAT1基因的克隆與定位

DGAT1屬于膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(Acyl Coenzyme A-cholesterol acyl Transferase，ACAT)家族，是催化TAG合成的關(guān)鍵酶，其編碼基因也是編碼活性蛋白質(zhì)的基因，參與脂肪合成、儲存及脂蛋白組裝等過程[6]，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)重要的一種酶。

Cases等[7]研究者于1998年在小鼠上克隆得到DGAT1基因cDNA并證明了DGAT1的活性。Lardizabal等[8]用染料親和及肝素層析法從真菌脂質(zhì)體中分離出DGAT1。Winter等[9]和Bernard等[10]將DGAT1作為評定奶牛乳脂率和乳脂產(chǎn)量的候選基因，利用熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)的方法在牛14號染色體的端粒區(qū)段定位到DGAT1基因，并檢測出一個(gè)關(guān)于乳脂率的QTL。Grisart等[5]定位克隆發(fā)現(xiàn)DGAT1基因位于構(gòu)建的BAC序列群的一個(gè)SUBSET上；牛DGAT1的mRNA序列包括245 bp的5'非翻譯區(qū)(5'-Untranslated region，5'-UTR)、1 470 bp的編碼序列(Coding sequence，CDS)和275 bp的3'非翻譯區(qū)(3'-Untranslated region，3'-UTR)構(gòu)成，由500多個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為50～60 ku，與微衛(wèi)星CSSM66緊密連鎖；豬DGAT1基因與微衛(wèi)星SW2404緊密連鎖；肖海霞等[11]以驢乳腺組織的RNA為模板，首次克隆得到驢DGAT1基因3'末端cDNA序列，其他物種尚未見報(bào)道(詳見表1)。

表1 不同物種DGAT1基因信息Table 1 Summary of DGAT1 gene information of different species

1.2 DGAT2基因的克隆與定位

DGAT2屬于單?；视王；D(zhuǎn)移酶1(Monoacylglycerol Acyltransferases，MGAT1)基因超家族，研究表明，如果它在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)，則會導(dǎo)致大量三酰甘油在細(xì)胞溶質(zhì)微滴中積聚。該酶參與動(dòng)物肌肉能量的代謝，是一種比DGAT1更為有效的酶[20-22]。

Lardizabal等[8]和Irshad等[17]從真菌脂質(zhì)體提取DGAT2酶。小鼠DGAT2酶內(nèi)具有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，3個(gè)N2糖基化位點(diǎn)和6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)。Stone等[24]認(rèn)為大鼠DGAT2是一個(gè)完整的膜蛋白，其疏水區(qū)域長約66～115個(gè)氨基酸，可能存在兩個(gè)跨膜區(qū)域或一個(gè)鑲?cè)肽るp分子層的單結(jié)構(gòu)域，并且大多數(shù)蛋白質(zhì)位于跨膜區(qū)末端。人DGAT2基因家族中含有完全保守的HPHG序列，該序列與第一跨膜區(qū)的中性脂帶區(qū)是DGAT2酶發(fā)生作用和功能的基礎(chǔ)。高濃度的MgCl2對體外培養(yǎng)的細(xì)胞中DGAT2的活性具有抑制效應(yīng)。DGAT2與DGAT1在哺乳動(dòng)物組織中都可廣泛表達(dá)，然而在基因定位、蛋白結(jié)構(gòu)、所屬家族、組織表達(dá)敏感性、對MgCl2敏感性等方面存在差異，可進(jìn)行鑒別。

人DGAT2基因分子量約為40～45 kDa，cDNA為2 439 bp，5'-UTR為230 bp，3'-UTR為1 042 bp；小鼠DGAT2基因cDNA為2 263 bp，5'-UTR為177 bp，3'-UTR為976 bp；大鼠DGAT2基因cDNA為2 320 bp，5'-UTR為177 bp，3'-UTR為976 bp；牛DGAT2基因5'-UTR為198 bp，3'-UTR為933 bp，位于BTA14著絲粒末端，而BTA14末端存在影響產(chǎn)奶性狀的主效基因[14]；其他物種DGAT2基因定位未見報(bào)道(詳見表2)。

