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        基于適配體技術(shù)對(duì)止咳平喘健康產(chǎn)品中非法添加的沙丁胺醇進(jìn)行可視化快速檢測(cè)

        2020-05-08 13:40:46董嘉媚劉亞雄樊洪利羅卓雅
        分析測(cè)試學(xué)報(bào) 2020年3期
        關(guān)鍵詞:二氧化硅實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

        董嘉媚,劉亞雄,樊洪利,羅卓雅*

        (1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院,廣東 廣州 510006;2.廣東省藥品檢驗(yàn)所 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局 藥品快速檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510663)

        健康產(chǎn)品包括藥品、食品、保健食品、化妝品,是人們最基礎(chǔ)的日常生活用品[1]。沙丁胺醇(Salbutamol,SAL)是一種常用平喘藥,屬于β2受體激動(dòng)劑[2]。研究表明,長(zhǎng)期服用沙丁胺醇會(huì)對(duì)人的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生危害[3-4]。一些不法商家為了謀取利益,向聲稱(chēng)具有止咳平喘效果的中成藥以及保健品等健康產(chǎn)品中非法添加沙丁胺醇,嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者利益。

        目前沙丁胺醇的常見(jiàn)檢測(cè)方法包括色譜法和光譜法[5-8],如原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的食藥監(jiān)食監(jiān)三[2016]28號(hào)文[9]《食品藥品監(jiān)管總局關(guān)于印發(fā)保健食品中非法添加沙丁胺醇檢驗(yàn)方法等8項(xiàng)檢驗(yàn)方法的通知》就采用了高效液相色譜法。但這些方法大多依賴(lài)貴重儀器、操作繁瑣、需要專(zhuān)業(yè)人員且無(wú)法進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)。沙丁胺醇的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)手段包括免疫法[10-13]和電化學(xué)法[14-17],但免疫檢測(cè)中的抗體存在制備困難、價(jià)格昂貴、批間差異大等缺點(diǎn)[18-19];而電化學(xué)法也沒(méi)有真正實(shí)現(xiàn)不借助儀器的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

        核酸適配體(簡(jiǎn)稱(chēng)適配體,Aptamer)是一種短的單鏈核苷酸(DNA或RNA),對(duì)目標(biāo)物具有高親和力和特異性[20-21]。近年來(lái),適配體以其體外合成、易于修飾以及穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[21-25]受到越來(lái)越多的關(guān)注。

        本實(shí)驗(yàn)使用二氧化硅微球固定ssDNA結(jié)合蛋白(ssDNA binding protein,SSB)和辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP),并利用二氧化硅微球的大比表面積實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。其檢測(cè)機(jī)理為,沙丁胺醇與SSB競(jìng)爭(zhēng)與適配體結(jié)合,由于沙丁胺醇與適配體的親和性更高,使得SSB與適配體組成的“開(kāi)關(guān)”被沙丁胺醇打開(kāi),磁分離后,游離的二氧化硅微球@SSB@HRP復(fù)合物與其作用底物發(fā)生顯色反應(yīng)產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的結(jié)果。該傳感器制備方法簡(jiǎn)單、靈敏快速、抗干擾性強(qiáng),檢測(cè)過(guò)程僅需45 min,無(wú)需任何儀器,實(shí)現(xiàn)了真實(shí)樣品中非法添加沙丁胺醇的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器與試劑

        磁力攪拌器(德國(guó)IKA公司);Nano-60超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(德國(guó)Implen公司);離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)。

        羧基化磁性微球(Magnetic beads,MB,直徑3 μm,10 mg/mL)購(gòu)自上海英芮誠(chéng)生化科技有限公司;羧基化二氧化硅微球(SiO2,直徑50 nm,50 mg/mL)購(gòu)自北京中科雷鳴科技有限公司;ssDNA結(jié)合蛋白購(gòu)自哈爾濱新?;驒z測(cè)有限公司;乙醇胺和嗎啉乙磺酸(MES)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司;辣根過(guò)氧化物酶、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB)、三羥甲基胺基甲烷(Tris)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和沙丁胺醇核酸適配體均購(gòu)于上海生工生物科技股份有限公司;氨基修飾的沙丁胺醇適配體序列:5’-NH2-AGCAGCACAGAGGTCAGATGTTGTAAAACTTAATCAGCGATTCTCTATGTCTGCAATTACCCTATGC GTGCTACCGTGAA-3’[26];實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

