黃 婷 蘭 蕙 王琳琳 韓垠超 葉麗平，2△

（錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，1 病理生理學(xué)教研室，2 生物人類學(xué)研究所，錦州 121001）

肺癌中非小型細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）多見，且易轉(zhuǎn)移，是患者死亡的主要原因[1]。研究表明，多種細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1/CCL2）是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞遷移和浸潤的關(guān)鍵趨化因子之一[2]，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤，卵巢癌，前列腺癌等腫瘤組織中過表達(dá)，經(jīng)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular-signal regulated kinase，ERK）、 蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）等多條信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[3-4]。N-鈣黏蛋白（N-cadherin）是上皮-間質(zhì)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）重要標(biāo)志物，可使腫瘤細(xì)胞獲得遷移能力[5]?；|(zhì)金屬蛋白酶-14（matrix metalloproteinase-14，MMP-14）、 基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2），主要參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解和代謝[6]。MCP-1 在NSCLC 中表達(dá)上調(diào)，與侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，但機(jī)制尚不清楚。本研究外源性加入MCP-1，探究MCP-1 是否經(jīng)ERK 通路調(diào)節(jié)肺癌A549 細(xì)胞N-cadherin、MMP-14 及MMP-2 的蛋白表達(dá)及對(duì)其增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的影響，對(duì)臨床上早期診斷、靶點(diǎn)治療及預(yù)后評(píng)估等具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料及分組

人肺癌細(xì)胞株A549 細(xì)胞（本室保存）；1640培養(yǎng)基（美國Gibco）；MCP-1（美國Signalway Antibody）；ERK 通路抑制劑PD98059（APEXIO）、胎牛血清（美國CLARK Bioscience）；Matrigel 基底膠（BD）、Transwell 小室（康寧生物技術(shù)有限公司）；抗p-ERK 和抗t-ERK（Abbkine）；抗N-cadherin、抗 MMP-2、抗 MMP-14 和 抗β-actin抗體（博奧森生物技術(shù)有限公司）；二甲基亞砜（美國Sigma 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將肺癌A549 細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d 更換培養(yǎng)液，所有操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)均選用對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)鋪滿瓶壁70%～80%時(shí)無血清饑餓過夜。

1.3 分組

對(duì)照組，MCP-1組（25、50、75、100 ng/mL），MCP-1組（75 ng/mL）+PD98059組，PD98059組。ERK抑制劑PD98059終濃度為100 μmol/L（提前 30 min孵育）。

1.4 MTT 法

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞為5×105/mL，以每孔100 μL接種到96 孔板中，四周用PBS 填充。5%CO2，37℃孵育至細(xì)胞貼壁，去除培養(yǎng)基；按實(shí)驗(yàn)分組加藥，設(shè)6 個(gè)復(fù)孔；孵育 48 h 后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，去掉培養(yǎng)液。每孔加入150 μL 的DMSO，置37℃搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。

細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值）×100%

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，各組細(xì)胞按5×105個(gè)/孔接種到6 孔板內(nèi)，待細(xì)胞鋪滿皿底后，用200 μL 槍頭垂直劃痕，PBS 洗3 遍。按照實(shí)驗(yàn)分組加藥。每組設(shè)2 個(gè)復(fù)孔。在5%CO2，37℃孵育48 h 后監(jiān)測(cè)劃痕寬度變化并照相，Image J 軟件分析劃痕面積，計(jì)算愈合率。

劃痕愈合率=（原始劃痕面積-48 h 后劃痕面積）/原始劃痕面積×100%

1.6 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)

Matrigel 膠于與1640 培養(yǎng)液按1：9 稀釋，每上室各加入60 μL，置于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，孵育4 h。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化處理，制成細(xì)胞懸液（密度為5×105/mL），每上室100 μL。下室按分組加藥，孵育48 h。去除上孔培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定10 min，用結(jié)晶紫染色，PBS 洗3 次。采用倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.7 免疫印跡檢測(cè)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組加藥后，于冰上收刮不同處理組細(xì)胞，裂解細(xì)胞，采用BCA法定量蛋白后制成樣品后，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，半干轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h 后，分別加入一抗，4℃搖床孵育過夜。次日TBST 洗膜，室溫孵育二抗90 min。用TBST 洗3 次后，將ECL 顯影液均勻涂在PVDF 膜上，置于顯影儀上顯影，Image J 軟件計(jì)算分析蛋白灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上實(shí)驗(yàn)至少重復(fù) 3 次，運(yùn)用SPSS 17.0 軟件分析數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖能力

與對(duì)照組相比，MCP-1 組隨濃度增加明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖（P＜0.05），PD98059 組增殖能力降低（P＜0.05），濃度75 ng/mL 與100 ng/mL MCP-1 組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。MCP-1+PD98059 聯(lián)合處理組細(xì)胞增殖能力低于MCP-1 組（75 ng/mL）（P＜0.05）。

表1 不同濃度MCP-1 作用下細(xì)胞增殖率 與吸光度值（n=6，±s）Tab1 Effect of different concentrations of MCP-1 on cell proliferation rate and OD Value（n=6，±s）

表1 不同濃度MCP-1 作用下細(xì)胞增殖率 與吸光度值（n=6，±s）Tab1 Effect of different concentrations of MCP-1 on cell proliferation rate and OD Value（n=6，±s）

*P＜0.05 vs control；#P＜0.05 vs MCP-1（75 ng/mL）

Absorbance（OD value）Control 100 0.212 0±0.007 MCP-1（25 ng/mL）151.90* 0.308 0±0.008*MCP-1（50 ng/mL）204.40* 0.414 0±0.010*MCP-1（75 ng/mL）290.50* 0.589 0±0.008* MCP-1（100 ng/mL）276.15* 0.575 0±0.008*MCP-1+PD98059 214.18# 0.451 0±0.007#PD98059 84.83* 0.179 0±0.004*Group Cell proliferation rate（%）