2 DGAT基因功能相關(guān)研究

對家畜泌乳性狀改良是當(dāng)今遺傳育種研究者的研究熱點(diǎn)之一，利用挖掘候選基因策略尋找影響泌乳性狀的主效基因，揭示其對產(chǎn)乳性狀調(diào)控的分子機(jī)制，從而應(yīng)用于家畜泌乳性狀的改良。從基因水平上尋找與動(dòng)物產(chǎn)乳性狀等重要經(jīng)濟(jì)性狀密切相關(guān)的主效基因及遺傳標(biāo)記，應(yīng)用于高產(chǎn)奶家畜分子標(biāo)記的輔助選擇，實(shí)現(xiàn)早期良種選擇，加快育種速度。近些年，研究者發(fā)現(xiàn)多種基因?qū)θ橄侔l(fā)育和泌乳有調(diào)控作用，其中主要包括乳蛋白基因、搖擺基因、催乳素基因、糖皮質(zhì)激素[18]、生長激素及生長激素受體基因、淀粉酶基因、核外基因和其他基因如DGAT基因及垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子等[29-30]。

表2 不同物種DGAT2基因信息Table 2 Summary of DGAT2 gene information of different species

2.1 DGAT基因在脂類代謝中的作用

在泌乳過程中，乳脂的合成受遺傳、營養(yǎng)及環(huán)境等因素影響。乳脂主要由約98%的甘油三酯、少量的甘油二酯和甘油一酯、游離脂肪酸及維生素A組成。合成途徑分為脂肪酸的合成、甘油三酯的生成及脂滴的形成三個(gè)過程。其中，脂肪酸及甘油三酯合成過程中有諸多基因編碼的酶類參與調(diào)控并發(fā)揮關(guān)鍵作用。反芻動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞中乳脂的合成過程如圖1所示。

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，DGAT1酶在腸、脂肪和乳腺等組織中均有表達(dá)，不同年齡、不同物種各組織表達(dá)量存在顯著差異；參與動(dòng)物機(jī)體多個(gè)重要的生理過程，能以甘油二酯(DAG)和乙酰輔酶A為底物進(jìn)行催化反應(yīng)合成甘油三酯(TAG)如圖2所示，當(dāng)DGAT1基因沉默后，乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)的TAG含量顯著降低，TAG在各種生理層面都有著重要的作用，參與腸道脂肪吸收過程，脂蛋白組裝，血漿中TAG濃度的調(diào)節(jié)和TAG在腸絨毛上皮細(xì)胞中的儲存，能調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞及動(dòng)物哺乳期脂肪的儲存。

DGAT2酶在肝臟[32]、腎臟[33]、白色脂肪等脂質(zhì)代謝旺盛組織中[34]的表達(dá)水平最高。它是脂肪合成的關(guān)鍵限制酶，在脂質(zhì)代謝中也發(fā)揮著重要作用。已有研究表明，與脂肪吸收，合成和沉積相關(guān)酶的基因可認(rèn)為是研究動(dòng)物部分生產(chǎn)性狀數(shù)量性狀基因座的候選基因，其多態(tài)性可能與動(dòng)物乳脂率以及體脂等特征性狀密切相關(guān)[15]。

綜上所述，動(dòng)物體內(nèi)DGAT酶催化產(chǎn)生的TAG是真核生物中性脂類的主要儲存形式，其活性直接影響TAG在生物體中的儲存。DGAT1和DGAT2能以相互補(bǔ)償?shù)男问皆谛∈蟾渭?xì)胞中合成TAG，然而這兩種酶的相互機(jī)制尚不明確[9]。TAG對于細(xì)胞膜形式、脂蛋白的運(yùn)輸具有重要作用，且能在動(dòng)物營養(yǎng)缺乏和外界刺激應(yīng)激時(shí)為機(jī)體提供能量；若TAG在體內(nèi)過量可引起動(dòng)物糖尿病、肥胖等疾病[14]。

