梁趙良 呂曉丹 劉耿峰 王慧琴 盧 飛 谷光麗 李世權(quán) 金 卉 謝彥飛 陳 蘭 覃立鋒 詹靈凌 呂小平

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南寧市 530021，電子郵箱：744982276@qq.com)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)主要表現(xiàn)為直腸和結(jié)腸黏膜慢性炎癥，呈連續(xù)性分布，發(fā)病機制可能是遺傳易感個體腸道菌群失衡導(dǎo)致黏膜免疫系統(tǒng)的異常激活[1]。糞菌移植是一種新型的微生物治療方法，其對復(fù)發(fā)的梭狀芽胞桿菌感染有明顯療效[2]，但對UC的療效尚不明確。使用2-4-6三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-benzenesulfonic acid,TNBS)建立小鼠炎癥性腸病模型是應(yīng)用較為廣泛的一種實驗方法[3]。本實驗采用TNBS建立UC小鼠模型，探討糞菌移植對UC小鼠腸黏膜炎癥的改善作用，以及對脾臟中濾泡輔助性T細胞(follicular helper T cell,Tfr)及濾泡調(diào)節(jié)性T細胞(follicular regulatory T cell,Tfh)水平的影響，為糞菌移植治療UC提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雌性C57BL/6小鼠45只，9～12周齡，體質(zhì)量40～45g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心(生產(chǎn)許可證 SCXK桂2014-0002；使用許可證 SYXK桂2014-0003)。小鼠飼養(yǎng)在無特定病原體級別飼養(yǎng)間，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，室內(nèi)溫度20℃～22℃，濕度50%，明暗交替12 h/周期，所有操作的試劑及器械均經(jīng)過紫外燈照射消毒。

1.2 主要試劑及儀器 TNBS 購自Sigma公司；淋巴細胞分離液購自北京索萊寶公司；流式細胞術(shù)熒光標記抗體均購自美國BD公司，包括異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyante,FITC)標記小鼠抗CD4抗體(批號：ab183685)、PerCP-CyTN5.5 標記大鼠抗小鼠CXCR5抗體(批號：ab551959)、別藻藍蛋白(allophycocyanin,APC)標記倉鼠抗小鼠PD-1抗體(批號：NBP1-77277)、藻紅蛋白(phycoerythrin,PE) 標記大鼠抗小鼠Foxp3抗體及對應(yīng)的同型對照抗體(批號：ab54501、ab210233、ab133706、ab18473、ab553930)。冷凍離心機購自德國Eppendorf公司；流式細胞儀購自美國BD公司；石蠟切片機及病理圖像分析儀購自日本Olympus公司。

1.3 動物分組及建立UC模型 將45只小鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、干預(yù)組各15只。對照組予一次性結(jié)腸灌注0.9%氯化鈉溶液0.4 mL，模型組及干預(yù)組參照相關(guān)文獻[4-5]制備UC小鼠模型。建模主要步驟：適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，小鼠于造模前禁食24 h，給予4%水合氯醛按40 mg/kg腹腔注射麻醉后，由肛門插入直徑2 mm聚乙烯灌腸管至腸道內(nèi)約6 cm，一次性結(jié)腸灌注100 mg/kg TNBS灌腸液(溶于50%乙醇溶液)0.4 mL，提起小鼠尾部倒立3 min，麻醉蘇醒放回籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 糞菌移植干預(yù) 參照糞菌移植標準[6]，造模后第2天開始對干預(yù)組進行糞菌移植：(1)收集對照組小鼠新鮮糞便到無菌試管中并稱重，加入無菌0.9%氯化鈉溶液震蕩混勻制成400 mg/mL濃度的糞菌液。(2)腹腔注射4%水合氯醛0.3 mL麻醉后，將小鼠倒懸位，將灌腸管經(jīng)肛門插入至腸道內(nèi)約6 cm，注入新鮮糞菌液(mL)=[小鼠體質(zhì)量(mg)×1/500]÷400(mg/mL)，20 g小鼠則注入0.1 mL新鮮糞菌液，灌腸后將小鼠倒立懸掛1 min，1次/d，共7次。模型組及對照組小鼠給予等體積無菌0.9%氯化鈉溶液灌腸，1次/d，共7次。

1.5 小鼠一般情況的觀察 采用UC疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)[7]對造模過程中各組小鼠每天的一般情況進行評價，DAI=(體重下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+血便程度分數(shù))/3。DAI評分方法見表1。

表1 DAI評分標準

注：*正常指成形大便；松散指不黏附于肛門的糊狀、半成形大便；稀爛便指可黏附于肛門的稀爛水樣便。

1.6 標本收集 干預(yù)后第8天，頸椎脫臼法處死小鼠，取出脾臟及結(jié)腸，用無菌冰0.9%氯化鈉溶液反復(fù)沖洗干凈。脾臟組織剪去附著脂肪，放入磷酸緩沖鹽溶液中備用。結(jié)腸縱行切開，模型組和干預(yù)組小鼠以出現(xiàn)潰瘍部位為中心用清潔的眼科剪剪取直徑約1 cm結(jié)腸組織數(shù)塊，對照組小鼠參照模型組潰瘍腸段對應(yīng)部位剪取，置入4%多聚甲醛溶液固定。

