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        固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定尿液中6種雙酚類及烷基酚類物質

        2020-05-09 01:05:38張卓娜林少彬胡小鍵楊艷偉
        分析測試學報 2020年3期
        關鍵詞:尿樣酚類內標

        張卓娜,朱 英,林少彬,胡小鍵,楊艷偉

        (中國疾病預防控制中心 環(huán)境與健康相關產(chǎn)品安全所,北京 100021)

        環(huán)境內分泌干擾物(EDCs)是能夠干擾生物體內分泌系統(tǒng)的外源性化學物質,大部分為人工合成,其中雙酚類、烷基酚類物質受到廣泛關注[1]。雙酚類物質(BPs)是一組具有2個羥苯基的化合物,因具有交聯(lián)特性而常用于制造聚碳酸酯塑料以及環(huán)氧樹脂等[2]。文獻調研表明,雙酚A(BPA)普遍存在于塑料材質的食物容器及飲料罐的環(huán)氧樹脂涂層中,目前已被多個國家限用,如歐盟、美國等禁止在嬰幼兒使用的食品包裝材料、容器和涂層中使用BPA[3-4],中國也于2011年5月30日禁止生產(chǎn)含BPA的嬰兒奶瓶。雙酚F(BPF)因與BPA有相似的結構及性能的可替代性,目前被廣泛應用于禁止或限制使用BPA的日常用品中[5-6]。四氯雙酚A(TCBPA)和四溴雙酚A(TBBPA)是BPA的鹵代衍生物,分別為重要的氯代阻燃劑和溴代阻燃劑,廣泛用于建材、涂料、電子產(chǎn)品等材料的阻燃。烷基酚類物質(APs)是一類非離子型表面活性劑,廣泛用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、家庭生活[7]。其中,4-正辛基苯酚(4-n-OP)、壬基酚(NP)的應用較為廣泛,主要用于生產(chǎn)烷基酚聚氧乙烯醚(APEOs)。

        研究發(fā)現(xiàn),上述化學物質不僅干擾人體內分泌功能,還具有生殖毒性及基因毒性,可導致肥胖、糖尿病、乳腺癌以及其他疾病[8-11]。這些成分在相關產(chǎn)品的生產(chǎn)、加工、使用和回收利用過程中可釋放到環(huán)境中,最終通過空氣、水、食物等途徑進入人體,產(chǎn)生健康危害[6]。對人體生物樣本(如尿液、血液)中雙酚類、烷基酚類物質的檢測,有助于了解該類有害物質的暴露水平,對完善法規(guī)、減少有毒有害污染物暴露途徑、保護人群健康具有重要意義。目前一些國家和地區(qū)開展的生物監(jiān)測項目(如美國國家生物監(jiān)測項目(NBP)、加拿大健康測量調查(CHMS)等)均對人群中BPA等物質進行了生物監(jiān)測,BPA的檢出率高于90%[12],監(jiān)測結果反映了一般人群中BPA的暴露水平,對其暴露評估具有重要作用。

        建立高效、靈敏、準確的分析方法評估人體有害物質的內暴露水平是生物監(jiān)測工作的重要環(huán)節(jié)。文獻調研表明,BPs及APs的半衰期小于6 h[13],大部分進入體內的BPA[5]、TBBPA[14]、4-n-OP、NP[15]等物質可通過葡萄糖苷酸化反應形成葡萄糖苷結合物,少量發(fā)生硫酸酯化反應形成硫酸酯結合物,在尿液中代謝及排出。BPs及APs在人體中濃度較低,且尿樣基質復雜,不同人群樣本的差異較大,需采用高靈敏度的分析方法進行定性定量測定。就前處理技術而言,固相萃取法和液液萃取法是尿液樣品常用的處理方法。因液液萃取法的有機溶劑用量較大,對環(huán)境不友好,故選擇固相萃取法處理樣品。就分析技術而言,氣相色譜-質譜法(GC-MS)和液相色譜-質譜法(LC-MS)是目前應用較為廣泛的分析方法,但由于BPs及APs均不易揮發(fā),采用GC-MS法分析需進行衍生[13,16],費時費力。高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)具有較高的靈敏度、選擇性和重復性,可用于復雜基質中目標物的準確定量[17-18]。本研究采用固相萃取富集,結合同位素稀釋技術,建立了人體尿液中6種雙酚類及烷基酚類化合物同時測定的方法。該方法具有靈敏度高、準確性好等優(yōu)點,可用于人群中環(huán)境內分泌干擾物質內暴露水平的監(jiān)測。

