張卓娜，朱 英，林少彬，胡小鍵，楊艷偉

(中國疾病預防控制中心 環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京 100021)

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs)是能夠干擾生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)的外源性化學物質(zhì)，大部分為人工合成，其中雙酚類、烷基酚類物質(zhì)受到廣泛關(guān)注[1]。雙酚類物質(zhì)(BPs)是一組具有2個羥苯基的化合物，因具有交聯(lián)特性而常用于制造聚碳酸酯塑料以及環(huán)氧樹脂等[2]。文獻調(diào)研表明，雙酚A(BPA)普遍存在于塑料材質(zhì)的食物容器及飲料罐的環(huán)氧樹脂涂層中，目前已被多個國家限用，如歐盟、美國等禁止在嬰幼兒使用的食品包裝材料、容器和涂層中使用BPA[3-4]，中國也于2011年5月30日禁止生產(chǎn)含BPA的嬰兒奶瓶。雙酚F(BPF)因與BPA有相似的結(jié)構(gòu)及性能的可替代性，目前被廣泛應(yīng)用于禁止或限制使用BPA的日常用品中[5-6]。四氯雙酚A(TCBPA)和四溴雙酚A(TBBPA)是BPA的鹵代衍生物，分別為重要的氯代阻燃劑和溴代阻燃劑，廣泛用于建材、涂料、電子產(chǎn)品等材料的阻燃。烷基酚類物質(zhì)(APs)是一類非離子型表面活性劑，廣泛用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、家庭生活[7]。其中，4-正辛基苯酚(4-n-OP)、壬基酚(NP)的應(yīng)用較為廣泛，主要用于生產(chǎn)烷基酚聚氧乙烯醚(APEOs)。

研究發(fā)現(xiàn)，上述化學物質(zhì)不僅干擾人體內(nèi)分泌功能，還具有生殖毒性及基因毒性，可導致肥胖、糖尿病、乳腺癌以及其他疾病[8-11]。這些成分在相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)、加工、使用和回收利用過程中可釋放到環(huán)境中，最終通過空氣、水、食物等途徑進入人體，產(chǎn)生健康危害[6]。對人體生物樣本(如尿液、血液)中雙酚類、烷基酚類物質(zhì)的檢測，有助于了解該類有害物質(zhì)的暴露水平，對完善法規(guī)、減少有毒有害污染物暴露途徑、保護人群健康具有重要意義。目前一些國家和地區(qū)開展的生物監(jiān)測項目(如美國國家生物監(jiān)測項目(NBP)、加拿大健康測量調(diào)查(CHMS)等)均對人群中BPA等物質(zhì)進行了生物監(jiān)測，BPA的檢出率高于90%[12]，監(jiān)測結(jié)果反映了一般人群中BPA的暴露水平，對其暴露評估具有重要作用。

建立高效、靈敏、準確的分析方法評估人體有害物質(zhì)的內(nèi)暴露水平是生物監(jiān)測工作的重要環(huán)節(jié)。文獻調(diào)研表明，BPs及APs的半衰期小于6 h[13]，大部分進入體內(nèi)的BPA[5]、TBBPA[14]、4-n-OP、NP[15]等物質(zhì)可通過葡萄糖苷酸化反應(yīng)形成葡萄糖苷結(jié)合物，少量發(fā)生硫酸酯化反應(yīng)形成硫酸酯結(jié)合物，在尿液中代謝及排出。BPs及APs在人體中濃度較低，且尿樣基質(zhì)復雜，不同人群樣本的差異較大，需采用高靈敏度的分析方法進行定性定量測定。就前處理技術(shù)而言，固相萃取法和液液萃取法是尿液樣品常用的處理方法。因液液萃取法的有機溶劑用量較大，對環(huán)境不友好，故選擇固相萃取法處理樣品。就分析技術(shù)而言，氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)是目前應(yīng)用較為廣泛的分析方法，但由于BPs及APs均不易揮發(fā)，采用GC-MS法分析需進行衍生[13,16]，費時費力。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)具有較高的靈敏度、選擇性和重復性，可用于復雜基質(zhì)中目標物的準確定量[17-18]。本研究采用固相萃取富集，結(jié)合同位素稀釋技術(shù)，建立了人體尿液中6種雙酚類及烷基酚類化合物同時測定的方法。該方法具有靈敏度高、準確性好等優(yōu)點，可用于人群中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)內(nèi)暴露水平的監(jiān)測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