1.7 小鼠結(jié)腸組織病理變化觀察 (1) 取小鼠結(jié)腸標本，評估小鼠結(jié)腸黏膜大體形態(tài)損傷指數(shù)(colon mucosal damage index，CMDI)，評分標準見表2。(2)取結(jié)腸組織制成石蠟切片，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE) 染色，在光學顯微鏡下觀察腸黏膜組織損傷情況，參照Schmidt等[8]的評分標準評價組織損傷情況，見表3。

表2 CMDI評價標準

表3 小鼠結(jié)腸黏膜組織損傷評分標準

1.8 小鼠脾臟CD4+CXCR5+PD-1+Tfh和CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr的檢測 取小鼠新鮮脾臟組織，剪去附著的脂肪，置于200目細胞篩中，加入少量磷酸緩沖鹽溶液，在組織表面剪若干創(chuàng)口，擠壓過篩，用2 mL磷酸緩沖鹽溶液沖洗細胞篩收集細胞懸液，1 200 r/min離心5 min后，磷酸緩沖鹽溶液清洗重懸細胞懸液。每個樣本分別設(shè)置陰性對照管和樣本管，標記后樣本管中加入150 μL細胞懸液和FITC-CD4抗體、PerCP-CyTN5.5-CXCR5抗體、APC-PD-1抗體(或PE-Foxp3抗體)，陰性組加入50 μL細胞懸液及對應(yīng)的同型對照抗體。懸液和抗體混勻，避光孵育15min。1 200 r/min離心5 min，清洗，2℃～8℃下避光孵育45 min，最后重懸液采用流式細胞儀檢測CD4+CXCR5+PD-1+Tfh、CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr在CD4+T細胞中的比例。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠一般情況比較 對照組小鼠實驗期間反應(yīng)靈敏，飲食活動正常，毛發(fā)有光澤，無便血。模型組于造模次日出現(xiàn)懶動、拱背、厭食、體質(zhì)量下降、糞便隱血陽性，進食和飲水量減少；隨著時間推移，模型組小鼠癥狀逐漸加重，造模第2～7天出現(xiàn)不同程度的肉眼血便。與模型組相比，干預(yù)組小鼠自糞便移植的第2天起癥狀有所好轉(zhuǎn)。3組小鼠實驗終點的DAI差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中對照組、干預(yù)組、模型組的DAI依次升高(均P<0.05)，見表4。

2.2 3組小鼠結(jié)腸組織病理變化 (1)各組小鼠結(jié)腸組織大體形態(tài)學觀察：對照組小鼠腸黏膜光滑，皺襞紋理清晰，腸壁厚薄均勻，腸黏膜無糜爛及潰瘍形成；與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸縮短、腸壁增厚、腸管明顯擴張，與腹腔內(nèi)周圍組織粘連嚴重，糜爛、炎性滲出、多灶性淺潰瘍形成；干預(yù)組小鼠腸壁增厚、腸管增粗改善，黏膜糜爛、潰瘍較模型組明顯減輕。(2)各組小鼠結(jié)腸組織病理組織學觀察：對照組小鼠結(jié)腸黏膜層單層柱狀上皮細胞排列整齊完整，腸腺清晰，可見大量吸收細胞與杯狀細胞，形態(tài)正常，無炎性細胞浸潤，肌層薄厚均勻無異常改變；模型組小鼠結(jié)腸炎癥主要累及黏膜和黏膜下層，少數(shù)可達漿膜層，結(jié)腸黏膜不完整,可見多灶性淺潰瘍，大部分腺體被破壞，腺體正常結(jié)構(gòu)喪失，排列紊亂，腺腔大多消失，可見大量淋巴細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤；干預(yù)組小鼠結(jié)腸黏膜炎癥程度介于正常對照組和模型組之間。(3)3組的CMDI評分和組織學損傷評分差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中對照組、干預(yù)組、模型組的CMDI評分及組織學損傷評分均依次升高(均P<0.05)。見表4及圖1、圖2。

表4 3組小鼠DAI、CMDI評分及組織損傷評分比較(x±s，分)

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

圖1 3組小鼠結(jié)腸組織大體形態(tài)學觀察結(jié)果

圖2 3組小鼠結(jié)腸黏膜的鏡下病理組織學觀察結(jié)果(HE染色，×400)

2.3 3組小鼠脾臟組織Tfh和Tfr水平比較 與對照組比較，模型組Tfh及Tfr水平、Tfh/Tfr比值均升高，干預(yù)組Tfh及Tfr水平升高，而Tfh/Tfr比值降低(均P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組Tfr水平升高，而Tfh水平及Tfh/Tfr比值降低(均P<0.05)。見表5。

表5 3組小鼠脾臟Tfh和Tfr水平比較(x±s)