2.2 細(xì)胞遷移能力

與對(duì)照組（11.34%±1.24%）相比，MCP-1（75 ng/mL）組，A549 細(xì)胞遷移率提高（51.33%± 4.21%，P＜0.05）；MCP-1 聯(lián) 合PD98059 處 理 組 遷移率（28.33%±5.60%）慢于MCP-1 組（P＜0.05）。與MCP-1+PD98059 組相比，PD98059 組（4.50%± 0.70%）遷移率明顯減慢（P＜0.05）（圖1）。

2.3 細(xì)胞侵襲能力

與對(duì)照組（115.00±4.05）相比，MCP-1組（545.00± 12.70）穿透細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.05）；MCP-1組與MCP-1聯(lián)合PD98059組（272.00±6.55）相比，細(xì)胞侵襲率有所降低（P＜0.05），單用PD9859組細(xì)胞侵襲數(shù)目（51.00±3.00）降低（P＜0.05）（圖2）。

圖1 0 h（A1～D1）和48 h（A2～D2）MCP-1 與PD98059 對(duì)A549 細(xì)胞遷移的影響，普通顯微鏡，×10Fig1 Effect of MCP-1 and PD98059 on the migration of A549 cells after 0 h（A1-D1）and 48 h（A2-D2）treatment，conventional microscopy，×10

2.4 相關(guān)蛋白表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖3），與對(duì)照組相比，加入MCP-1處理后，MMP-14、N-cadherin、MMP-2 及p-ERK 蛋白表達(dá)水平增高（P＜0.05），總ERK 蛋白量不變（P＞0.05）；與MCP-1 組比較，PD98059聯(lián) 合MCP-1 組MMP-14、N-cadherin、MMP-2及p-ERK 蛋白表達(dá)水平下降，單用PD98059 組，MMP-14、N-cadherin、MMP-2 及p-ERK 蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.05）。

3 討論

圖2 MCP-1 和PD98059 對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響，倒置顯微鏡，×10Fig2 Effect of MCP-1 and PD98059 on cell invasion，inverted microscope，×10

圖3 MCP-1 和PD98059 對(duì)N-cadherin、MMP-14、MMP-2、t-ERK、p-ERK 蛋白表達(dá)影響Fig3 Effect of MCP-1 and PD98059 on expression of N-cadherin，MMP-14，MMP-2，t-ERK，and p-ERK protein

MCP-1 的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中有著重要的影響，研究顯示，MCP-1 在乳腺癌中活化Smad3 和p42/44 MAPK 信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移[7]。在前列腺癌中，MCP-1 激活了包括PKCδ、c-Src 和AP-1 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制該途徑特定成分均會(huì)降低MCP-1 對(duì)細(xì)胞侵襲的影響[8]。馬鐘玲等[9]報(bào)道，MCP-1 在NSCLC 組織中的表達(dá)高于其在正常組織表達(dá)，且與腫瘤的分化、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及腫瘤分期有關(guān)，提示MCP-1 與NSCLC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ERK 信號(hào)通路可調(diào)控各種細(xì)胞活動(dòng)過程（如增殖，存活，分化和運(yùn)動(dòng)）等，在人類腫瘤中常被異常激活進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。PD98059 是一種通過作用于其上游激酶而間接抑制ERK1/2 的ERK 抑制劑之一，可阻斷外源性的刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。

MMPs 是參與腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的主要蛋白酶家族，當(dāng)ERK 異?；罨?，可上調(diào)MMP-2、MMP-14 等表達(dá)，使細(xì)胞外基質(zhì)降解加快[11]，MMP-14 高表達(dá)時(shí)可促進(jìn)MMP-2 的活化分泌，誘導(dǎo)家族其他發(fā)揮級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而加速對(duì)基底膜的溶解[12]。Fan 等[5]研究表明，通過抑制ERK 信號(hào)通路，能有效減弱EMT 的發(fā)生。在滑膜肉瘤細(xì)胞中，MMP-14 可誘導(dǎo)EMT增強(qiáng)，使N-cadherin的表達(dá)上調(diào)，提高侵襲能力[13]。

本研究先按照濃度分組，用MTT 實(shí)驗(yàn)篩選出MCP-1 作用于A549 細(xì)胞的最佳濃度75 ng/mL，再結(jié)合ERK 信號(hào)通路抑制劑PD98059，通過MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究MCP-1 對(duì)A549 細(xì)胞作用情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MCP-1 明顯促進(jìn)細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，在應(yīng)用PD98059 作用后，細(xì)胞上述作用減弱，免疫印跡結(jié)果顯示，在MCP-1 的作用下p-ERK、N-cadherin、MMP-14、MMP-2 蛋白表達(dá)水平增加，但總ERK 蛋白表達(dá)量不變。而在加入ERK 抑制劑PD98059 作用后，上述蛋白表達(dá)量下降，進(jìn)一步推測(cè)N-cadherin、MMP-14、MMP-2 為ERK 下 游 靶蛋白。

綜上所述，MCP-1 作用于肺癌A549 細(xì)胞，可能通過磷酸化ERK 信號(hào)通路，增加了ERK 下游N-cadherin、MMP-14、MMP-2 蛋白的表達(dá)，最終促進(jìn)了肺癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)是對(duì)肺癌侵襲轉(zhuǎn)移研究的初步探討，希望能為未來預(yù)防和治療肺癌等疾病提供新的作用靶點(diǎn)。