2.2 DGAT基因與泌乳關(guān)系的研究

DGAT基因是哺乳動(dòng)物泌乳性狀重要的候選基因，且DGAT1不能替代DGAT2在組織中的生理功能。敲除DGAT2基因的小鼠出生后不久死亡[9]，而敲除DGAT1基因的小鼠仍能正常存活，腸道內(nèi)雖能繼續(xù)合成TAG，但不在組織中沉積，也不能正常泌乳[35-36]，結(jié)果表明：敲除DGAT1基因會造成乳腺中TAG合成受損，影響乳腺的生理功能。小鼠在DGAT1沉默后缺少乳汁而不能喂養(yǎng)后代，這種缺陷與乳腺的上皮細(xì)胞發(fā)育受阻是相互關(guān)聯(lián)的，但乳腺受損的關(guān)聯(lián)機(jī)制尚不明確，間質(zhì)組織中缺失DGAT1只是個(gè)體表現(xiàn)，群體水平有待驗(yàn)證。

乳脂率是評價(jià)動(dòng)物產(chǎn)奶性能的主要指標(biāo)之一，與乳制品的質(zhì)量和風(fēng)味密切相關(guān)。已有研究表明普通奶牛[37]DGAT基因與牛奶乳脂率密切相關(guān)；中國南方荷斯坦奶牛DGAT1基因與乳脂率有關(guān)；水牛[38-39]、西農(nóng)薩能奶山羊[40-42]的DGAT1基因與奶中乳脂率及產(chǎn)奶量具有一定關(guān)聯(lián)性；綿羊的DGAT2基因與其產(chǎn)奶量和乳脂率有關(guān)[43-44]；牦牛DGAT1基因與乳質(zhì)有關(guān)[49]；三河牛DGAT1基因與其產(chǎn)奶性能相關(guān)[45]；驢DGAT2基因與其產(chǎn)奶量有關(guān)[46]。研究者曾一度認(rèn)為DGAT1基因與奶牛乳脂率及脂肪沉積密切相關(guān)，且主要集中在第8外顯子AA→CG的雙堿基突變導(dǎo)致的K232A氨基酸變異，K氨基酸殘基對增加乳脂率、乳蛋白率及乳脂量有促進(jìn)作用，而對產(chǎn)乳量產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)[14]；此外，啟動(dòng)子區(qū)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性對產(chǎn)乳性狀也有一定影響。隨著對乳腺生物學(xué)和泌乳功能調(diào)控機(jī)制深入的研究，研究者發(fā)現(xiàn)DGAT2基因多態(tài)性與奶牛產(chǎn)奶性能也顯著相關(guān)。國外研究者表明與脂肪吸收、合成和沉積有關(guān)酶的基因均可作為是奶牛部分性狀數(shù)量性狀位點(diǎn)的候選基因，這些基因單核苷酸多態(tài)性與乳脂率、產(chǎn)奶量等性狀也相互關(guān)聯(lián)[18]。因此，DGAT1和DGAT2基因都可視為奶牛(水牛)、奶山羊等哺乳動(dòng)物產(chǎn)奶性狀的重要候選基因。