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

3 討 論

研究表明，UC在世界各地的發(fā)病率和患病率呈逐漸升高的趨勢，已成為全球性的疾病[9]。UC的傳統(tǒng)藥物治療方法包括氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑等，且需要長期聯(lián)合用藥，并根據(jù)疾病類型、病變部位、嚴重程度、并發(fā)癥發(fā)生情況、藥物相互作用和不良反應(yīng)、患者的經(jīng)濟條件等因素綜合制定合理、個性化的治療方案[10]。目前，傳統(tǒng)藥物出現(xiàn)對部分UC患者不應(yīng)答、失效的問題，因此迫切需要新的治療方案。

近年來，糞便移植治療炎癥性腸病的相關(guān)研究報道越來越多。糞菌移植是通過將健康腸道糞便有效地移植入患者消化道來治療疾病。Bennet等[11]于1989年首次報告1例使用糞便移植成功治愈的嚴重UC患者。Cui等[12]對16例激素依賴型UC患者進行糞便移植治療，發(fā)現(xiàn)臨床癥狀改善率為57.1%，臨床緩解率為28.6%。2017年的一項非對照研究表明，在30例糞便移植治療UC患者中，有13例(43.3%)在第12周獲臨床及內(nèi)鏡緩解；在12周隨訪期間，大多數(shù)患者未出現(xiàn)不良事件；在隨訪終點，9名患者(30%)為無應(yīng)答者，7例患者(23.3%)出現(xiàn)輕度不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等[13]。以上研究均表明糞便移植可作為治療UC的方法之一。本研究結(jié)果顯示，建模后，模型組及干預(yù)組小鼠均出現(xiàn)血便等UC癥狀，結(jié)腸黏膜出現(xiàn)炎癥性腸炎的病理改變，且DAI、CDMI、組織學損傷評分均高于對照組(均P<0.05)；而干預(yù)組小鼠經(jīng)糞菌移植后癥狀減輕，以上評分均低于模型組(均P<0.05)，這提示糞菌移植可減輕UC小鼠的腸道黏膜炎癥，緩解病情。

Tfh和Tfr是CD4+T淋巴細胞新的亞型，主要在淋巴濾泡生發(fā)中心分化產(chǎn)生，對平衡機體免疫起重要作用[14]。研究表明，自身免疫性疾病(炎癥性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力等)的發(fā)病風險增加與Tfh/Tfr的比例失衡紊亂有關(guān)[15]。我們的前期研究結(jié)果顯示，TNBS誘導(dǎo)的UC小鼠Tfh水平及Tfh/Tfr比例升高，兩者可能參與UC的發(fā)病過程[16]。Tfh是一類幫助B細胞發(fā)育的T細胞，能提高其抗原親和力，在維持長期體液免疫應(yīng)答等方面有關(guān)鍵性的作用[17]。Tfr從調(diào)節(jié)性T細胞分化而來，和Tfh一樣表達趨化受體CXCR5，能趨化定位到生發(fā)中心調(diào)節(jié)Tfh的數(shù)量，抑制B細胞的分化成熟及抗體生成[18]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠脾臟組織CD4+CXCR5+PD-1+Tfh、CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr的水平均較對照組升高(P<0.05)，且以Tfh升高顯著，因此Tfh/Tfr比值升高(P<0.05)。由此可見，模型組小鼠在TNBS誘導(dǎo)下發(fā)生抗原抗體免疫反應(yīng)，Tfh及Tfr均被刺激分化生成，以Tfh升高為主，進一步促進免疫應(yīng)答。而接受糞菌移植的干預(yù)組小鼠脾臟組織細胞CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr水平較模型組上升，Tfh水平及Tfh/Tfr比值較模型組有所下降(P<0.05)，即接受糞菌移植的小鼠Tfh下調(diào)，Tfr升高，由此進一步證實Tfh細胞具有促炎因子作用，而Tfr是UC的保護因子。

Paramsothy等[19]納入81例UC患者進行隨機雙盲對照試驗，發(fā)現(xiàn)在41例糞便移植患者中32例(78%)患者發(fā)生不良事件，而在40例使用安慰劑患者中則有33例(83%)發(fā)生不良事件，但兩組之間的不良事件數(shù)量和類型差異無統(tǒng)計學意義。該研究同時進行了糞便標本16S rRNA分析，發(fā)現(xiàn)接受糞便菌群移植的患者微生物多樣性隨糞便菌群移植量增加而增加，并持續(xù)存在；一些細菌性分類群與臨床結(jié)果相關(guān)，特別是梭桿菌的存在與臨床缺乏緩解有關(guān)。此研究啟示我們可以通過分析糞便評估腸道相關(guān)微生物群的變化，精確定義糞菌移植最佳治療強度和基于微生物譜的供體-受體匹配的作用制定個性化的治療方案。

綜上所述，糞菌移植可減輕UC小鼠腸道黏膜炎癥，其可能的機制為降低促炎癥因子Tfh的表達，并促進保護因子Tfr的表達，改善Tfh/Tfr比例，從而抑制炎癥進展。