        1.2 緩沖液配制

        偶聯(lián)緩沖液(0.02 mol/L MES,pH 5.0);適配體結(jié)合緩沖液(BB,50 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L KCl,100 mmol/L NaCl,1 mmol/L MgCl2,pH 7.4);TMB緩沖液(0.1 mol/L Na3C6H5O7,0.2 mol/L Na2HPO4,pH 5.2);顯色液(30% H2O2、1 mg/mL TMB乙醇溶液與TMB緩沖液以體積比1∶100∶900混合,現(xiàn)配現(xiàn)用)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 磁性探針(MB-aptamer)的制備取0.1 mg MB分散于400 μL偶聯(lián)緩沖液中,向其中加入偶聯(lián)劑EDC-NHS(4∶1)至其最終質(zhì)量濃度為10 mg/mL,室溫活化30 min,以偶聯(lián)緩沖液洗滌3次,除去多余偶聯(lián)劑;取5 μL 濃度為100 μmol/L的沙丁胺醇適配體,95 ℃水浴5 min,立即置入冰浴中延展10 min,隨后加入到活化的MB中,室溫下振蕩孵育1 h,得到磁性探針MB-aptamer;磁性分離,以偶聯(lián)緩沖液洗滌3次,用400 μL含有1%乙醇胺的偶聯(lián)緩沖液將MB-aptamer重新分散,室溫下振蕩孵育1 h封閉MB上殘余羧基;磁性分離,BB洗滌3次,得到的磁性探針MB-aptamer懸于200 μL BB中備用。

        1.3.2 二氧化硅微球-蛋白復(fù)合物(SiO2@SSB@HRP)的制備取5 mg羧基二氧化硅微球分散于900 μL偶聯(lián)緩沖液中,加入偶聯(lián)劑EDC-NHS(4∶1)至其最終質(zhì)量濃度為10 mg/mL,室溫下活化30 min;5 000 r/min離心5 min,沉淀洗滌3次后重懸于400 μL偶聯(lián)緩沖液中;加入10 μL 10 μg/μL HRP和5 μL 2 μg/μL SSB,室溫振蕩孵育1 h;加入400 μL含有2%乙醇胺的偶聯(lián)緩沖液,室溫下振蕩孵育1 h封閉二氧化硅微球上殘余羧基;5 000 r/min離心5 min,去離子水洗滌3次,所得復(fù)合物標(biāo)記為SiO2@SSB@HRP,懸于200 μL BB中備用。

        1.3.3 磁性探針與二氧化硅微球-蛋白復(fù)合物的連接(MB-aptamer~SiO2@SSB@HRP)將上述得到的MB-aptamer與SiO2@SSB@HRP混合,37 ℃振蕩孵育2 h;磁性分離吸棄上清液,BB洗滌3次,復(fù)懸后再于室溫振蕩孵育1 h,磁性分離吸棄上清液,BB洗滌3次,將結(jié)合不牢固的SiO2@SSB@HRP去除;最終得到的產(chǎn)物標(biāo)記為MB-aptamer~SiO2@SSB@HRP,分散于300 μL BB中作為檢測(cè)液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.4 沙丁胺醇的檢測(cè)取“1.3.3”制備的檢測(cè)液6份,每份50 μL,分別加入沙丁胺醇對(duì)照品和BB,使其最終體積均為100 μL,沙丁胺醇濃度分別為0、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L,室溫下捕獲反應(yīng)30 min;將6份待測(cè)液分別磁性分離,小心吸取上清液70 μL于新的1.5 mL EP管中;加入100 μL TMB-H2O2顯色液,觀(guān)察顏色變化,判定結(jié)果。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 實(shí)驗(yàn)原理