3 DGAT基因遺傳多態(tài)性及與家畜泌乳性狀相關(guān)性的研究

3.1 DGAT1基因遺傳多態(tài)性與家畜泌乳性狀

關(guān)于DGAT1基因多態(tài)性與產(chǎn)奶性狀間存在關(guān)聯(lián)性已有大量研究報(bào)道，并在多國高產(chǎn)品種家畜群體得到驗(yàn)證。Griasrt等[5]提出用Q和q兩個(gè)等位基因代表奶牛DGAT1上的賴氨酸和丙氨酸殘基，隨后Komisarek等[48]發(fā)現(xiàn)新西蘭奶牛的Q等位基因能增加牛奶中脂肪的產(chǎn)量而降低蛋白的產(chǎn)量及總量，驗(yàn)證了這對等位基因在育種方面的重要地位。賈晉等[49]通過對奶牛DGAT1基因外顯子8的AA/GC突變導(dǎo)致CfrI限制性酶切位點(diǎn)出現(xiàn)的研究，針對突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一對特異性引物，建立了一種準(zhǔn)確判定奶牛DGAT1基因型的PCR-RFLP方法，并進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明DGAT1基因?qū)χ袊伤固鼓膛．a(chǎn)奶性狀具有重要影響，可作為中國荷斯坦奶牛305 d產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量性狀輔助選擇的遺傳標(biāo)記。Schennink等[50]研究表明,DGAT1基因8外顯子上的第232位氨基酸的改變，即賴氨酸突變?yōu)楸彼岬陌被嵝蛄?p.Lys232Ala或K232A)能夠影響牛奶乳脂組成和脂肪含量。Laridizabal等[8]發(fā)現(xiàn)DGAT1基因K232A多態(tài)性對牛產(chǎn)乳性狀如牛奶產(chǎn)量、蛋白質(zhì)含量、脂肪含量和脂肪酸組成具有重要影響，表明該基因多態(tài)性與產(chǎn)奶性狀密切相關(guān)。婁佑武等[51]在研究吉安西雜母牛DGAT1基因第8外顯子K232A突變的遺傳多態(tài)性及其對乳成分的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，KA基因型個(gè)體比AA/KK基因型個(gè)體在乳成分性狀上有一定的優(yōu)勢，可作為候選基因與QTL作連鎖分析，用于數(shù)量性狀的輔助標(biāo)記選擇。高小莉等[45]評估甘南牦牛DGAT1基因15內(nèi)含子至17外顯子區(qū)突變對乳品質(zhì)性狀產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明該區(qū)上A等位基因的牦牛乳蛋白率、乳脂率、總固體物質(zhì)含量及無脂固體含量顯著較高。Dokso等[52]在熱環(huán)境下K232A位點(diǎn)對牛產(chǎn)奶性狀的影響，表明DGAT1的K232A對產(chǎn)奶某些性狀的影響不是恒定的，與外界環(huán)境冷熱相關(guān)，基因和環(huán)境共同作用影響奶牛產(chǎn)奶性狀。Sourabh等[53]對摩拉水牛DGAT1基因進(jìn)行研究，表明該基因g.A7013G與乳脂量顯著相關(guān)，在擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證后，可作為潛在的分子標(biāo)記。朱春梅等[40]以DGAT1基因作為西農(nóng)薩能奶山羊產(chǎn)奶性狀的候選基因，分析該基因多態(tài)性及其與產(chǎn)奶性狀的關(guān)系，表明DGAT1基因內(nèi)含子15位點(diǎn)及其5'調(diào)控區(qū)的突變對奶山羊的產(chǎn)奶量和乳脂率顯著影響。

3.2 DGAT2基因遺傳多態(tài)性與家畜泌乳性狀

關(guān)于DGAT2基因多態(tài)性及其與家畜產(chǎn)奶性能的關(guān)聯(lián)性研究相繼報(bào)道。徐秀容等[54]對三河牛DGAT2基因5、6和7內(nèi)含子的部分位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子6MspI酶切多態(tài)性與牛平均乳脂率有極顯著的相關(guān)性。劉新武等[55]發(fā)現(xiàn)中國荷斯坦奶牛DGAT2基因5內(nèi)含子上存在AA、BB、AB和AC四種基因型，5內(nèi)含子位點(diǎn)的變異對奶牛產(chǎn)奶量和乳脂率均有顯著的影響。郭將等[56]利用PCR-RFLP方法檢測草原紅牛DGAT2基因的遺傳多態(tài)性與泌乳性狀關(guān)系，DGAT2是影響草原紅牛乳中脂肪和干物質(zhì)含量的一個(gè)主效基因，能夠作為選育低脂及高干物質(zhì)草原紅牛的分子標(biāo)記。鄢勝飛等[57]檢測水牛DGAT2基因的單核苷酸多態(tài)性，探究摩拉水牛多態(tài)性位點(diǎn)的群體遺傳特征，篩選出9個(gè)高度多態(tài)的SNPs位點(diǎn)，研究表明摩拉水牛群體中DGAT2基因遺傳多態(tài)性豐富，具有較大的育種價(jià)值和性狀改良潛力。朱春梅等[58]探究DGAT2基因與奶山羊產(chǎn)奶性狀之間的關(guān)系，表明該基因?qū)δ躺窖虍a(chǎn)奶性能具有顯著影響。謝建鵬等[59]結(jié)合牦牛產(chǎn)乳性能，檢測DGAT2基因5內(nèi)含子和6內(nèi)含子區(qū)域突變并分析其遺傳特征，表明6內(nèi)含子突變能夠影響乳品質(zhì)性狀，選育等位基因A的個(gè)體能夠改善后代群體的乳品質(zhì)。