        1 實驗部分

        1.1 儀器與試劑

        API4000三重四極桿質譜儀(ESI源,美國Applied Biosystems公司),Acquity UPLC I-Class系統(tǒng)(美國Waters公司);24位固相萃取裝置(美國Supelco公司);HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL,美國Waters公司);氮吹儀(美國Organomation公司) ;離心機(美國Sigma公司);旋渦混勻器(Scientific Industrie);電子天平(瑞典Mettler Toledo公司)。

        β-葡萄糖苷酸酶/硫酸酯酶(美國Sigma公司,β-葡萄糖苷酸酶≥85 000 units/mL,硫酸酯酶≤7 500 units/mL);甲醇、乙腈(HPLC級,美國ThermoFisher公司);人工尿液(湖州英創(chuàng)生物科技有限公司);乙酸銨、乙酸(國藥集團化學試劑有限公司);BPF、BPA、TBBPA、4-n-OP、NP(德國Dr.Ehrenstorfer GmbH)、TCBPA、NP-13C6(美國AccuStandard公司)、BPF-D10(加拿大TRC公司)、BPA-D16(美國Supelco公司)、TBBPA-D10(Wellington Laboratories)、TCBPA-13C12(美國CIL公司)。吸煙人群尿中有機污染物的標準參考物質(NIST質控樣)購于美國標準化研究院(BPA,含量為3.05±0.16 μg/kg)。實驗用水為超純水,由Milli-Q水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備。

        1.2 溶液配制

        標準溶液:分別稱取BPF、BPA、TBBPA、TCBPA、4-n-OP、NP約0.1 g,用甲醇溶解并定容至10 mL,配成10 mg/mL的標準儲備液。分別移取各標準儲備液1 mL于10 mL容量瓶中,加甲醇定容,搖勻制成1 mg/mL的混合標準儲備液,置于冰箱4 ℃保存。臨用前,用乙腈-水(50∶50)將混合標準儲備液逐級稀釋成所需濃度的混合標準溶液。

        內標溶液:分別取BPF-D10、BPA-D16、TBBPA-D10、TCBPA-13C12、NP-13C6內標儲備液,配成各物質質量濃度分別為50、10、1、1、2 μg/mL的內標混合溶液,于4 ℃保存待用。

        0.1 mol/L乙酸銨緩沖液:取7.71 g乙酸銨加入94 mL水中,加入6 mL乙酸配成pH 5.0的緩沖溶液。

        1.3 儀器條件

        1.3.1 色譜條件色譜柱:Acquity UPLC HSS T3色譜柱( 2.1 mm×100 mm,1.8 μm);柱溫:室溫;進樣量:5 μL;流速:300 μL/min;流動相:水(A)-乙腈(B);梯度洗脫:0~4 min,50%A;4~10 min,50%~20%A;10~12 min,20%~50%A。

        1.3.2 質譜條件電噴霧離子源負電離(ESI-);多反應監(jiān)測(MRM)模式;碰撞氣壓力:3.4×104Pa;氣簾氣壓力:1.7×105Pa;霧化氣壓力:2.4×105Pa;加熱氣壓力:2.3×105Pa;噴霧電壓:4 500 V;去溶劑溫度:500 ℃;掃描時間:100 ms。6種待測物質及內標的離子對、碰撞能量(CE)和去簇電壓(DP)見表1。

        表1 6種物質及同位素內標的質譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 6 compounds and isotopes