        如圖1所示,氨基修飾的沙丁胺醇適配體與羧基修飾的磁性微球偶聯(lián)構(gòu)成磁性探針MB-aptamer,二氧化硅微球負(fù)載HRP與SSB得到SiO2@SSB@HRP復(fù)合物,通過(guò)SSB與單鏈DNA(適配體本質(zhì)是單鏈DNA)的結(jié)合作用將磁性探針MB-aptamer與SiO2@SSB@HRP連接形成檢測(cè)復(fù)合物MB-aptamer~SiO2@SSB@HRP。當(dāng)待測(cè)液中存在適配體的靶標(biāo),即目標(biāo)物沙丁胺醇時(shí),由于SSB與適配體的親和作用(Kd=1.1 μmol/L)[27]小于適配體與沙丁胺醇的親和作用(Kd=53.60 nmol/L)[26],因此沙丁胺醇將與適配體特異性結(jié)合,同時(shí)適配體與SSB的結(jié)合作用被破壞,即沙丁胺醇作為“鑰匙”,將適配體與SSB組成的“開(kāi)關(guān)”打開(kāi)。最終,檢測(cè)復(fù)合物MB-aptamer~SiO2@SSB@HRP產(chǎn)生MB-aptamer~SAL與SiO2@SSB@HRP兩部分產(chǎn)物,經(jīng)過(guò)磁性分離,MB-aptamer~SAL位于EP管底部,而上清液中的SiO2@SSB@HRP復(fù)合物被吸取并與HRP的底物TMB進(jìn)行反應(yīng),產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的藍(lán)色現(xiàn)象,從而可進(jìn)行結(jié)果判定。

        圖1 基于適配體傳感器檢測(cè)沙丁胺醇原理Fig.1 Detection of SAL by the developed aptamer sensor

        圖2 SiO2@SSB@HRP復(fù)合物表征圖Fig.2 UV-Vis spectra of HRP(a),SSB(b) and SiO2@SSB@HRP(c)

        2.2 SiO2@SSB@HRP表征

        應(yīng)用紫外-可見(jiàn)分光光度法對(duì)SiO2@SSB@HRP復(fù)合物進(jìn)行表征。如圖2所示,SSB和HRP分別在270 nm和403 nm處有吸收峰(曲線(xiàn)a,b),而SiO2@SSB@HRP復(fù)合物在波長(zhǎng)270 nm和403 nm附近出現(xiàn)吸收峰(曲線(xiàn)c),證明SSB、HRP負(fù)載成功,即SiO2@SSB@HRP復(fù)合物制備成功。

        2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

        2.3.1 磁性微球與沙丁胺醇適配體比例優(yōu)化取0.1 mg磁性微球,分別與不同體積(1、2、5、8、10 μL)的適配體(濃度為100 μmol/L)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)體系吸光度隨著適配體體積的增加先升高后降低,當(dāng)適配體體積為5 μL時(shí)獲得最大吸光度。因此選用0.1 mg磁性微球與5 μL適配體(100 μmol/L)制備MB-aptamer。

        2.3.2 SSB與HRP比例優(yōu)化取5 mg二氧化硅微球,分別與SSB和HRP不同質(zhì)量比的混合物(10∶1、1∶1、1∶10、1∶25、1∶50)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明SSB和HRP比例為1∶10時(shí)可獲得最大吸光度,因此選用SSB和HRP的質(zhì)量比為1∶10。

        2.3.3 二氧化硅微球與SSB及HRP的結(jié)合比例優(yōu)化取5 mg二氧化硅微球,分別與不同質(zhì)量的SSB與HRP混合物(2、5、10、20、25 μg SSB分別對(duì)應(yīng)與20、50、100、200、250 μg HRP混合)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明HRP取100 μg、SSB取10 μg時(shí)可獲得最大吸光度。因此選用5 mg二氧化硅微球與100 μg HRP、10 μg SSB制備SiO2@SSB@HRP。

        2.3.4 MB-aptamer與SiO2@SSB@HRP結(jié)合比例優(yōu)化取“2.3.1”優(yōu)化方案制備得到的200 μL MB-aptamer分別與“2.3.3”優(yōu)化方案制備得到的不同體積(50、100、200、300、400 μL)的SiO2@SSB@HRP進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,吸光度隨著SiO2@SSB@HRP體積的增加先增加后趨于平緩,當(dāng)SiO2@SSB@HRP的體積為200 μL時(shí)獲得最大吸光度,因此選用200 μL MB-aptamer與200 μL SiO2@SSB@HRP進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        2.3.5 顯色反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化為確定結(jié)果判定的最佳時(shí)間,對(duì)一系列反應(yīng)時(shí)間的吸光度進(jìn)行測(cè)定。發(fā)現(xiàn)當(dāng)顯色反應(yīng)時(shí)間為15 min時(shí),吸光度達(dá)到最大值,因此選擇15 min作為顯色反應(yīng)時(shí)間。