綜上所述，DGAT與脂肪的代謝以及脂類物質(zhì)的沉積密切相關(guān)，在腸脂肪吸收、脂蛋白集合、血漿中TAG濃度的調(diào)節(jié)、脂細(xì)胞中脂肪的存儲、肌肉中能量的代謝等生理方面發(fā)揮著重要作用，可作為研究哺乳動(dòng)物部分生產(chǎn)性狀QTL的候選基因，其單核苷酸多態(tài)性與動(dòng)物的乳脂率，產(chǎn)奶量等泌乳性狀直接相關(guān)。因此，DGAT基因可作為奶牛產(chǎn)奶性狀選育的重要候選基因。

4 DGAT基因研究前景及展望

DGAT酶是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)一種重要的酶，在維持動(dòng)物正常生理活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。它是控制高TAG引起代謝異常綜合征等病的潛在基因標(biāo)靶。作為合成TAG的關(guān)鍵限制酶，它與脂肪代謝、組織中脂類沉積有緊密聯(lián)系，可被視為研究動(dòng)物部分性狀QTL的候選基因。DGAT基因遺傳多態(tài)性與產(chǎn)奶性狀(尤其是乳脂量和乳脂率)以及與豬、牛等畜禽的肉質(zhì)性狀、屠宰性狀、體脂性狀等密切相關(guān)，可應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇。關(guān)于動(dòng)物DGAT基因的研究仍在不斷深入，表明該基因與脂肪沉積、產(chǎn)奶性能及泌乳質(zhì)量等性狀具有密切的關(guān)聯(lián)性。國內(nèi)外研究者對奶牛(奶水牛)、奶山羊的DGAT1(K232A、5'調(diào)控區(qū)、5內(nèi)含子至7外顯子、8內(nèi)含子、15內(nèi)含子至17外顯子等區(qū)域)，DGAT2(5至7內(nèi)含子等區(qū)域)研究較多，DGAT被認(rèn)為是動(dòng)物泌乳性能重要的主效候選基因之一。在新西蘭，DGAT1基因已應(yīng)用到奶牛的育種工作中。同時(shí)，該基因在結(jié)構(gòu)或調(diào)控序列中的等位變異極為重要。在開展分子育種技術(shù)的相關(guān)研究時(shí)，應(yīng)首先明確主效基因與相關(guān)產(chǎn)奶性狀的連鎖關(guān)系。

近年來，人們對駱駝乳、驢乳等特種乳營養(yǎng)價(jià)值和保健功能的認(rèn)知度越來越高，特種乳及其乳制品受到越來越多消費(fèi)者的青睞，促進(jìn)了特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。駱駝、驢等動(dòng)物養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大，但仍面臨泌乳產(chǎn)量低、高品系良種篩選困難等亟待解決的問題。目前在驢、雙峰駝等特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物泌乳性狀相關(guān)基因的研究較少，DGAT作為動(dòng)物重要經(jīng)濟(jì)性狀最具前景的候選基因之一，對DGAT基因的研究將有助于闡明哺乳動(dòng)物產(chǎn)奶性狀相關(guān)的分子機(jī)制及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，將該功能基因的研究實(shí)施到駱駝、驢等特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物良種篩選及育種計(jì)劃中具有重要價(jià)值和前景。