        *quantitative ion

        1.4 樣品前處理

        1.4.1 樣品準備及酶解測定前將尿樣從-80 ℃冰箱中取出,置于4 ℃冰箱中,隔日取出放至室溫后,在旋渦混勻器上混勻1 min。取2 mL于5 mL聚丙烯管中,加入25 μL同位素內標混合液,振蕩;加入40 μL酶和2 mL乙酸銨緩沖液振蕩1 min。于37 ℃水浴條件下避光酶解12 h,取出放至室溫,以2 000 r/min離心10 min,取上清液待凈化。

        1.4.2 樣品凈化與濃縮依次用甲醇、水和乙酸銨緩沖液各3 mL活化HLB固相萃取柱,隨后轉移樣品至柱上,在自然重力下過柱,流速為0.5 mL/min。樣品流干后加入3 mL 25%乙腈-水淋洗(3.0 mL/min),抽真空吹干20 min,而后加入5 mL甲醇在自然重力下緩慢洗脫(0.5 mL/min),收集洗脫液于40 ℃ N2吹至近干,用0.5 mL乙腈-水(50∶50,體積比)溶解,過0.22 μm濾膜后待測。

        2 結果與討論

        2.1 質譜條件的選擇

        6種雙酚類及烷基酚類化合物的結構中均含有羥基基團,在ESI電離時易失去H形成[M-H]-的母離子,所以選擇ESI-作為離子化模式。配制50 μg/L的6種物質標準使用液,采用流動注射方式,以10 μL/min流速將樣品進入質譜,優(yōu)化CE、DP值,選擇豐度最高、干擾較少的2個子離子,在MRM模式下優(yōu)化碰撞氣壓力(CAD)、噴霧電壓(IS)、去溶劑溫度(TEM)、氣簾氣壓力(CUR)、霧化氣壓力(Gas1)、加熱氣壓力(Gas2)等參數(shù),使待測物的離子化效率最佳。優(yōu)化的質譜條件如“1.3.2”所示。

        圖1 6種化合物混合標準溶液(50 μg/L)的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the mix standard solution of six compounds(50 μg/L) 1:BPF;2:BPA;3:TCBPA;4:TBBPA;5:4-n-OP;6:NP

        2.2 色譜柱及流動相的選擇

        6種待測物為極性、弱極性化合物,實驗分別選擇兩種通用型反相色譜柱Agilent Extend-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)和Waters Acquity UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色譜柱進行分析,流動相分別選擇甲醇-水、乙腈-水按不同比例進行等度洗脫。結果表明,流動相中有機相的比例低時,6種物質均不出峰,有機相比例高時,部分物質的色譜峰重疊,因此采用梯度洗脫以使待測物得到有效分離。當甲醇作為有機相時,部分物質的色譜峰拖尾嚴重;乙腈作為有機相時,色譜峰拖尾現(xiàn)象得到明顯改善,最終選擇乙腈-水為流動相梯度洗脫。

        在相同流動相條件下,6種待測物在兩種色譜柱上均能達到基線分離。由于初始流動相的水相比例較大,T3柱在50%水相條件下性能更穩(wěn)定,且分析時間較短,因此實驗最終選用T3柱進行分離。在“1.3.1”色譜條件下,6種目標化合物混合標準溶液的總離子流色譜圖如圖1所示。

        2.3 前處理條件的優(yōu)化

        2.3.1 固相萃取柱的選擇分別考察了C18柱(Supelclean LC-18)、石墨化碳黑柱(Supelclean Envi-Carb)、親水親脂柱(Waters HLB柱、VARIAN柱)的萃取及回收效果。結果表明,選用C18柱及VARIAN柱進行固相萃取時,TBBPA的回收率較低,其余物質的回收率均在70%~120%之間;選用石墨化碳黑柱時,除BPA外其余物質均無回收,且洗脫液難以濃縮;選用HLB柱時,6種物質的回收率均能達到70%~120%,且萃取速度較快。因樣品酶解后的體積約為5 mL,實驗最終選用填料規(guī)格為60 mg/3 mL的HLB固相萃取柱。