API4000三重四極桿質(zhì)譜儀(ESI源，美國Applied Biosystems公司)，Acquity UPLC I-Class系統(tǒng)(美國Waters公司)；24位固相萃取裝置(美國Supelco公司);HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL，美國Waters公司)；氮吹儀(美國Organomation公司) ；離心機(美國Sigma公司)；旋渦混勻器(Scientific Industrie)；電子天平(瑞典Mettler Toledo公司)。

β-葡萄糖苷酸酶/硫酸酯酶(美國Sigma公司，β-葡萄糖苷酸酶≥85 000 units/mL，硫酸酯酶≤7 500 units/mL)；甲醇、乙腈(HPLC級，美國ThermoFisher公司)；人工尿液(湖州英創(chuàng)生物科技有限公司)；乙酸銨、乙酸(國藥集團化學試劑有限公司)；BPF、BPA、TBBPA、4-n-OP、NP(德國Dr.Ehrenstorfer GmbH)、TCBPA、NP-13C6(美國AccuStandard公司)、BPF-D10(加拿大TRC公司)、BPA-D16(美國Supelco公司)、TBBPA-D10(Wellington Laboratories)、TCBPA-13C12(美國CIL公司)。吸煙人群尿中有機污染物的標準參考物質(zhì)(NIST質(zhì)控樣)購于美國標準化研究院(BPA，含量為3.05±0.16 μg/kg)。實驗用水為超純水，由Milli-Q水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備。

1.2 溶液配制

標準溶液：分別稱取BPF、BPA、TBBPA、TCBPA、4-n-OP、NP約0.1 g，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成10 mg/mL的標準儲備液。分別移取各標準儲備液1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻制成1 mg/mL的混合標準儲備液，置于冰箱4 ℃保存。臨用前，用乙腈-水(50∶50)將混合標準儲備液逐級稀釋成所需濃度的混合標準溶液。

內(nèi)標溶液：分別取BPF-D10、BPA-D16、TBBPA-D10、TCBPA-13C12、NP-13C6內(nèi)標儲備液，配成各物質(zhì)質(zhì)量濃度分別為50、10、1、1、2 μg/mL的內(nèi)標混合溶液，于4 ℃保存待用。

0.1 mol/L乙酸銨緩沖液：取7.71 g乙酸銨加入94 mL水中，加入6 mL乙酸配成pH 5.0的緩沖溶液。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：Acquity UPLC HSS T3色譜柱( 2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫：室溫；進樣量：5 μL；流速：300 μL/min；流動相：水(A)-乙腈(B)；梯度洗脫：0～4 min，50%A；4～10 min，50%～20%A；10～12 min，20%～50%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源負電離(ESI-)；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；碰撞氣壓力：3.4×104Pa；氣簾氣壓力：1.7×105Pa；霧化氣壓力：2.4×105Pa；加熱氣壓力：2.3×105Pa；噴霧電壓：4 500 V；去溶劑溫度：500 ℃；掃描時間：100 ms。6種待測物質(zhì)及內(nèi)標的離子對、碰撞能量(CE)和去簇電壓(DP)見表1。

表1 6種物質(zhì)及同位素內(nèi)標的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 6 compounds and isotopes

*quantitative ion

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品準備及酶解測定前將尿樣從-80 ℃冰箱中取出，置于4 ℃冰箱中，隔日取出放至室溫后，在旋渦混勻器上混勻1 min。取2 mL于5 mL聚丙烯管中，加入25 μL同位素內(nèi)標混合液，振蕩；加入40 μL酶和2 mL乙酸銨緩沖液振蕩1 min。于37 ℃水浴條件下避光酶解12 h，取出放至室溫，以2 000 r/min離心10 min,取上清液待凈化。