        2.4 沙丁胺醇加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

        對(duì)一系列濃度梯度沙丁胺醇進(jìn)行檢測(cè),顯色反應(yīng)產(chǎn)物用超微量紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)定量檢測(cè)。結(jié)果顯示,顯色反應(yīng)產(chǎn)物的顏色隨沙丁胺醇濃度增加逐漸加深,當(dāng)濃度達(dá)到10 μmol/L時(shí),顯色反應(yīng)產(chǎn)物的顏色由藍(lán)色變?yōu)榫G色。沙丁胺醇濃度在0.1~10 μmol/L(23.9~2.39×103μg/L)范圍內(nèi)與體系吸光度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系(r2=0.995 9)。通過(guò)一系列濃度梯度的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)確定檢出限為0.1 μmol/L(23.9 μg/L)。與已報(bào)道的沙丁胺醇檢測(cè)方法以及原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局關(guān)于保健食品中非法添加沙丁胺醇檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)相比(表1),本文所構(gòu)建的適配體傳感器具有較低的檢出限,滿(mǎn)足對(duì)止咳平喘健康產(chǎn)品中非法添加沙丁胺醇的檢測(cè)需求。此外,本方法操作簡(jiǎn)單,可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

        表1 不同分析方法檢測(cè)沙丁胺醇的比較Table 1 Comparison of methods for SAL detection

        2.5 特異性實(shí)驗(yàn)

        圖3 傳感器的特異性實(shí)驗(yàn)Fig.3 Specificity against CLB and RAP concentration of SAL,CLB and RAP is 10,1,1 mmol/L, respectively

        克倫特羅(Clenbuterol,CLB)、萊克多巴胺(Ractopamine,RAP)與沙丁胺醇的分子結(jié)構(gòu)相似,都屬于β受體激動(dòng)劑。因此用CLB和RAP考察傳感器的特異性。結(jié)果顯示,肉眼觀(guān)察濃度為1 mmol/L的CLB和RAP模擬樣品均未出現(xiàn)顯色反應(yīng)。紫外-可見(jiàn)分光光度法驗(yàn)證結(jié)果如圖3,二者檢測(cè)結(jié)果吸光度與空白相近,可忽略不計(jì),表明所研制傳感器特異性良好。

        2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

        制備5批次傳感器,同時(shí)測(cè)定10 μmol/L沙丁胺醇,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.6%;使用同一批傳感器,連續(xù)5 d測(cè)定10 μmol/L沙丁胺醇,RSD為 5.2%,說(shuō)明該傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

        表2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recoveries

        2.7 實(shí)際樣品中沙丁胺醇的檢測(cè)

        為驗(yàn)證所構(gòu)建傳感器檢測(cè)實(shí)際樣品的可行性,采用標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測(cè)止咳平喘中成藥中沙丁胺醇的回收率。取某品牌聲稱(chēng)具有平喘作用的中成藥,高效液相色譜法驗(yàn)證其為沙丁胺醇陰性。取此中成藥1片(0.5 g),研成粉末,去離子水充分溶解后離心,取上清液,制備低、中、高3個(gè)不同水平的沙丁胺醇(表2)加標(biāo)樣品,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示其回收率為86.0%~106%,RSD在15% 以?xún)?nèi),證明開(kāi)發(fā)的適配體傳感器對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)具有應(yīng)用前景。

        3 結(jié) 論

        本研究基于核酸適配體技術(shù),通過(guò)大比表面積的二氧化硅微球固定SSB與HRP,達(dá)到信號(hào)放大作用,利用SSB與適配體結(jié)合的特點(diǎn)構(gòu)建傳感器“開(kāi)關(guān)”,基于沙丁胺醇與SSB之間對(duì)適配體結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)作用,最終借助磁性分離獲得游離SiO2@SSB@HRP并催化TMB產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的顏色變化,建立了健康產(chǎn)品中非法添加沙丁胺醇的可視化檢測(cè)方法,檢出限為0.1 μmol/L。本方法具有快速、靈敏、肉眼可視、低成本且易操作的優(yōu)勢(shì),可用于實(shí)際樣品中沙丁胺醇的可視化快速檢測(cè)。此外,只需改變適配體序列即可構(gòu)建針對(duì)其它目標(biāo)物的檢測(cè)傳感器,進(jìn)一步擴(kuò)展此傳感器制備方法的應(yīng)用范圍。

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