        2.3.2 酶解處理的影響代謝研究表明,酚類化合物在尿液中主要以葡萄糖酸苷和硫酸酯結合物形式存在,游離形式含量少[13],因此需對尿液樣品進行酶解處理以獲得游離態(tài)的化合物。對部分尿液樣品初步調查時發(fā)現(xiàn)尿液中僅檢出BPA,因此采用含有BPA的NIST標準參考物質考察添加酶對BPA測定的影響。結果表明,不添加酶處理NIST標準參考物質時,測得BPA的質量濃度為0.16 μg/L,經(jīng)酶解處理后測得BPA的質量濃度為3.00 μg/L,與標準參考值相符。由于其他5種化合物具有與BPA相似的化學結構,BPA的測定結果具有代表性,因此確定尿液采用酶解處理。

        2.3.3 尿液沉淀的影響采集后的尿樣通常于低溫環(huán)境長期放置,測試前需解凍處理。一般尿樣解凍后為透明或淡黃色液體,但部分尿樣會出現(xiàn)渾濁、沉淀,這些沉淀物主要是結晶、細胞等。考察了酶解前過濾尿液與不過濾尿液對測定結果的影響。選取6份有明顯沉淀物的尿樣,將每份尿樣再分成2份,第1份為尿樣原液,第2份離心取上清液,沉淀中加入2 mL水作為第3份樣品,將3份樣品按本方法進行前處理后測定。結果表明,第1份與第2份樣品均檢出BPA,第3份樣品未檢出。將前2份樣品的BPA檢出值做t檢驗,其中t=2.22,查t界值表,得t0.05/2,5=2.571,P>0.05,結果無統(tǒng)計學差異,說明尿液是否過濾對測定無影響。基于尿液過濾也未提高過柱速度,所以尿液采取不過濾處理。

        2.3.4 淋洗溶劑及用量的選擇尿液基質較為復雜,固相萃取時若不淋洗會導致基體干擾,無法對目標物進行準確定量。分別選擇不同比例的甲醇-水和乙腈-水作為淋洗液進行實驗,結果表明采用甲醇-水淋洗時,分子量較小的BPF易洗脫,回收低,而采用乙腈-水淋洗時結果較好。進一步采用不同體積和比例的乙腈-水進行淋洗,發(fā)現(xiàn)3 mL 25%乙腈-水的效果最佳,因此選其為淋洗溶劑。

        2.3.5 濃縮方式的選擇雙酚類及烷基酚類物質在尿液中的濃度較低,因此對洗脫液進行濃縮以滿足實驗要求。選擇氮吹方式對5 mL甲醇洗脫液進行濃縮,比較氮吹近干及完全吹干對待測物的影響。結果表明,完全吹干會導致待測物損失,難以準確定量。因此,氮吹濃縮時接收管中應剩余約50 μL洗脫液,然后進行復溶。

        2.3.6 復溶溶劑及用量的選擇由于初始流動相為乙腈-水(50∶50),為減小溶劑效應,選用乙腈-水(50∶50)為復溶溶劑,并考察了復溶溶劑體積(0.5、1 mL)對定量的影響。結果表明,選用0.5 mL溶劑進行復溶時,能夠提高目標物的靈敏度,并且提高濃縮倍數(shù)不會引起樣品基質的干擾。因此,實驗選擇0.5 mL乙腈-水(50∶50)進行復溶。

        2.4 實驗空白的考察

        雙酚類及烷基酚類物質在環(huán)境和許多產(chǎn)品中廣泛存在,空白是該類物質測定過程中的關鍵和難點。空白在某種程度上較全面地反映了實驗環(huán)境的清潔程度、實驗用水和試劑的純度、耗材中雜質的影響、器皿的潔凈度、儀器設備的使用殘留及分析人員的水平和經(jīng)驗。此外,空白的大小及離散程度亦對檢出限、精密度、準確度等方法學指標及樣品測定產(chǎn)生較大影響。本實驗從分析儀器、水和試劑、耗材、實驗殘留等方面對空白進行測定,結果顯示,空白主要來自于耗材及實驗殘留,尤其是含橡膠成分的耗材空白值較高,因此應避免使用此類耗材,宜采用玻璃材質的耗材。此外,在每批實驗后,及時清洗儀器、設備、耗材、實驗環(huán)境等,可有效降低或消除雙酚類及烷基酚類物質的殘留。