1.4.2 樣品凈化與濃縮依次用甲醇、水和乙酸銨緩沖液各3 mL活化HLB固相萃取柱，隨后轉(zhuǎn)移樣品至柱上，在自然重力下過柱，流速為0.5 mL/min。樣品流干后加入3 mL 25%乙腈-水淋洗(3.0 mL/min)，抽真空吹干20 min，而后加入5 mL甲醇在自然重力下緩慢洗脫(0.5 mL/min)，收集洗脫液于40 ℃ N2吹至近干，用0.5 mL乙腈-水(50∶50，體積比)溶解，過0.22 μm濾膜后待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

6種雙酚類及烷基酚類化合物的結(jié)構(gòu)中均含有羥基基團，在ESI電離時易失去H形成[M-H]-的母離子，所以選擇ESI-作為離子化模式。配制50 μg/L的6種物質(zhì)標準使用液，采用流動注射方式，以10 μL/min流速將樣品進入質(zhì)譜，優(yōu)化CE、DP值，選擇豐度最高、干擾較少的2個子離子，在MRM模式下優(yōu)化碰撞氣壓力(CAD)、噴霧電壓(IS)、去溶劑溫度(TEM)、氣簾氣壓力(CUR)、霧化氣壓力(Gas1)、加熱氣壓力(Gas2)等參數(shù)，使待測物的離子化效率最佳。優(yōu)化的質(zhì)譜條件如“1.3.2”所示。

圖1 6種化合物混合標準溶液(50 μg/L)的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the mix standard solution of six compounds(50 μg/L) 1：BPF;2：BPA;3：TCBPA;4：TBBPA;5：4-n-OP;6：NP

2.2 色譜柱及流動相的選擇

6種待測物為極性、弱極性化合物，實驗分別選擇兩種通用型反相色譜柱Agilent Extend-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)和Waters Acquity UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色譜柱進行分析，流動相分別選擇甲醇-水、乙腈-水按不同比例進行等度洗脫。結(jié)果表明，流動相中有機相的比例低時，6種物質(zhì)均不出峰，有機相比例高時，部分物質(zhì)的色譜峰重疊，因此采用梯度洗脫以使待測物得到有效分離。當甲醇作為有機相時，部分物質(zhì)的色譜峰拖尾嚴重；乙腈作為有機相時，色譜峰拖尾現(xiàn)象得到明顯改善，最終選擇乙腈-水為流動相梯度洗脫。

在相同流動相條件下，6種待測物在兩種色譜柱上均能達到基線分離。由于初始流動相的水相比例較大，T3柱在50%水相條件下性能更穩(wěn)定，且分析時間較短，因此實驗最終選用T3柱進行分離。在“1.3.1”色譜條件下，6種目標化合物混合標準溶液的總離子流色譜圖如圖1所示。

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 固相萃取柱的選擇分別考察了C18柱(Supelclean LC-18)、石墨化碳黑柱(Supelclean Envi-Carb)、親水親脂柱(Waters HLB柱、VARIAN柱)的萃取及回收效果。結(jié)果表明，選用C18柱及VARIAN柱進行固相萃取時，TBBPA的回收率較低，其余物質(zhì)的回收率均在70%～120%之間；選用石墨化碳黑柱時，除BPA外其余物質(zhì)均無回收，且洗脫液難以濃縮；選用HLB柱時，6種物質(zhì)的回收率均能達到70%～120%，且萃取速度較快。因樣品酶解后的體積約為5 mL，實驗最終選用填料規(guī)格為60 mg/3 mL的HLB固相萃取柱。

2.3.2 酶解處理的影響代謝研究表明，酚類化合物在尿液中主要以葡萄糖酸苷和硫酸酯結(jié)合物形式存在，游離形式含量少[13]，因此需對尿液樣品進行酶解處理以獲得游離態(tài)的化合物。對部分尿液樣品初步調(diào)查時發(fā)現(xiàn)尿液中僅檢出BPA，因此采用含有BPA的NIST標準參考物質(zhì)考察添加酶對BPA測定的影響。結(jié)果表明，不添加酶處理NIST標準參考物質(zhì)時，測得BPA的質(zhì)量濃度為0.16 μg/L，經(jīng)酶解處理后測得BPA的質(zhì)量濃度為3.00 μg/L，與標準參考值相符。由于其他5種化合物具有與BPA相似的化學結(jié)構(gòu)，BPA的測定結(jié)果具有代表性，因此確定尿液采用酶解處理。

2.3.3 尿液沉淀的影響采集后的尿樣通常于低溫環(huán)境長期放置，測試前需解凍處理。一般尿樣解凍后為透明或淡黃色液體，但部分尿樣會出現(xiàn)渾濁、沉淀，這些沉淀物主要是結(jié)晶、細胞等?？疾炝嗣附馇斑^濾尿液與不過濾尿液對測定結(jié)果的影響。選取6份有明顯沉淀物的尿樣，將每份尿樣再分成2份，第1份為尿樣原液，第2份離心取上清液，沉淀中加入2 mL水作為第3份樣品，將3份樣品按本方法進行前處理后測定。結(jié)果表明，第1份與第2份樣品均檢出BPA，第3份樣品未檢出。將前2份樣品的BPA檢出值做t檢驗，其中t=2.22，查t界值表，得t0.05/2,5=2.571，P>0.05，結(jié)果無統(tǒng)計學差異，說明尿液是否過濾對測定無影響?；谀蛞哼^濾也未提高過柱速度，所以尿液采取不過濾處理。

2.3.4 淋洗溶劑及用量的選擇尿液基質(zhì)較為復雜，固相萃取時若不淋洗會導致基體干擾，無法對目標物進行準確定量。分別選擇不同比例的甲醇-水和乙腈-水作為淋洗液進行實驗，結(jié)果表明采用甲醇-水淋洗時，分子量較小的BPF易洗脫，回收低，而采用乙腈-水淋洗時結(jié)果較好。進一步采用不同體積和比例的乙腈-水進行淋洗，發(fā)現(xiàn)3 mL 25%乙腈-水的效果最佳，因此選其為淋洗溶劑。

2.3.5 濃縮方式的選擇雙酚類及烷基酚類物質(zhì)在尿液中的濃度較低，因此對洗脫液進行濃縮以滿足實驗要求。選擇氮吹方式對5 mL甲醇洗脫液進行濃縮，比較氮吹近干及完全吹干對待測物的影響。結(jié)果表明，完全吹干會導致待測物損失，難以準確定量。因此，氮吹濃縮時接收管中應(yīng)剩余約50 μL洗脫液，然后進行復溶。

2.3.6 復溶溶劑及用量的選擇由于初始流動相為乙腈-水(50∶50)，為減小溶劑效應(yīng)，選用乙腈-水(50∶50)為復溶溶劑,并考察了復溶溶劑體積(0.5、1 mL)對定量的影響。結(jié)果表明，選用0.5 mL溶劑進行復溶時，能夠提高目標物的靈敏度，并且提高濃縮倍數(shù)不會引起樣品基質(zhì)的干擾。因此，實驗選擇0.5 mL乙腈-水(50∶50)進行復溶。

2.4 實驗空白的考察

雙酚類及烷基酚類物質(zhì)在環(huán)境和許多產(chǎn)品中廣泛存在，空白是該類物質(zhì)測定過程中的關(guān)鍵和難點。空白在某種程度上較全面地反映了實驗環(huán)境的清潔程度、實驗用水和試劑的純度、耗材中雜質(zhì)的影響、器皿的潔凈度、儀器設(shè)備的使用殘留及分析人員的水平和經(jīng)驗。此外，空白的大小及離散程度亦對檢出限、精密度、準確度等方法學指標及樣品測定產(chǎn)生較大影響。本實驗從分析儀器、水和試劑、耗材、實驗殘留等方面對空白進行測定，結(jié)果顯示，空白主要來自于耗材及實驗殘留，尤其是含橡膠成分的耗材空白值較高，因此應(yīng)避免使用此類耗材，宜采用玻璃材質(zhì)的耗材。此外，在每批實驗后，及時清洗儀器、設(shè)備、耗材、實驗環(huán)境等，可有效降低或消除雙酚類及烷基酚類物質(zhì)的殘留。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)評價