        2.5 基質效應評價

        在分析過程中由于共洗脫物質會對分析物的離子化過程產(chǎn)生抑制或增強作用,從而影響定量分析方法的準確度和精密度,所以需對基質效應進行評價。根據(jù)基質效應(ME)=[(基質匹配校準曲線斜率/純溶劑標準曲線斜率)-1]×100%進行評估,若|ME|<20%為弱基質效應,無需采取補償措施;20%≤|ME|≤50%為中等程度基質效應,|ME|>50%為強基質效應,均須采取措施補償基質效應[19-21]。采用不含待測物的人工尿液基質,配制基質匹配標準工作溶液與溶劑標準溶液,分析測試后進行回歸及計算。由表2可知,6種待測物的|ME|值為2%~13%,為弱基質效應,故采用溶劑配制標準曲線進行定量測定。在分析中若采用標準曲線定量,會引起NIST質控樣定值偏高,主要因為在實驗過程中不可避免地存在來源于耗材、試劑、環(huán)境等的空白干擾。鑒于此,最終選用工作曲線進行定值,防止空白干擾影響準確定量。

        2.6 方法學考察

        2.6.1 線性關系、檢出限與定量下限配制0.5~50 μg/L質量濃度范圍的系列標準溶液,在上述色譜條件和質譜條件下進行測定。以待測物的定量離子峰面積與內標物定量離子峰面積之比為縱坐標,樣品中待測物的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。其中,BPF以BPF-D10為內標,BPA以BPA-D16為內標,TCBPA以TCBPA-13C12為內標,TBBPA以TBBPA-D10為內標,4-n-OP和NP以NP-13C6為內標定量計算。采用空白樣品中添加目標物的方法,以3倍信噪比(S/N)對應的質量濃度確定檢出限(LOD),10倍信噪比(S/N)對應的質量濃度確定定量下限(LOQ)。由表2可知,6種目標化合物在0.5~50 μg/L范圍內線性關系良好,相關系數(shù)r2>0.995,LOD為0.05~0.60 μg/L,LOQ為0.17~2.00 μg/L。

        表2 6種待測物的保留時間、線性關系、檢出限、定量下限及基質效應Table 2 Retention times,linear relations,LODs,LOQs and matrix effects of 6 compounds

        2.6.2 回收率及相對標準偏差取人工尿樣分為3組,每組6個樣品,向樣品中加入6種待測物混合標準溶液,配制成低、中、高3種濃度水平(2、10、50 μg/L)的加標樣品,采用本方法進行測定,并計算回收率及相對標準偏差。結果表明,6種待測物的加標回收率為81.4%~112%,相對標準偏差(RSD)為6.8%~30%。在同一天及連續(xù)3 d對處理后的樣品進行測定(n=6),計算得到6種物質的日內RSD為4.2%~11%,日間RSD為4.4%~9.7%(表3)。

        表3 6種待測物的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of 6 compounds(n=6)

        2.7 樣品測定

        采用本方法對采集的160份志愿者尿樣進行測定,結果顯示,BPA的檢出率為93.8%,檢出范圍為0.24~29.54 μg/L,幾何平均值為1.88 μg/L,四分位距IQR為2.52 μg/L,其余目標物均未檢出。

        3 結 論

        本研究建立了人體尿液中6種雙酚類及烷基酚類化合物的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定方法,并對前處理條件進行了優(yōu)化。美國國家生物監(jiān)測項目采用在線固相萃取/液相色譜-質譜聯(lián)用法測定BPA,節(jié)省人力,但分析時間較長,對前處理設備要求較高。而本方法的前處理設備普及性較好,分析時間短,BPA的靈敏度高(其檢出限與美國CDC方法相近),且其他方法指標良好,可用于人群中雙酚類及烷基酚類物質內暴露含量的檢測,為我國開展人群生物監(jiān)測項目奠定了良好基礎。

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