在分析過程中由于共洗脫物質(zhì)會對分析物的離子化過程產(chǎn)生抑制或增強作用，從而影響定量分析方法的準確度和精密度，所以需對基質(zhì)效應(yīng)進行評價。根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)(ME)=[(基質(zhì)匹配校準曲線斜率/純?nèi)軇藴是€斜率)-1]×100%進行評估，若|ME|<20%為弱基質(zhì)效應(yīng)，無需采取補償措施；20%≤|ME|≤50%為中等程度基質(zhì)效應(yīng)，|ME|>50%為強基質(zhì)效應(yīng)，均須采取措施補償基質(zhì)效應(yīng)[19-21]。采用不含待測物的人工尿液基質(zhì)，配制基質(zhì)匹配標準工作溶液與溶劑標準溶液，分析測試后進行回歸及計算。由表2可知，6種待測物的|ME|值為2%～13%，為弱基質(zhì)效應(yīng)，故采用溶劑配制標準曲線進行定量測定。在分析中若采用標準曲線定量，會引起NIST質(zhì)控樣定值偏高，主要因為在實驗過程中不可避免地存在來源于耗材、試劑、環(huán)境等的空白干擾。鑒于此，最終選用工作曲線進行定值，防止空白干擾影響準確定量。

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限配制0.5～50 μg/L質(zhì)量濃度范圍的系列標準溶液，在上述色譜條件和質(zhì)譜條件下進行測定。以待測物的定量離子峰面積與內(nèi)標物定量離子峰面積之比為縱坐標，樣品中待測物的質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線。其中，BPF以BPF-D10為內(nèi)標，BPA以BPA-D16為內(nèi)標，TCBPA以TCBPA-13C12為內(nèi)標，TBBPA以TBBPA-D10為內(nèi)標，4-n-OP和NP以NP-13C6為內(nèi)標定量計算。采用空白樣品中添加目標物的方法，以3倍信噪比(S/N)對應(yīng)的質(zhì)量濃度確定檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N)對應(yīng)的質(zhì)量濃度確定定量下限(LOQ)。由表2可知，6種目標化合物在0.5～50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2>0.995，LOD為0.05～0.60 μg/L，LOQ為0.17～2.00 μg/L。

表2 6種待測物的保留時間、線性關(guān)系、檢出限、定量下限及基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Retention times,linear relations,LODs,LOQs and matrix effects of 6 compounds

2.6.2 回收率及相對標準偏差取人工尿樣分為3組，每組6個樣品，向樣品中加入6種待測物混合標準溶液，配制成低、中、高3種濃度水平(2、10、50 μg/L)的加標樣品，采用本方法進行測定，并計算回收率及相對標準偏差。結(jié)果表明，6種待測物的加標回收率為81.4%～112%，相對標準偏差(RSD)為6.8%～30%。在同一天及連續(xù)3 d對處理后的樣品進行測定(n=6)，計算得到6種物質(zhì)的日內(nèi)RSD為4.2%～11%，日間RSD為4.4%～9.7%(表3)。

表3 6種待測物的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of 6 compounds(n=6)

2.7 樣品測定

采用本方法對采集的160份志愿者尿樣進行測定，結(jié)果顯示，BPA的檢出率為93.8%，檢出范圍為0.24～29.54 μg/L，幾何平均值為1.88 μg/L，四分位距IQR為2.52 μg/L，其余目標物均未檢出。

3 結(jié) 論

本研究建立了人體尿液中6種雙酚類及烷基酚類化合物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，并對前處理條件進行了優(yōu)化。美國國家生物監(jiān)測項目采用在線固相萃取/液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定BPA，節(jié)省人力，但分析時間較長，對前處理設(shè)備要求較高。而本方法的前處理設(shè)備普及性較好，分析時間短，BPA的靈敏度高(其檢出限與美國CDC方法相近)，且其他方法指標良好，可用于人群中雙酚類及烷基酚類物質(zhì)內(nèi)暴露含量的檢測，為我國開展人群生物監(jiān)測項目奠定了良好基礎(chǔ)。